PLAGIAT

PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

SKRINING AKTIVITAS SITOTOKSIK EKSTRAK ETANOLIK DAUN

SIRIH (Piper betle L.) TERHADAP SEL KANKER KOLON WiDr

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Disusun Oleh :

Gigih Prayoga

NIM : 118114020

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2015
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

SKRINING AKTIVITAS SITOTOKSIK EKSTRAK ETANOLIK DAUN

SIRIH (Piper betle L.) TERHADAP SEL KANKER KOLON WiDr

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Disusun Oleh :

Gigih Prayoga

NIM : 118114020

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2015

i
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

ii
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

iii
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

HALAMAN PERSEMBAHAN

Filipi 4 : 6-7

“Janganlah hendaknya kamu kuatir tentang apapun juga,

tetapi nyatakanlah dalam segala hal keinginanmu kepada Allah

dalam doa dan permohonan dengan ucap syukur. Damai

sejahtera Allah, yang melampaui segala akal, akan

memelihara hati dan pikiranmu dalam Kristus Yesus.”

Trust in the Lord and Do Good

Holy Spirit Our Guide and Comforter

Kupersembahkan Karyaku untuk :

Allah Bapa Di Surga

My Dad Dwi Sulistyo Utomo, Mom Trisnani, Lil sister Kartika

Sahabat

Almamaterku

iv
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

v
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

vi
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

PRAKATA

Syukur bagi Allah Tritunggal karena atas kasih, berkat dan kemurahan-

Nya, Penulis dapat menyelesakan skripsi ini dengan baik. Skripsi ini disusun

untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

program studi Farmasi.

Penulis telah banyak menerima dukungan selama proses perkuliahan,

penelitian dan penyusunan skripsi. Oleh karena itu, Penulis ingin mengucapkan

terima kasih kepada :

1. Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta

2. Ibu Agustina Setiawati, M.Sc, Apt. selaku Dosen Pembimbing, Dosen

Pembimbing Akademik dan Dosen Penguji Skripsi ini serta selaku Kepala

Laboratorium Fakultas Farmasi, atas bimbingan, pengarahan, bantuan,

dukungan, kesabaran, serta masukan kepada penulis dalam penyusunan

dan pelaksanaan skripsi juga ijin yang diberikan sehingga penulis dapat

menggunakan sarana dan prasarana untuk kepentingan skripsi ini.

3. Ibu Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt. selaku Dosen Penguji yang telah

memberikan waktu, masukan, kritik dan saran kepada Penulis.

4. Damiana Sapta Candrasari, M.Sc. selaku Dosen Penguji yang telah

memberikan waktu, masukan, kritik dan saran kepada Penulis.

5. Seluruh Dosen dan Karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma yang telah mengajar, membantu dan membimbing penulis selama

perkuliahan.

vii
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

6. Prof. dr. Supargiyono, Ibu Rumbi, Ibu Juju selaku Supervisor dan Teknisi

Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Umum Universitas Gadjah

Mada Yogyakarta yang telah membimbing dan membantu selama

pelaksanaan penelitian penulis dengan sabar.

7. Bagian Instalasi Patologi Anatomi RSUP Dr. Sardjito Yogyakarta yang

telah membantu dalam penelitian ini.

8. Keluarga terkasih, Papa Dwi Sulistyo Utomo, Mama Trisnani, dan adekku

Kartika Cahaya Jati atas segala doa, kepercayaan, semangat, bantuan, dan

kasih sayang yang tiada henti sehingga penulis dapat menyelesaikan studi

tepat waktu dan membanggakan keluarga.

9. Sahabat dari Tim Skripsi Cancer Buster Handika Immanuel, Tjok Gede

Perdana Wiguna, dan Mery Tri Utami atas kerjasama, persahabatan,

bantuan dan kebersamaan selama proses penyusunan skripsi.

10. Isna, Tiara, Ibunya Tiara, Gabriella, Kak Eva yang telah mendukung

skripsi ini.

11. Teman-teman angkatan 2011 terkhusus Kelas FSM A 2011 dan FST A

2011 atas keceriaan, kebersamaan, dan perjuangan yang tidak akan

terlupakan.

12. Teman-teman Gereja Kerasulan Baru Distrik Yogyakarta atas semangat,

motivasi, dan dukungannya yang membahagiakan.

13. Istiyanti Hapsari, Adhi Priyo Pamungkas, dan Rita Andayani yang

merupakan sahabat dari SMP atas dukungan, motivasi, dan semangat yang

luar biasa.

viii
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

14. Galih, Yosua, dan mas Yudha sebagai sahabat di kontrakan yang telah

memberikan dorongan, semangat, dan penghiburan yang luar biasa.

15. Rekan, kerabat, dan sahabat yang tidak dapat penulis sebutkan satu per

satu atas bantuan, dukungan, dan semangat yang indah.

Penulis menyadari bahwa didalam skripsi ini masih ada

kekurangan. Oleh karena itu, Penulis mengharapkan saran dan kritik yang

membangun dari seluruh pihak. Semoga skripsi ini memberikan manfaat

bagi kita semua.

Yogyakarta, 15 Juni 2015

Penulis

ix
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ............................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING........................................ ii

HALAMAN PENGESAHAN .................................................................. iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................... iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................... v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA

ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS................................... vi

PRAKATA .............................................................................................. vii

DAFTAR ISI ........................................................................................... x

DAFTAR TABEL ................................................................................... xiii

DAFTAR GAMBAR ............................................................................... xiv

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................ xv

INTISARI ................................................................................................ xvi

ABSTRACT .............................................................................................. xvii

BAB I. PENDAHULUAN ....................................................................... 1

A. Latar Belakang .................................................................................... 1

B. Perumusan masalah ............................................................................. 3

C. Keaslian penelitian .............................................................................. 4

D. Manfaat Penelitian .............................................................................. 5

E. Tujuan Penelitian ................................................................................. 5

BAB II. PENELAHAAN PUSTAKA ...................................................... 6

A. Karsinogenesis .................................................................................... 6

B. Kanker kolon ....................................................................................... 8

x
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

C. Sel Kanker Kolon WiDr ...................................................................... 9

D. Apoptosis dan Nekrosis ....................................................................... 10

E. Siklooksigenase 2 (COX-2) ................................................................. 13

F. Tanaman Sirih Hijau ........................................................................... 14

1. Deskripsi tanaman ......................................................................... 14

2. Klasifikasi tanaman ....................................................................... 15

3. Kandungan fitokimia ..................................................................... 16

G. Uji sitotoksik dengan metode MTT ..................................................... 16

H. Uji Apoptosis dengan Metode Double Staining ................................... 18

I. Uji Imunositokimia .............................................................................. 19

J. Landasan Teori.................................................................................... 20

K. Hipotesis ............................................................................................. 21

BAB III. METODE PENELITIAN .......................................................... 22

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ........................................................... 22

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ....................................... 22

1. Variabel utama .............................................................................. 22

2. Variabel pengacau ......................................................................... 22

3. Definisi operasional ...................................................................... 23

C. Bahan Penelitian.................................................................................. 24

D. Alat Penelitian..................................................................................... 24

E. Tata Cara Penelitian............................................................................. 25

1. Determinasi tanaman sirih. ........................................................... 25

2. Pembuatan Simplisia .................................................................... 25

3. Ekstrasi daun sirih. ....................................................................... 25

xi
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

4. Uji Sitotoksik ekstraksi daun sirih dengan metode MTT. .............. 26

5. Uji Apoptosis dengan metode Double Staining............................. 28

6. Pengamatan Ekspresi COX-2 dengan metode imunositokimia ...... 29

F. Tata Cara Analisis Hasil...................................................................... 31

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................. 34

A. Determinasi Tanaman dan Penyiapan Ekstrak ..................................... 34

B. Uji Sitotoksik Ekstrak Etanolik Daun Sirih Terhadap

Sel Kanker WiDr………… ................................................................. 35

C. Uji Apoptosis Ekstrak Etanolik Daun Sirih denngan Metode Double

Staining ............................................................................................. 40

D. Uji Penekanan Ekspresi COX-2 Sirih Hujau dengan Metode

Imunositokimia ................................................................................. 43

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN................................................. 48

A. Kesimpulan ....................................................................................... 48

B. Saran ................................................................................................. 48

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................ 49

LAMPIRAN .......................................................................................... 56

xii
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

DAFTAR TABEL

Tabel I. Distribusi Sel WiDr pada uji apoptosis dengan metode double
staining .................................................................................. 42

Tabel II. Jumlah rata-rata sel sel yang mengekspresikan COX-2 tiap
perlakuan……………………………… ................................. 45

Tabel III. Hasil uji statistic t-test berpasangan ekspresi COX-2 antara
ekstrak etanolik daun sirih hijau dan control sel pada uji
imunositokimia ……………………………… ....................... 46

xiii
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Bagan karsinogenesis.............................................................. 8

Gambar 2. Perbedaan apoptosis dan nekrosis ........................................... 13

Gambar 3. Tanaman sirih ......................................................................... 14

Gambar 4. Reaksi MTT menjadi formazan ............................................... 17

Gambar 5. Kurva hubungan viabilitas sel dengan konsentrasi ekstrak

etanolik daun sirih ................................................................... 36

Gambar 6. Efek sittotoksik ekstra daun sirih ............................................ 38

Gambar 7. Hasil uji double staining ekstrak daun sirih ............................. 42

Gambar 8. Hasil imunositokimia sel kanker kolon WiDr ......................... 44

xiv
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Viabilitas sel kanker kolon WiDr dengan perlakuan ekstrak

Etanolik daun sirih .................................................................. 57

Lampiran 2. Dokumentasi uji sitotoksik dengan metode MTT.................. 58

Lampiran 3. Dokumentasi uji double staining .......................................... 59

Lampiran 4. Dokumentasi uji imunositokimia .......................................... 60

Lampiran 5. Hasil analisis statistik uji double staining dan

imunositokimia dengan Program Microsoft Excel 2007 .......... 62

Lampiran 6. Surat keterangan determinasi tanaman sirih .......................... 82

xv
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

INTISARI
Tanaman sirih telah terbukti dapat menghambat pertumbuhan sel kanker.
Uji aktivitas senyawa yang terkandung pada daun sirih sebagai antikanker telah
banyak dilakukan, tetapi belum ada penelitian mengenai aktivitas antikanker daun
sirih pada sel kanker kolon. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas
antikanker dari ekstrak etanol daun sirih (Piper betle L.) terhadap sel kanker
kolon WiDr dan melihat potensinya dalam menghambat protein siklooksigenase
pada kanker kolon.
Efek antikanker dari ekstrak etanol daun sirih diketahui dengan metode 3-
[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazolium bromida (MTT) pada kanker kolon
WiDr dan dihitung nilai IC50. Uji induksi apoptosis dilakukan dengan metode
double staining menggunakan etidium bromida-akridin oranye. Selanjutnya,
mekanisme molekuler antikanker ekstrak etanol daun sirih diketahui dengan uji
ekspresi siklooksigenase menggunakan metode imunositokimia.
Ekstrak etanol daun sirih mempunyai aktivitas sitotoksik dan menginduksi
apoptosis dengan nilai IC50 794,23 µg/mL yang dihitung menggunakan regresi
linear Microsoft Excel 2007. Hasil Imunositokimia menunjukkan bahwa ekstrak
etanol daun sirih menekan ekspresi protein siklooksigenase.
Kata kunci : daun Sirih hijau, sel kanker kolon WiDr, siklooksigenase.

xvi
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

Abstract

Piper betle plant has been proven to inhibit the growth of cancer cells.
Activity test of the compounds contained in Piper betle leaf as anticancer has been
done a lot, but there has not been research about the anticancer activity of Piper
betle leaf extract in colon cancer cells. This study aims to determine the anticancer
activity of the ethanol extract of Piper betle against WiDr colon cancer cells and
to see the potential in inhibiting cyclooxygenase protein in colon cancer.
Anticancer effects of Piper betle leaf etanol extract was known by the
method of 3-[4,5-dimetiltiazol-2-yl]-2.5 diphenyl tetrazolium bromide (MTT) on
WiDr colon cancer and IC50 value was calculated. Apoptosis induction test was
conducted using a double staining method with ethidium bromide-acridine orange.
Furthermore, the molecular mechanism of anticancer Piper betle leaf etanol
extract was known with the expression test of cyclooxygenase using
immunocytochemistry method.
Piper betle leaf extract has cytotoxic activity and induces apoptosis with
IC50 value is 794.23 mg / mL, calculated using linear regression Microsoft Excel
2007. The result of immunocytochemistry shows that the ethanol extract of Piper
betle leaf suppresses expression of cyclooxygenase protein.
Key words: Piper betle leaf, WiDr colon cancer cells, cyclooxygenase.

xvii
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Data statistik WHO (2012) menyebutkan bahwa 8,2 juta kematian di

dunia diakibatkan oleh penyakit kanker. Kasus kanker kolon menempati urutan

ketiga sebagai jenis kanker yang paling sering diderita. Terdapat lebih dari 1,3

juta kasus kanker kolon dengan 694.000 kematian pada tahun 2012. Kasus kanker

kolon terjadi pada pria sebanyak 746.000 kasus (10,0% dari total kasus kanker

kolon) dan pada wanita sebanyak 614.000 kasus (9,2% dari total kasus kanker

kolon) di dunia. Angka insidensi kanker kolon terus meningkat seiring dengan

pertambahan penduduk baik di negara berkembang maupun negara maju.

Penatalaksanaan kanker dilakukan dengan tujuan untuk mengangkat

jaringan kanker terlokalisasi (pembedahan). Pembedahan harus diikuti dengan

kemoterapi atau penyinaran dengan sinar radio aktif sebagai upaya membunuh sel

kanker untuk mengatasi kemungkinan metastasis, namun pada sel kanker darah

dan pada sel kanker yang telah bermetastasis tindakan pembedahan tersebut tidak

dapat dilakukan (King, 2000). Target dari obat-obat kemoterapi yang telah

dikembangkan diarahkan pada pemicuan apoptosis (Lowe dan Lin, 2000).

Non steoridal anti-inflammatory drugs (NSAID) dapat menghambat

metabolit asam arakidonat yang menyebabkan penurunan risiko kanker kolon

(Fournier, 2000). Celecoxib adalah obat non steoridal anti-inflammatory drugs

(NSAID). Celecoxib digunakan untuk mengobati rasa sakit atau peradangan

1
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
2

seperti, arthritis, ankylosing spondylitis, dan nyeri haid. Celecoxib juga digunakan

dalam pengobatan polip di usus besar. Celecoxib memiliki mekanisme kerja

menghambat sintesis prostaglandin dengan menghambat cyclooxygenase-2 (COX-

2). Celecoxib memiliki efek samping seperti, pharingtis, sinusitis, rinitis,

insomnia, aggravated hypertension, hypertension, angina pectoris, coronary

artery disorder, myocardial infarction, heart failure, palpitations, arrhythmia,

kardiotoksisitas, dan menyebabkan resistensi obat sehingga penggunaanya untuk

terapi kanker menjadi terbatas (Pfizer, 2014).

Cyclooxygenase-2 (COX-2) merupakan salah satu target molekuler

spesifik pada kanker kolon WiDr. Sel kanker kolon WiDr mengekspresikan COX-

2 yang tinggi. Penelitian Brown dan Dubois (2005), membuktikan adanya

peningkatan ekspresi COX-2 pada 85% pasien kanker kolorektal dan pada 50%

pasien adenoma kolorektal. Cyclooxygenase-2 (COX-2) bertanggung jawab

terhadap perubahan asam arakidonat menjadi prostaglandin E2. Prostaglandin E2

dapat menghambat apoptosis pada sel kanker kolon WiDr. Ekspresi COX-2

disebabkan oleh faktor-faktor pertumbuhan seperti epidermal growth factor

(EGF) atau faktor α pertumbuhan tumor dalam sistem sel (Palozza, 2005).

Salah satu bahan alam yang potensial dikembangkan sebagai agen

kemoterapi adalah sirih (Piper betle L.). Sirih merupakan salah satu tanaman obat

yang banyak digunakan di Asia Tenggara (Moeljanto dan Mulyono, 2003).

Berdasarkan hasil uji fitokimia, ekstrak etanol daun sirih mengandung senyawa

tanin, antrakuinon, flavonoid, alkaloid, terpenoid, dan saponin (Kumari dan Rao,

2014). Sirih berpotensi memiliki aktivitas sitotoksik karena mengandung senyawa

PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
3

flavonoid, antrakuinon, dan alkaloid yang dikenal memiliki aktivitas antikanker

(Hasballah, 2005; Jusril, dkk., 2003; Astuti, dkk., 2005). Ekstrak etanol daun sirih

mempunyai efek antikanker dengan nilai IC50 sebesar 24,37 µg/mL terhadap sel

kanker kolon HT-29 (Kangralkan dan Kulkarni, 2013).

Penelitian daun sirih sebagai antikanker kolon WiDr belum pernah

dilakukan sehingga perlu dilakukan skrining awal kemampuan sitotoksik dari

daun sirih hijau pada sel kanker kolon WiDr (model sel kanker yang

mengekspresikan COX-2 tinggi). Metode ekstraksi yang digunakan dalam

penelitian ini adalah maserasi dengan menggunakan pelarut etanol yang bersifat

polar untuk mendapatkan senyawa flavonoid dalam ekstrak etanol daun sirih.

Pengujian sitotoksisitas ekstrak etanol daun sirih pada kultur sel WiDr

menggunakan metode MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium

bromida]. Untuk mengetahui jalur kematian sel secara apoptosis atau nekrosis,

dilakukan uji apoptosis menggunakan metode double staining. Setelah itu,

dilakukan uji imunositotokimia yang digunakan untuk mendeteksi ekspresi

protein COX-2 pada sel kanker WiDr.

B. Rumusan Masalah

1. Apakah ekstrak etanol daun sirih mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap sel

kanker kolon WiDr dan berapa nilai IC50 ekstrak etanol daun sirih terhadap sel

kanker kolon WiDr?

PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
4

2. Apakah ekstrak etanol daun sirih menginduksi apoptosis sel kanker kolon

WiDr?

3. Apakah aktivitas antikanker ekstrak etanol daun sirih diperantarai oleh

penghambatan ekspresi COX-2?

C. Keaslian Penelitian

Penelitian terkait daun sirih hijau yang dilakukan oleh Paranjpe, dkk.,

(2013) melaporkan bahwa ekstrak metanol daun sirih memiliki potensi sebagai

antikanker prostat. Penelitian yang dilakukan oleh Widowati, dkk. (2013)

melaporkan bahwa ekstrak etanol daun sirih dapat digunakan sebagai anti kanker

serviks. Ekstrak etanol daun sirih memiliki aktivitas antikanker dengan

menghambat proliferasi sel. Pada penelitian tersebut menjelaskan bahwa ekstrak

daun sirih memicu terjadinya apoptosis.

Arya Srisadono meneliti tentang skrining awal ekstrak etanol daun sirih

sebagai antikanker dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BLT). Pemberian

ekstrak etanol daun sirih bersifat sitotoksik terhadap larva Artemia salina Leach

yang ditunjukkan dengan harga LC50 < 1000 µg/mL, sehingga membuktikan

adanya aktivitas antikanker dari ekstrak etanol daun sirih menurut metode BLT.

Sejauh pengamatan peneliti, penelitian tentang efek sitotoksisitas ekstrak etanolik

daun sirih terhadap sel kanker kolon WiDr belum pernah dilakukan.
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
5

D. Manfaat Penelitian

1. Manfaat Teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah yang

berguna mengenai efek sitotoksik ekstrak etanol daun sirih pada sel WiDr

untuk penunjang dalam penelitian penemuan obat kanker kedepannya.

2. Manfaat Praktis

Penelitian ini diharapkan mampu memberikan informasi kepada

masyarakat dan peneliti tentang potensi daun sirih sebagai alternatif bahan obat

anti kanker kolon.

E. Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi sitotoksik serta

mekanisme molekuler ekstrak daun sirih terhadap sel kanker kolon WiDr dan

dijadikan dasar ilmiah untuk mengkaji lebih jauh tentang mekanisme anti kanker

daun sirih.
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Karsinogenesis

Karsinogenesis merupakan serangkaian proses berkembangnya kanker

melalui mekanisme multi tahap yang menunjukkan perubahan genetik dan

menyebabkan transformasi progresif sel normal menjadi malignan (ganas)

(Hanahan dan Weinberg, 2000). Karsinogenesis melibatkan inisiasi, promosi,

progresi, dan metastasis. Inisiasi merupakan perubahan spesifik pada DNA sel

target yang menyebabkan proliferasi abnormal sebuah sel. Sel yang mengalami

inisiasi dapat kembali ke tingkat normal secara spontan, tetapi pada tingkat lebih

lanjut dapat menjadi ganas. Promosi merupakan tingkat lanjutan dari tahap

inisiasi. Sel-sel mengalami pertumbuhan yang cepat dan berubah menjadi tumor

jinak. Tahap promosi berlangsung lama, bisa lebih dari sepuluh tahun. Tahap

progresi menghasilkan klon baru sel-sel tumor yang memiliki aktivitas proliferasi,

bersifat invasif, dan potensi metastatiknya meningkat. Metastasis melibatkan

beberapa tahap yang berbeda, termasuk memisahnya sel kanker dari tumor primer,

masuk ke dalam sirkulasi dan melekat pada permukaan jaringan baru (David dan

Shivdasani, 2001). Sel kanker mampu menyerang jaringan lain, merusak jaringan

tersebut dan tumbuh subur diatas jaringan lain (metastasis). Semakin besar

jangkauan metastasis tumor, kanker semakin sulit untuk disembuhkan. Kanker

pada stadium metastasis merupakan penyebab 90% kematian penderita kanker

(Hanahan dan Weinberg, 2000).

6
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
7

Kanker memiliki kemampuan berproliferasi akibat pengaktifan

onkogen dengan bantuan promotor walaupun promotor tidak bersifat tumorigenik

(Kumar, dkk., 2007). Sel kanker dapat memproduksi faktor pertumbuhan sendiri

sehingga tidak bergantung pada rangsangan sinyal pertumbuhan dari luar untuk

melakukan proliferasi (Hanahan dan Weinberg, 2000). Kerusakan atau kesalahan

rantai DNA sebagian besar dapat diidentifikasi dan diperbaiki oleh enzim

pengoreksi (proof reading). Enzim pengoreksi memberikan sinyal kepada siklus

sel untuk menghentikan perbaikan sel, jika kesalahan tidak dapat diperbaiki, sel

secara normal akan menghancurkan diri sendiri (self-destruct) (David dan

Shivdasani, 2001).

Sel kanker tidak mengenal program kematian sel yaitu apoptosis.

Protein p53 mampu mencegah replikasi dari DNA yang rusak pada sel normal dan

mendorong penghancuran sendiri dari sel yang mengandung DNA yang tidak

normal. Peristiwa ini disebut apoptosis. Sel kanker akan terus hidup meski

seharusnya mati (immortal). Mutasi gen p53 menyebabkan proliferasi sel yang

tinggi (Hanahan dan Weinberg, 2000).

Sel kanker dapat menembus membran basal dan matriks ekstraselular

kemudian menembus sirkulasi limfatik dan darah. Sel yang bermetastasis

kemudian berinvasi melalui sistem sirkulasi dan akhirnya menemukan lokasi baru

dan berproliferasi membentuk tumor sekunder. Sel kanker dapat membentuk

pembuluh darah baru (neoangiogenesis) untuk mencukupi kebutuhan pangan

dirinya sendiri, pembuluh darah baru ini dapat mengganggu kestabilan jaringan

tempat sel kanker tumbuh (Hanahan dan Weinberg, 2000).

PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
8

Agen perusak DNA Sel Normal

Perbaikan DNA

Kerusakan DNA

Mutasi herediter di:

Gen-gen yang Kegagalan perbaikan DNA

mempengaruhi
perbaikan DNA
- Gen-gen yang Mutasi di genom sel
mempengaruhi somatik
pertumbuhan sel
atau apoptosis

Pengaktifan proto onkogen yang Inaktivasi gen penekan Perubahan di gen yang
mendorong pertumbuhan tumor mengendalikan apoptosis

Proliferasi sel tak terkendali Penurunan Apoptosis

Ekspansi klonal

Angiogenesis
Mutasi tambahan
Lolos dari imunitas

Progresi tumor

Invasi dan matastasis Neoplasma ganas

Gambar 1. Bagan karsinogenesis (Kumar, dkk., 2005).

B. Kanker kolon

Kanker kolon merupakan kanker yang terjadi di daerah kolon (usus

besar) (Khomsan, 2009). Kanker kolon berawal dari polip adenomatus. Polip ini
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
9

tumbuh dari epitelium yang mengalami displasia proliferatif (Price, 2003) yang

disebabkan oleh mutasi gen adenomatus polyposis coli (APC) pada sel epitel

tunggal (Allen, 1995). Aktivitas proliferasi sel yang berlebih pada sel yang

termutasi menyebabkan sel bertansformasi menjadi sel kanker. Kanker kolon

dapat bermetastasis melalui beberapa jalur yaitu invasi langsung dari mukosa ke

peritoneum melalui pembuluh darah dan melalui pembuluh limfe (King, 2000).

Kanker kolon terjadi seperti karsinogenesis pada umumnya. Gen yang

terlibat dalam karsinogenesis kanker kolon digolongkan menjadi 2 tipe. Tipe

pertama yaitu gen penyandi (APC, DCC, dan K-ras) yang berperan dalam

transduksi sinyal saat replikasi sel. Gen tipe kedua yaitu p53, hMSH2, hMLH1,

hPMS1, dan hPMS2 yang merupakan tumor supressor gene, berperan dalam

perbaikan DNA saat terjadi kesalahan dalam replikasi (Calvert and Frucht, 2002).

Pada saat sintesis DNA, tumor supressor gene seperti hMSH2, hMLH1, hPMS1,

dan hPMS2 memiliki peran penting dalam mekanisme proof reading sehingga

akan menekan proses terjadinya mutasi. Protein p53 berfungsi dalam

menghentikan siklus sel ketika terjadi kerusakan DNA sehingga mekanisme

perbaikan DNA dapat berjalan optimal. Selain itu, jika perbaikan tidak berhasil

diatasi, p53 akan memacu apoptosis (Zekri, dkk., 2005).

C. Sel Kanker Kolon WiDr

Kultur sel kanker kolon WiDr merupakan sel adenokarsinoma kolon dari

manusia. Sel ini menghasilkan Carcino Embrionik Antigen (CEA), Colon Spesific

Antigen (CSA), Transforming growth factor beta, keratin, epidermal growth

PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
10

factor (EGF) receptor, dan p53 antigen expression (ATCC, 2014). Apoptosis

pada sel WiDr dapat terjadi melalui jalur independen p53, di antaranya melalui

aktivasi p73 (Levrero, dkk., 2000). Sel WiDr memiliki kromosom triploid serta

memproduksi antigen karsinoembrionik dan memerlukan rentang waktu sekitar 15

jam untuk dapat menyelesaikan 1 daur sel. Salah satu karakteristik dari sel WiDr

ini adalah ekspresi sikolooksigenase-2 (COX-2) yang tinggi yang memacu

proliferasi sel WiDr (Palozza, dkk., 2005).

Kultur sel ini dapat digunakan dalam berbagai penelitian, seperti

penelitian karsinogenisitas, agen anti tumor, dan aktivitas antitumor senyawa-

senyawa baru. Sel ini memiliki platting efficiency tinggi, mengekspresikan

biomarker CEA dan memiliki doubling time yang singkat bila dibandingkan

dengan kultur sel kanker kolon lainnya (Palozza, dkk, 2005).

D. Apoptosis dan Nekrosis

Kematian sel merupakan suatu proses normal yang memiliki dua fungsi

yaitu perbaikan jaringan dan pelepasan sel rusak yang mungkin membahayakan

tubuh. Proses kematian sel terdiri dari dua macam yaitu nekrosis dan apoptosis

(Gambar 2) (Sudiana, 2008). Apoptosis merupakan proses bunuh diri suatu sel

secara terprogram yang penting dalam pengaturan homeostasis sehingga terjadi

keseimbangan jumlah sel melalui eliminasi sel yang rusak. Ciri-ciri morfologi

terjadinya apoptosis adalah terjadinya pengkerutan sel, penonjolan membran,

kondensasi kromatin, dan fragmentasi inti sel (Lowe dan Lin, 2000).
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
11

Apoptosis terjadi akibat aktivasi suatu protease yang mengandung sistein

pada sisi aktifnya dan memotong protein targetnya pada titik spesifik asam

aspartat, protein ini disebut caspase (Alberts, dkk., 2004). Caspase memiliki target

intraseluler yang spesifik seperti protein dari selaput inti, DNA, dan sitoskeleton.

Pemecahan terhadap protein tersebut mengakibatkan terjadinya kematian sel

(Lodish, dkk., 2001). Caspase terdapat dalam setiap sel dalam bentuk prekursor

yang biasanya diaktifkan oleh caspase lain dan kemudian menghasilkan suatu

proteolisis caspase secara berurutan (Alberts, dkk., 2004).

Dua jalur utama pada proses apoptosis, yaitu jalur intrinsik (jalur

mitokondria) dan jalur ekstrinsik (jalur reseptor kematian). Sinyal dari protein

Bcl-2 seperti Bax menginisiasi jalur intrinsik yang memicu pelepasan sitokrom c

oleh mitokondria. Sitokrom c mengikat Apaf-1, caspase 9 dan ATP membentuk

apoptosom. Apoptosom mengaktifkan caspase 3 yang mengakibatkan terjadinya

apoptosis. Selain melepaskan sitokrom c, mitokondria juga melepaskan faktor

penginduksi apoptosis (AIF) yang memudahkan pemecahan DNA dan protein

Smac/Diablo yang menghambat Inhibitor of Apoptosis (IAP). Jalur ekstrinsik

diinisiasi oleh pengikatan death activators (seperti FasL, TNF) pada death

receptors transmembran. Pengikatan ini menyebabkan terjadinya interaksi dengan

protein adaptor di sitoplasma yaitu fas-associated protein with death domain

(FADD) dan procaspase 8. Proscaspase 8 berubah menjadi caspase 8. Aktivasi

caspase 8 sama seperti aktivasi caspase 9 pada jalur intrinsik akan menyebabkan

pengaktivan caspase efektor seperti caspase 3 dan terjadi apoptosis (Elmore,

2007).
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
12

Nekrosis merupakan kematian sel disebabkan oleh adanya kerusakan

pada sistem membran. Kerusakan membran ini disebabkan adanya aktivitas suatu

enzim lisozim. Aktivitas enzim lisozim dapat terjadi karena adanya kerusakan

sistem membran oleh suatu faktor tertentu yang mengakibatkan membran

pembungkus enzim lisozim tersebut mengalami kebocoran. Kebocoran tersebut

mengakibatkan lisozim tumpah ke sitosol dan akhirnya mencerna protein-protein

yang berada pada sitosol maupun protein-protein penyusun sistem membran dari

sel tersebut (Sudiana, 2008).

Nekrosis sel dicirikan dengan adanya pembengkakan dan ruptur organel

internal yang kebanyakan mengenai mitokondria, dan stimulasi respons

peradangan. Salah satu faktor yang menyebabkan kematian sel secara nekrosis

adalah hipoksia berkepanjangan, infeksi yang menghasilkan toksin dan radikal

bebas, dan kerusakan integritas membran sampai pada pecahnya sel. Respon imun

dan peradangan sering dirangsang oleh nekrosis yang menyebabkan cedera lebih

lanjut dan kematian sel sekitar. Nekrosis sel dapat menyebar di seluruh tubuh

tanpa menimbulkan kematian pada individu. Sel yang mengalami nekrosis akan

mengeluarkan seluruh isi sel termasuk mediator-mediator inflamasi sehingga

menyebabkan reaksi inflamasi. Inflamasi yang berlebih akan menyebabkan respon

nyeri dan dalam jangka panjang dapat menimbulkan terjadinya autoimun sehingga

kematian sel secara apoptosis dalam terapi pengobatan kanker lebih diharapkan

(Corwin, 2008).
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
13

Gambar 2. Perbedaan apoptosis dan nekrosis (Van Cruchten, dkk., 2002)

E. Siklooksigenase 2 (COX-2)

Enzim siklooksigenase merupakan enzim yang mengkatalisis

pembentukan prostaglandin, suatu mediator inflamasi, produk metabolisme asam

arakidonat. Setelah dilepaskan dari membran fosfolipid, asam arakhidonat

kemudian dikonversikan oleh COX menjadi PGG2, kemudian menjadi PGH2.

PGH2 kemudian dikonversi menjadi beberapa prostaglandin, termasuk PGE2,

PGD2, PGF2, PGI2, dan thromboxane A2, melalui aktivitas spesifik

prostaglandin sintase (Sinicrope dan Gills, 2004). Ekspresi COX-2 meningkat

dalam jaringan kanker kolon sehingga meningkatkan sintesis prostaglandin E2

(PGE2) (Breyer, Bagdassarian, dan Breyer, 2001). PGE2 dapat menghambat

apoptosis pada sel kanker kolon manusia (Leone, 2007).

COX-2 manusia memiliki tempat pengikatan dengan berbagai faktor

transkripsi, misalnya pada cAMP, Interleukin-6 (IL-6), dan nuclear factor kappa

(NF-KB). COX-2 terinduksi dengan cepat sebagai respon terhadap faktor

pertumbuhan, promoter tumor, hormon, endotoksin bakterial, dan sitokin. COX-2

PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
14

dikenal sebagai inducible isoenzym (Zhao, dkk., 2009). Enzim ini mengalami

peningkatan pada tempat-tempat inflamasi dan mengalami ekspresi berlebih pada

neoplasma (Sinicrope dan Gill, 2004). COX-2 diekspresikan secara terus menerus

(konstitutif) di dalam otak dan ginjal serta diinduksi pada tempat yang mengalami

inflamasi (Rajakariar, 2006).

F. Tanaman Sirih

1. Deskripsi tanaman

Gambar 3. Tanaman sirih

Sirih adalah salah satu tanaman obat yang telah banyak digunakan

sebagai obat di Asia Tenggara (Moeljanto dan Mulyono, 2003). Sirih memiliki

nama daerah yang berbeda-beda, yaitu Sanskrit: nagavallari, nagini,

nagavallika, tambool, saptashira, mukhbhushan, varnalata; Malaysia: sirih,

sirih melayu, sirih cina, sirih hudang, sirih carang, sirih kerakap; Inggris: betel,

betel pepper, betel-vine; Tamil: vetrilai; Telugu: nagballi, tamalpaku; Hindi:

Pan; Gujurati: nagarbael; Marathi: nagbael; Bengali: pan; Arab: tambol,

tambool; Semang: serasa, cabe; Jakun: kerekap, kenayek; Sakai: jerak; Jawa:

sirih, suruh, bodeh; Thailand: Pelu (Pradan, dkk., 2013). Bagian dari tanaman

sirih yang dimanfaatkan sebagai obat adalah daunnya. Ekstrak daun sirih
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
15

memiliki aktivitas seperti antidiabetes, antiulcer, agregasi antiplatelet,

antifertilitas, kardiotonik, antitumor, antimutagenik, depresi pernapasan, dan

anthelmentik (Vikash, dkk., 2012).

Sirih hijau dengan nama ilmiah Piper betle L. merupakan tanaman

yang tumbuh merambat. Tingginya mencapai 5-15 m, tergantung pertumbuhan

dan tempat rambatnya. Batangnya berwarna hijau kecoklatan, berbentuk bulat,

lunak, beruas-ruas, dan beralur-alur. Sirih memiliki daun yang tunggal dan

letaknya berseling dengan bentuk bervariasi mulai dari bundar sampai oval,

ujung daun runcing, pangkal daun berbentuk jantung atau agak bundar

asimetris. Daun sirih memiliki warna yang bervariasi yaitu kuning, hijau

sampai hijau tua dan berbau aromatis (Pradan, dkk., 2013).

2. Klasifikasi tanaman

Kerajaan : Plantae

Kelas : Magnoliopsida

Ordo : Piperales

Famili : Piperaceae

Genus : Piper

Spesies : Piper betle Linn

(Pradan, dkk., 2013).

PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
16

3. Kandungan fitokimia

Daun sirih mengandung minyak atsiri yang terdiri dari betlephenol,

kavikol, seskuiterpen, hidroksikavikol, cavibetol, estragol, eugenol, dan

karvakrol. Minyak atsiri merupakan minyak yang mudah menguap dan

mengandung aroma atau wangi yang khas. Minyak atsiri dari daun sirih

mengandung 30% fenol dan beberapa derivatnya (Pradan, dkk., 2013).

Hasil uji fitokimia ekstrak etanol daun sirih mengandung senyawa

tanin, antrakuinon, flavonoid, alkaloid, terpenoid, dan saponin (Kumari dan

Rao, 2014). Sirih berpotensi memiliki aktivitas sitotoksik karena mengandung

senyawa flavonoid, antrakuinon, dan alkaloid yang dikenal memiliki aktivitas

antikanker (Hasballah, 2005; Jusril, dkk., 2003; Astuti, dkk., 2005).

G. Uji Sitotoksik dengan Metode 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difenil

tetrazolium bromida (MTT)

Uji sitotoksik adalah salah satu pengembangan metode untuk

memprediksi keberadaan senyawa yang bersifat toksik pada sel yang merupakan

syarat mutlak untuk obat-obat antikanker (Kurnijasanti, 2008). Dua metode umum

yang digunakan untuk uji sitotoksik adalah metode perhitungan langsung (direct

counting) dengan menggunakan trypan blue dan metode MTT. Uji MTT

merupakan salah satu metode yang digunakan dalam uji sitotoksik (Doyle dan

Griffith, 2000). Keuntungan uji MTT adalah terbentuknya formazan larut air yang

absorbansinya dapat diukur secara periodik saat tahap awal inkubasi (Riss, 2013).
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
17

Reduksi MTT menjadi garam formazan terjadi jika enzim reduktase

dalam mitokondria dalam keadaan aktif. Prinsip metode MTT adalah reaksi

reduksi seluler yang didasarkan pada pemecahan garam tetrazolium berwarna

kuning yang larut dalam air menjadi kristal formazan berwarna biru keunguan

yang tidak larut dalam air. Reduksi dalam sel melibatkan reaksi enzimatik dengan

NADH atau NADPH yang dihasilkan oleh sel hidup sehingga menghasilkan

endapan yang tidak larut. Enzim suksinat dehidrogenase pada mitokondria sel

hidup mampu memecah MTT menjadi kristal formazan. Garam tetrazolium

menerima elektron dari substrat yang teroksidasi atau enzim yang sesuai, seperti

NADH dan NADPH. MTT tereduksi pada bagian ubikuinon, sitokrom b, dan c

pada bagian transpor elektron mitokondria dan merupakan hasil dari aktivitas

enzim suksinat dehidrogenase. Reaksi tersebut melibatkan piridin nukleotida

kofaktor NADH dan NADPH yang hanya dikatalisis oleh sel hidup, sehingga

jumlah formazan yang terbentuk sebanding dengan jumlah sel yang

hidup.(Biranti,2009).

Gambar 4. Reaksi MTT menjadi Formazan (Kronek, Paulovičová,

Paulovičová, Kroneková danLuston, 2013)
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
18

H. Uji Apoptosis dengan Metode Double Staining

Double-staining merupakan metode yang digunakan untuk uji apoptosis

menggunakan akridin oranye dan etidium bromida (AO/EB) untuk

memvisualisasikan perubahan warna pada nukleus dan bentuk sel sebagai

karekteristik dari apoptosis. Metode ini berdasarkan pada prinsip bahwa akridin

oranye masuk ke dalam sel hidup dan sel mati, sedangkan etidium bromida hanya

dapat menembus membran sel yang mengalami disintegrasi. Sel hidup berwarna

hijau jika dibaca dibawah mikrokop floresens dan sel mati akan berwarna merah

(Kavanagh, 2007).

Sel yang mengalami apoptosis dan membran blebbing, etidium bromida

dapat masuk ke dalam sel dan memberikan warna oranye. Sel yang mengalami

early apoptosis akan mengalami kondensasi atau fragmentasi kromatin dan

memiliki nukleus berwarna hijau dan ada sedikit warna oranye. Sel yang

mengalami late apoptosis memiliki kromatin berwarna oranye yang terkondensasi

dan terfragmentasi (terpecah-pecah menjadi bagian yang lebih kecil). Sel yang

mati karena mengalami nekrosis memiliki nukleus berwarna merah dengan

struktur normal. Warna yang ditimbulkan oleh etidium bromida pada sel mati

lebih dominan jika dibandingkan dengan akridin oranye sehingga nukleus pada sel

mati akan berwarna merah (McGahon et al., 1995).

I. Imunositokimia

Imunositokimia dimulai pada penelitian yang dilakukan oleh Coons dan

kawan-kawan pada tahun 1942 menggunakan antibodi yang dilabeli agen

PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
19

fluoresen untuk mendeteksi antigen pada hati. Penggunaan metode ini

berkembang dari penggunaan antibodi pada metode enzyme-linked

immunosorbent assay (ELISA) dan sebelumnya adalah radio immuno assay

(RIA). Imunositokimia adalah metode yang digunakan untuk mengidentifikasi

antigen dengan interaksi antigen-antibodi spesifik. Pewarnaan sel merupakan

metode yang sesuai untuk mendemonstrasikan keberadaan suatu molekul spesifik

di dalam sel. Dalam metode ini, antibodi spesifik yang berikatan dengan antigen

dideteksi dengan reagen sekunder yang berupa antibodi lain yang telah dilabeli

fluophore atau enzim (Richard, 2011).

Metode imunositokimia terbagi menjadi dua yaitu metode langsung dan

metode tidak langsung. Antibodi yang mengikat fluoresen atau zat warna

berikatan langsung dengan antigen pada sel disebut metode langsung. Metode

tidak langsung yaitu apabila antigen diikat pada antibodi primer secara langsung,

kemudian ditambahkan antibodi sekunder yang mengikat enzim seperti

peroksidase, alkali fosfatase, atau glukosa oksidase. Antibodi sekunder berikatan

dengan antibodi primer, kemudian ditambahkan substrat kromogen yang diubah

oleh enzim sehingga terjadi pembentukan warna yang mampu memberikan warna

pada sel (Richard, 2011). Ekspresi protein yang telah divisualisasikan dihitung

berdasarkan jumlah sel yang mengekspresi protein tertentu dari keseluruhan sel

dan dinyatakan dalam satuan %. Sel yang mengekspresikan protein tertentu akan

memberikan warna coklat/gelap, sedangkan yang tidak mengekspresikan protein

tertentu memberikan warna ungu/biru (Dai et al., 2004).

PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
20

Imunositokimia dimanfaatkan untuk mengidentifikasi protein dan

makromolekul lain pada tingkat sel. Sampel kontrol diperlukan untuk menunjukan

lokasi pelabelan yang benar. Kontrol yang diperlukan untuk imunositokimia

adalah kontrol antibodi primer yang menunjukan spesifitas antara antibodi primer

dan antigen, kontrol antibodi sekunder untuk menunjukan spesifitas ikatan antara

antibodi sekunder dan antibodi primer. Kontrol yang ketiga adalah kontrol label

yang menunjukan bahwa pelabelan yang terjadi merupakan hasil dari label yang

ditambahkan dan bukan dari label endogen (Richard, 2011).

J. Landasan Teori

Kanker kolon merupakan kanker yang terjadi didaerah kolon dan rektum.

Terdapat lebih dari 1,3 juta kasus kanker kolon dengan 694.000 kematian pada

tahun 2012. Pengobatan kanker kolon perlu dikembangankan untuk menekan

jumlah kematian, salah satunya dengan menggunakan tanaman obat. Bahan alam

yang potensial dikembangkan sebagai agen kemoterapi adalah tanaman sirih.

Tanaman sirih telah diteliti memiliki efek sitotoksik. Hasil uji fitokimia ekstrak

etanol daun sirih mengandung senyawa tanin, antrakuinon, flavonoid, alkaloid,

terpenoid, dan saponin yang berfungsi sebagai antineoplastik, antioksidan, dan

antikanker

Efek sitotoksik ekstrak etanol daun sirih terhadap sel kanker kolon WiDr

dapat diketahui dengan uji sitotoksisitas menggunakan metode MTT.

Karsinogenesis kolorektal dipengaruhi oleh COX-2, yaitu enzim induksi yang

bertanggung jawab terhadap perubahan asam arakidonat menjadi prostaglandin.

PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
21

Kadar COX-2 yang tinggi menyebabkan penurunan kemampuan sel untuk

mengalami apoptosis.

Uji double staining dilakukan untuk mengetahui jenis kematian sel

(apoptosis atau nekrosis). Pengujian imunositokimia digunakan untuk melihat

kemampuan ekstrak dalam menghambat ekspresi COX-2 yaitu protein yang

banyak diekspresikan oleh sel kanker kolon WiDr.

K. Hipotesis

1. Ekstrak etanol daun sirih mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker

kolon WiDr.

2. Ekstrak etanol daun sirih menginduksi apoptosis sel kanker kolon WiDr.

3. Aktivitas antikanker ekstrak etanol daun sirih diperantarai oleh penghambatan

ekspresi COX-2.
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian tentang penghambatan ekspresi COX-2 oleh ekstrak sirih

terhadap sel kanker WiDr merupakan jenis penelitian eksperimental murni dengan

menggunakan rancangan acak lengkap pola searah.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

1. Variabel utama

a. Variabel bebas.

Kadar ekstrak etanol daun sirih dengan konsentrasi 6 µg/mL, 10 µg/mL, 100

µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg/mL, 1000 µg/mL, 2000 µg/mLpada sel kanker

kolon WiDr.

b. Variabel tergantung

Viabilitas sel WiDr yang ditandai dengan IC50 ekstrak etanol daun sirih, jumlah

sel yang mengalami apoptosis dan penekanan ekspresi COX-2.

2. Variabel pengacau

a. Variabel pengacau terkendali

1) Tempat dilakukan percobaan yaitu di laboratorium Parasitologi Fakultas

Kedokteran Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.

22
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
23

2) Tempat dan waktu pengambilan daun sirih di Dusun Bedingin, Desa

Sumberadi, Kecamatan Mlati, Kabupaten Sleman, Yogyakarta, pada bulan

Juli 2014.

3) Kondisi sel yang digunakan yaitu sel kanker kolon WiDr dalam keadaan

80 % konfluen, tercukupi nutrisinya dan bebas dari kontaminasi.

b. Variabel pengacau tak terkendali. Variabel pengacau tak terkendali dalam

penelitian ini adalah tempat tumbuh, umur tanaman, jenis dan jumlah

kandungan kimia daun sirih.

3. Definisi Operasional

a. Sitotoksisitas adalah sifat toksik dari ekstrak etanolik daun sirih terhadap sel

kanker WiDr yang dinyatakan dalam nilai IC50.

b. Ekstrak etanol daun sirih adalah ekstrak kental daun sirih yang diperoleh

dengan cara maserasi selama 48 jam menggunakan pelarut etanol sampai

diperoleh ekstrak.

c. Sel WiDr adalah sel model kanker kolon yang termutasi pada gen p53 dan

mengekspresikan COX-2 dalam jumlah yang tinggi.

d. IC50 (Inhibition Concentration 50) adalah besarnya konsentrasi ekstrak daun

sirih yang dapat menghambat pertumbuhan 50% sel kanker WiDr.

e. Apoptosis adalah proses bunuh diri suatu sel secara terprogram yang ditandai

dengan perubahan morfologi sel yaitu blebbing membran plasma, kondensasi

kromatin, pengkerutan sel, nukleus berwarna oranye dan fragmentasi nukleus.

f. Ekspresi COX-2 adalah protein yang diekspresikan oleh sel kanker WiDr yang

ditunjukkan dengan warna cokelat pada sitoplasmanya.

PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
24

g. Imunositokimia adalah metode yang digunakan untuk mengetahui adanya

ekspresi suatu protein spesifik di dalam sel.

C. Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu daun sirih (diperoleh

dari Sleman, Yogyakarta); sel kanker kolon WiDr (diperoleh dari Laboratorium

Parasitologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada); pelarut DMSO

(Merck); etanol 70% (Merck); media kultur sel kanker WiDr yang terdiri dari

Rosswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Gibco), penisilin-streptomisin,

Fetal Bovin Serum (FBS) 10% (v/v) (Gibco), dan fungizone 0,5% (Gibco); reagen

MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida] (Bio Basic

Canada Inc); pelarut phoshat buffer saline (PBS) 1x pH 7,4; reagen stopper

sodium deodesil sulfat (SDS) 10%; reagen etidium bromida-akridin orange,

antibodi monoklonal primer COX-2 (Lab Vision), streptavidin berupa Horse

Radish Peroxidase (HRP), 3, 3’- diaminobinzidine (DAB), metanol, larutan

hidrogen peroksidase (blocking solution), aquades, larutan Maye Haemotoxylin,

alkohol, xylol, dan Tripsin 0,5 % (Gibco).

D. Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : alat-alat gelas

(PYREX), timbangan analitik, aluminium foil (Klin Pak), vortek, waterbath

(Memmert), tabung conical (Iwaki), inkubator CO2 (Heraeus), mikropipet

(Gilson), cover slip (Nunc), shaker, pinset, jarum, object glass, cell counter, 96-
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
25

well plate (Nunc), 24-well plate (Nunc), pipet Pasteur, ELISA reader (SLT 240

ATC), laminar air flow cabinet (Labconco), mikroskop inverted (Olympus),

mikroskop flourosens (Zeiss MC 80), kamera digital (Canon DSLR 1000D),

haemocytometer (Neubauer), yellow tips, blue tips, eppendorf (Plasti brand),

tissue, glove, pinset, dan masker.

E. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi tanaman

Determinasi tanaman sirih yang didapatkan di Sleman Yogyakarta

dilakukan di Bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah

Mada Yogyakarta, dengan membandingkan ciri morfologi tanaman sirih

dengan pustaka acuan menurut Becker dan Bakhuizen (1965).

2. Pembuatan simplisia

Daun sirih dicuci bersih dengan air mengalir dan dikeringkan

menggunakan oven pada suhu maksimal 60-700C. Daun sirih yang sudah

kering dan dapat dihancurkan dengan tangan. Daun sirih kering diserbukan di

Merapi Farma, Kaliurang Yogyakarta.

3. Ekstraksi daun sirih hijau dengan metode maserasi

Sebanyak 100 mg serbuk simplisia daun sirih direndam dalam 1000

mL etanol 70% dalam Erlenmeyer yang tertutup dan dikondisikan selama 24

jam dalam keadaan terlindung dari cahaya matahari sambil diaduk selama 6

jam pertama menggunakan shaker. Maserat diambil, disaring, dan ditampung

dalam tabung Erlenmeyer tertutup supaya terlindung dari cahaya matahari.

PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
26

Ampas serbuk sirih hijau yang tertinggal diperas dan ditambah cairan penyari

1000 mL etanol 70% kemudian dimaserasi menggunakan shaker selama 6 jam

pertama dan dibiarkan selama 24 jam. Maserat setelah 24 jam diambil dan

disaring menggunakan kertas saring kemudian digabungkan dengan maserat

sebelumnya. Maserat yang terkumpul dipekatkan menggunakan rotary

evaporator. Hasil evaporasi dituangkan ke dalam cawan porselen kemudian

dipanaskan di atas waterbath dengan suhu 800C untuk mendapatkan ekstrak

etanol daun sirih yang kental.

4. Uji sitotoksisitas ekstrak daun sirih (Piper betle L.) terhadap sel kanker

kolon WiDr dengan metode MTT

a. Preparasi sel kanker kolon WiDr

Sel WiDr diambil dari tangki nitrogen dan dicairkan dalam penangas

air dengan suhu 370C. Ampul disemprot dengan etanol 70% dan dimasukkan

dalam LAF. Ampul dibuka dan sel WiDr dipindahkan ke dalam conical tube

steril yang berisi medium RPMI 1640. Suspensi sel disentrifugasi dengan

kecepatan 650 rpm selama 3 menit (supernatan yang terbentuk dibuang).

Medium RPMI 1640 yang baru ditambahkan kedalam suspensi sel dan

disentrifugasi kembali selama 5 menit hingga homogen kemudian dicuci ulang

sekali lagi. Suspensi sel WiDr yang didapatkan,ditambahkan dengan 1 mL

medium penumbuh sel yang mengandung 10% FBS dan diresuspensi kembali

secara perlahan hingga homogen. Sel WiDr ditambahkan dalam tissue culture

flask kecil dan diinkubasi dalam inkubator CO2 dengan suhu 370C. Medium

kultur WiDr diganti setelah 24 jam. Sel WiDr ditumbuhkan hingga 80%
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
27

kofluen dan jumlahnya cukup untuk uji yang dilakukan. Medium kultur

dibuang setelah sel WiDr konfluen. Sel WiDr dicuci dengan 3,5 mL PBS

sebanyak 2 kali kemudian ditambahkan dengan Tripsin-EDTA 300L dan

diinkubasi selama 3 menit dalam inkubator CO2. Sebanyak 5 mL media kultur

ditambahkan dan sel WiDr diresuspensikan hingga terlepas seluruhnya dari

dinding flask. Suspensi sel dipindah ke dalam conical tube steril baru. Sel

WiDr dihitung dengan haemocytometer dan cell counter.

b. Preparasi larutan uji ekstrak daun sirih

Ekstrak daun sirih ditimbang kurang lebih 50 mg dan dimasukkan

dalam eppendorf. Ekstrak tersebut dilarutkan dalam 1 mL DMSO dan divortek

hingga homogen untuk mendapatkan larutan ekstrak induk konsentrasi 1

mg/mL. Larutan induk diencerkan dengan media kultur hingga diperoleh seri

konsentrasi 5 µg/mL, 10 µg/mL, 100 µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg/mL, 1000

µg/mL, 2000 µg/mL

c. Uji sitotoksik dengan metode MTT

96-well plate yang berisi sel diambil dari inkubator. Keadaan dan

distribusi sel diamati di mikroskop kemudian didokumentasikan. Media dalam

sumuran dibuang dengan membalikkan plate 1800 di atas tempat pembuangan,

plate secara perlahan ditekan di atas tisu untuk meniriskan sisa cairan dan

dicuci dengan PBS sebanyak 100 µL, kemudian PBS dibuang dengan cara

membalikan plate dan meniriskan sisa cairan dengan tisu. Sebanyak 100 µL

seri konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih dengan kadar 5 µg/mL, 10 µg/mL,

100 µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg/mL, 1000 µg/mL, 2000 µg/mL, dimasukkan
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
28

ke 96-well plate dan sebanyak 100 µL media kultur juga dimasukkan pada 3

sumuran sebagai kontrol media dan diinkubasi selama 24 jam. Menjelang akhir

inkubasi, kondisi sel didokumentasikan terlebih dahulu. Media sel dibuang

dengan membalikkan plate diatas tempat buangan, plate ditekan secara

perlahan di atas tisu untuk meniriskan sisa cairan dan dicuci dengan 100 µL

PBS. PBS dibuang dengan cara membalik plate dan meniriskan sisa cairan

dengan tisu. Sebanyak 100 µL reagen MTT ditambahkan ke setiap sumuran

selama 2-4 jam dalam inkubator sampai terbentuk formazan. Kondisi sel

diperiksa dengan mikroskop inverted. Sebanyak 100 µL larutan Stopper SDS

10% dalam 0,1 N HCl ditambahkan apabila sudah terbentuk formazan. Plate

dibungkus dengan kertas atau aluminuium foil dan diinkubasi di tempat gelap

semalaman pada suhu ruangan. Absorbansi dibaca pada masing-masing

sumuran dengan ELISA reader pada λ = 595 nm, kemudian prosentase sel

hidup dihitung dan dilakukan analisis harga IC50.

5. Uji apoptosis dengan metode Double Staining

a. Preparasi sel kanker WiDr

Sel kanker WiDr yang sudah konfluen diambil dari inkubator CO2 dan

dipanen. Cover slip dimasukkan kedalam 24-well plate menggunakan pinset

dengan hati-hati. Sebanyak 1000 µL suspensi sel dimasukkan tepat diatas cover

slip secara merata dan perlahan. Sel diamati di mikroskop untuk melihat

distribusi sel. Sel diinkubasi dalam inkubator selama semalam.

PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
29

b. Perlakuan Double Staining Sampel pada Sel

Sel WiDr dalam 24-well plate diambil dari inkubator. Semua media

kultur dari sumuran dibuang dengan pipet Pasteur secara perlahan-lahan. Sel

WiDr dalam sumuran dicuci dengan masing-masing 500 µL PBS. PBS dibuang

dari sumuran dengan pipet Pasteur secara perlahan. Sebanyak 1000 µL larutan

uji ekstrak etanol daun sirih dengan konsentrasi 794,23 µg/mL dan 1000 µL

media kultur sebagai kontrol sel dimasukkan ke dalam sumuran. Sel diinkubasi

dalam inkubator selama 24 jam. Semua media dari sumuran dibuang dan dicuci

masing-masing dengan 500 µL PBS. PBS dibuang dan cover slip diambil

menggunakan pinset dengan bantuan ujung jarum dengan hati-hati. Cover slip

diletakkan di atas object glass (kaca obyek) dan diberi label. Reagen campuran

ethidium bromide-akridin oranye 10 µL diteteskan di atas cover slip dan

diratakan dengan cara menggoyang secara perlahan, kemudian diamati di

bawah mikroskop fluoresen dan didokumentasi.

6. Pengamatan ekpresi protein dengan metode Imunositokimia

a. Preparasi sel kanker WiDr

Sel kanker WiDr yang sudah konfluen diambil dari inkubator CO2 dan

dipanen. Cover slip dimasukkan kedalam 24-well plate menggunakan pinset

dengan hati-hati. Suspensi sel 1000 µL dimasukan tepat diatas coverslip secara

merata dan perlahan. Keadaan sel dilihat di mikroskop untuk melihat distribusi

sel. Sel diinkubasi dalam inkubator selama semalam.

PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
30

b. Perlakuan uji imunositokimia ekstrak etanolik daun sirih pada sel WiDr

Sel WiDr dalam 24-well plate diambil dari inkubator. Semua media

kultur dibuang dari sumuran dengan pipet Pasteur secara perlahan-lahan. Sel

WiDr dalam sumuran dicuci dengan masing-masing 500 µL PBS. PBS dari

sumuran dibuang dengan pipet Pasteur secara perlahan. Sebanyak 1000 µL

larutan uji ekstrak etanolik daun sirih hijau dengan konsentrasi 794,23 µg/mL

dan 1000 µL media kultur sebagai kontrol sel dimasukkan kedalam sumuran.

Sel diinkubasi dalam inkubator selama 24 jam. Semua media dibuang dari

sumuran dan masing-masing dicuci dengan 500 µL PBS. PBS dibuang dan

sebanyak 300 µL metanol dimasukkan kemudian diinkubasi selama 10 menit

di inkubator. Metanol dibuang secara perlahan. Larutan hidrogen peroksida

(blocking solution) diteteskan kemudian diinkubasi selama 15-20 menit.

Larutan dibuang dengan mikropipet dan dicuci dengan air aquadest dan PBS.

Prediluted blocking serum diteteskan dan diinkubasi selama 10-15 menit

kemudian larutan dibuang. Antibodi monoklonal primer (Lab Vision) untuk

antibodi yang ingin diamati yaitu COX-2 di teteskan dan diinkubasikan selama

60 menit. Sebanyak 500 µL PBS ditambahkan dan diinkubasi selama 5 menit.

PBS dibuang dan antibodi sekunder (trek Avidin-HRP label) diteteskan

kemudian diinkubasi selama 20 menit. Larutan dibuang. Reagen trek Avidin-

HRP label diteteskan dan diinkubasi selama 10 menit. PBS 500 µL

ditambahkan dan diinkubasi selama 5 menit dan PBS dibuang. Larutan DAB

diteteskan dan diinkubasikan selama 15 menit. Sebanyak 500 µL akuades

ditambahkan, kemudian dibuang. Larutan May Haemotoxylin diteteskan dan

PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
31

diinkubasi selama 3 menit. Sebanyak 500 µL akuades ditambahakan kemudian

membuangnya kembali. Cover slip diangkat dengan pinset secara hati-hati dan

dicelupkan dalam xylol dan alkohol. Cover slip dikeringkan dan diletakkan di

atas object glass, kemudian ditetesi dengan lem (mounting media). Cover slip

ditutup dengan cover slip kontak. Ekpresi protein diamati dengan mikroskop

cahaya.

F. Analisis Hasil

1. Uji MTT

Data yang didapat dari uji MTT, dihitung % viabilitas selnya dengan

menggunakan rumus :

Data % viabilitas sel di plotkan pada tabel kemudian IC50 dihitung dengan

menggunakan persamaan regresi linear konsentrasi vs % viabilitas sel pada

Microsoft Excel 2007.

Koefisien y pada persamaan linier ini menunjukkan koefisien IC50,

sedangkan koefisien x menunjukkan konsentrasi ekstrak yang akan dicari

nilainya, dimana x yang diperoleh merupakan besarnya konsentrasi yang

diperlukan untuk dapat menghambat viabilitas sel sebesar 50% (Harmita,

2004).

2. Uji Double Staining

Preparat diamati dengan menggunakan mikroskop cahaya dengan

perbesaran 40x10. Setiap preparat dihitung dalam tiga lapang pandang yang
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
32

berbeda. Sel yang berwarna hijau menunjukkan bahwa sel tersebut hidup. Sel

utuh berwarna merah menunjukkan sel nekrosis sedangkan sel yang

terfragmentasi nukleusnya (apoptosis) ditunjukkan dengan warna oranye.

Pembacaan dan perhitungan jumlah sel yang mengalami apoptosis, nekrosis

atau sel hidup pada preparat dibaca dengan bantuan tiga orang responden

(blind reader). Hasil berupa % rata-rata ± SD.

3. Uji Immunositokimia

Ekspresi protein tertentu (misal COX-2) ditunjukkan dengan warna

coklat pada sitoplasma (bukan inti sel). Pembacaan data dilakukan dengan

bantuan blind reader. Sebanyak tiga orang responden menghitung jumlah sel

yang mengekspresikan COX-2 pada preparat yang terdiri dari tiga bagian tiap

preparatnya. Hasil berupa % rata-rata ± SD.

Persentase sel yang mengekspresikan COX-2 dalam satu preparat

dihitung dengan melakukan skoring. Tiga orang responden (blind reader)

membantu dalam membaca dan menghitung persentase sel yang

mengekpresikan COX-2 pada tiap preparat. Hasil negatif apabila sel yang

mengekspresikan COX-2 < 10% dari total sel dan hasil positif apabila sel yang

mengekspresikan COX-2 > 10% dari total sel. Nilai skor diberikan sesuai

dengan persentase sel yang mengekspresikan COX-2; Skor - = < 10%; Skor +

= < 25%; Skor ++ = < 50%; Skor +++ = < 75%; dan Skor ++++ = < 90%

(Zhang dan Sun, 2002).

Data % penekanan ekpresi COX-2 yang didapat kemudian dianalisis

secara statistik menggunakan uji Shapiro Wilk untuk mengetahui distribusi data
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
33

tiap kelompok kontrol sel, ekstrak etanol daun sirih, dan doksorubisin

(Immanuel, 2015). Apabila didapatkan data yang berdistribusi normal maka

dilakukan uji variansi menggunakan uji F-Test Sample of Variancespada

program Microsof Excel 2007, yang kemudian dilanjutkan dengan T-Test :

Paired Two Sample for Means pada program Microsof Excel 2007 untuk

mengetahui adanya kebermaknaan perbedaan penekanan ekpresi COX-2 pada

tiap kelompok. Apabila didapatkan data yang tidak berdistribusi normal maka

dilakukan uji non-parametik menggunakan uji Kruskal-Wallis, yang

dilanjutkan dengan uji Man-Whitney untuk mengetahui kebermaknaan

perbedaan penekanan ekpresi COX-2 pada tiap kelompok.

PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh ekstrak etanol daun

sirih terhadap viabilitas sel kanker kolon WiDr dan diketahui nilai IC50 yang

digunakan untuk mengetahui kemampuan induksi apoptosis dan potensi

penekanan ekspresi COX-2. Uji secara in vitro dilakukan menggunakan metode

MTT untuk mengetahui persentase viabilitas sel. Kematian sel secara apoptosis

dideteksi dengan metode double staining dan dilanjutkan dengan uji

imunositokimia untuk melihat ekspresi COX-2 pada sel WiDr.

A. Determinasi Tanaman dan Penyiapan Ekstrak Daun Sirih

Penelitian ini menggunakan sampel berupa tanaman yaitu daun sirih.

Langkah awal yang dilakukan dalam penelitian adalah determinasi tanaman sirih

yang bertujuan untuk memastikan kebenaran identitas tanaman yang digunakan

dalam penelitian ini, yaitu tanaman sirih (Piper betle L.). Bagian tanaman yang

digunakan untuk determinasi merupakan bagian daun, batang, dan akar.

Determinasi tanaman dilakukan di bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi

Universitas Gadjah Mada Yogyakarta dan dibuktikan dengan adanya surat

keterangan dengan No. : BF/277/Ident/Det/VI/2014 (Lampiran 5).

Proses selanjutnya adalah ekstraksi menggunakan metode maserasi untuk

mendapatkan zat-zat aktif yang terdapat dalam daun sirih. Maserasi merupakan

ekstraksi tanpa pemanasan yang sederhana, sehingga cocok digunakan untuk

ekstraksi senyawa-senyawa yang sensitif pada suhu tinggi. Prinsip maserasi

34
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
35

adalah ekstraksi zat aktif yang dilakukan dengan cara merendam serbuk dalam

penyari yang sesuai pada suhu ruang dan terlindung dari cahaya. Cairan

penyari masuk kedalam rongga sel yang mengandung zat aktif, sehingga

terjadi perbedaan konsentrasi antara zat terlarut didalam sel dengan yang diluar

sel maka larutan didalam sel didesak keluar dan hal ini terjadi berulang-ulang

sehingga tercapainya kesetimbangan konsentrasi antara larutan yang ada di

dalam dan di luar sel. Pelarut yang digunakan adalah etanol 70%. Hasil uji

fitokimia ekstrak etanol daun sirih mengandung senyawa tanin, antrakuinon,

flavonoid, alkaloid, terpenoid, dan saponin (Kumari dan Rao, 2014). Daun sirih

berpotensi memiliki aktivitas sitotoksik karena mengandung senyawa flavonoid,

antrakuinon, dan alkaloid yang dikenal memiliki aktivitas antikanker (Hasballah,

2005; Jusril, dkk., 2003; Astuti, dkk., 2005). Penelitian Lin, dkk., (2006)

menyebutkan bahwa flavonoid merupakan senyawa polifenol yang secara in vitro

dapat menghambat proliferasi sel kanker kolon. Flavonoid dapat terlarut oleh

pelarut polar seperti air dan etanol karena mempunyai gugus hidroksil. Ekstrak

etanol daun sirih berwarna hijau pekat karena kandungan klorofil yang terdapat

pada daun sirih juga ikut terekstrak.

B. Uji Sitotoksik Ekstrak Etanolik Daun Sirih terhadap Sel Kanker

WiDr

Uji aktivitas antikanker ekstrak etanol daun sirih terhadap sel kanker

kolon WiDr dilakukan dengan metode MTT. Metode MTT dipilih karena sensitif,

relatif cepat, akurat, dan digunakan untuk mengukur sampel dalam jumlah besar.
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
36

Metode MTT merupakan metode kolorimetri berdasarkan perubahan warna garam

tetrazolium menjadi formazan dalam mitokondria yang aktif pada sel hidup. MTT

diabsorbsi oleh sel hidup dan dipecah oleh sistem reduktase suksinat tetrazolium

pada respirasi mitokondria (Doyle dan Griffiths, 2000) menghasilkan warna ungu

yang menandakan adanya perubahan MTT menjadi kristal formazan. Warna ungu

yang dihasilkan proporsional dengan jumlah sel yang masih hidup (viabilitas sel).

(A) (B)

(C) (D)
Gambar 6. Efek sitotoksik ekstrak daun sirih hijau terhadap sel WiDr.
Keterangan: Konsentrasi ekstrak etanol daun sirih hijau (A) 2000 µg/mL, (B) 500 µg/mL,
(C) 5 µg/mL (D) kontrol sel.
Pengamatan dilakukan dibawah mikroskop inverted perbesaran 400x.
Perbedaan morfologi sel semakin terlihat setelah pemberian MTT.
(sel hidup: ; sel mati: )
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
37

Morfologi sel kanker WiDr yang diamati dibawah mikroskop inverted

menunjukkan bahwa populasi sel WiDr pada kelompok kontrol sel hidup terlihat

lebih cerah karena sitoplasmanya mengandung cairan sitoplasma yang dapat

meneruskan cahaya dari mikroskop inverted (Gambar 6D), sel menempel satu

dengan yang lain, memiliki bentuk bulat dan terlihat menempel di dasar plate.

Dilihat dari morfologi selnya (Gambar 6A) pada konsentrasi ekstrak 2000 µg/mL,

sel yang mati terlihat mengambang, pada bagian pinggir sel berwarna gelap,

bagian tengah terlihat kosong, kepadatan sel berkurang, dan tidak saling

menempel. Sel yang mati memiliki warna lebih gelap dan berbentuk bulat, hal ini

terjadi karena sel kehilangan sitoplasma akibat rusaknya membran sel, sehingga

sel tidak dapat meneruskan cahaya dari mikroskop. Pada konsentrasi ekstrak 500

µg/mL sel terlihat lebih padat dibandingkan dengan konsentrasi ekstrak 2000

µg/mL dan tidak saling menempel (Gambar 6B), sedangkan pada konsentrasi 5

µg/mL, kepadatan populasi mendekati kepadatan kontrol sel yang menandakan

viabilitas sel masih tinggi.

Berdasarkan hasil uji aktivitas antikanker ekstrak etanol daun sirih

terhadap sel kanker kolon WiDr, maka dapat diketahui nilai IC50. Nilai IC50

menunjukkan konsentrasi ekstrak etanol daun sirih yang mampu menghambat

pertumbuhan 50 % sel kanker WiDr. % viabilitas sel dapat diketahui dengan

ELISA reader. Hasil ELISA reader adalah data absorbansi yang dikonversikan

sebagai nilai viabilitas sel. Efek ekstrak etanol daun sirih terhadap sel kanker

kolon WiDr diketahui dengan membuat tabel korelasi antara konsentrasi ekstrak

dan viabilitas sel (Gambar 5).

PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
38

Gambar 5. Kurva hubungan viabilitas sel terhadap konsentrasi ekstrak etanol daun sirih

Aktivitas anti kanker ekstrak etanol daun sirih berpola dose dependent

yaitu viabilitas sel menurun seiring kenaikan konsentrasi sampel. Perhitungan

dilakukan dengan regresi linear menggunakan Microsoft Excel 2007 pada 3 titik

konsentrasi yaitu 250 µg/mL, 500 µg/mL, dan 1000 µg/mL dan didapatkan

persamaan linear y = -0,104x + 132,63 dengan R = 0,992. Sensitivitas ekstrak

etanol daun sirih terhadap sel kanker WiDr diukur melalui nilai IC50. Berdasarkan

persamaan linear diperoleh nilai IC50 ekstrak etanol daun sirih adalah 794,23

µg/mL Menurut NCI (National Cancer Institute), suatu ekstrak dinyatakan

memiliki aktivitas antikanker tinggi apabila memiliki nilai IC50 < 30 µg/mL,

memiliki aktivitas antikanker sedang apabila memiliki 30 µg/mL ≤ IC50 < 100

µg/mL dan tidak aktif apabila nilai IC50 > 100 µg/mL (Zheng, dkk., 2000),

sehingga dapat dikatakan bahwa ekstrak etanol daun sirih menurut NCI tidak

memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker kolon WiDr. Nilai IC50 yang

tidak poten diduga karena kompleksitas senyawa yang terkandung didalam

PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
39

ekstrak etanol daun sirih, namun ekstrak etanol daun sirih tetap memiliki potensi

untuk dikembangkan sebagai antikanker dan dilanjutkan dengan uji double

staining dan imunositokimia karena dalam penelitian Awik, Sukardiman, dan Tri

(2011) yang menguji sitotoksisitas dan efek ekstrak spon laut (Aaptos

suberitoides) terhadap sel kanker payudara (T47D) dihasilkan nilai IC50 sebesar

528,828 µg/mL dan dilanjutkan dengan pengujian double staining dan

imunositokimia. Nilai IC50 ekstrak etanol daun sirih dibandingkan dengan nilai

IC50 doksorubisin. Doksorubisin merupakan antibiotik golongan antrasiklin yang

diisolasi dari kultur Streptomyces peucetiusvarcaesius (Minotti,dkk., 2004) dan

merupakan agen kemoterapi yang secara luas dipakai untuk berbagai macam

kanker (Lupertz, dkk., 2010). Menurut penelitian yang dilakukan oleh Immanuel

(2015) nilai IC50 doksoribisin pada sel kanker kolon WiDr adalah 21,44 µg/mL.

Nilai IC50 doksorubisin terhadap kanker kolon WiDr jauh lebih rendah (toksik)

apabila dibandingkan dengan perlakuan ekstrak etanol daun sirih. Morfologi sel

yang mengalami perubahan perlu dianalisis lebih lanjut untuk mengetahui

kemampuan ekstrak etanol daun sirih dalam menginduksi apoptosis sel kanker

kolon WiDr pada konsentrasi IC50.

Nilai IC50 yang tinggi pada penelitian ini diduga disebabkan oleh

kandungan beta karoten dalam ekstrak etanol daun sirih. Penelitian yang

dilakukan oleh Andarwulan (1995) menunjukkan bahwa daun sirih yang

diekstrasi menggunakan heksan-etanol mengandung senyawa beta karoten.

Penelitian Wolf dan George (2002) menegaskan pengaruh beta karoten terhadap

pertumbuhan tumor pada paru-paru yang diujikan pada musang, dinyatakan

PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
40

bahwa pemberian beta karoten pada dosis tinggi (2,4 mg/kg BB per hari) selama

enam bulan dapat menyebabkan perkembangan proliferasi sel alveolar dan

metaplasia keratinisasi skuamosa. Daun sirih juga mengandung minyak atsiri

(Moeljanto dan Mulyono, 2003) yang memiliki aktivitas sebagai antioksidan

(Parwata, dkk., 2009), tetapi pada penelitian Sayin, dkk., (2014) menunjukkan

bahwa senyawa antioksidan memiliki aktivitas sebagai prokarsinogenik. Pada

kolon yang mengalami adenoma diketahui jumlah protein p53 mengalami

penurunan akibat mutasi dan penekanan oleh antioksidan sehingga memicu

peningkatkan proliferasi sel kanker.

C. Uji Apoptosis Ekstrak Etanolik Daun Sirih dengan Metode Double

Staining

Mekanisme kematian sel dibagi menjadi dua yaitu melalui mekanisme

apoptosis dan nekrosis. Pengamatan terhadap kematian sel dilakukan dengan

menggunakan metode double staining. Metode ini berdasarkan pada perbedaan

fluorosensi DNA pada sel yang hidup dan mati karena pengikatan Etidium

Bromida – Akridin Oranye. Konsentrasi yang digunakan pada uji ini sesuai

dengan nilai IC50 yang didapat dari uji MTT. Akridin oranye dapat masuk ke

dalam sel hidup dan mati. Akridin oranye mengandung gugus kation sehingga

dapat berinteraksi dengan DNA sel hidup yang berifat anionik, membentuk garam

terdisosiasi dan menghasilkan warna fluoresensi hijau, sedangkan etidium

bromida hanya bisa masuk kedalam sel yang membran plasmanya sudah rusak

karena sel yang apoptosis mengalami blebbing sehingga membran sel tidak
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
41

permeabel, kemudian akan berikatan dengan RNA atau DNA untai tunggal dan

menghasilkan fluororesensi oranye dilihat dengan mikroskop fluororesens. Warna

yang ditimbulkan etidium bromida lebih dominan daripada akridin oranye

(Meiyanto, dkk., 2008). Pada kelompok kontrol, membran sel dalam keadaan utuh

(tidak rusak) sehingga hanya akridin oranye yang bisa masuk dan menghasilkan

floresensi hijau (Gambar 7A). Beberapa sel WiDr yang mati pada kelompok

kontrol, hal ini dimungkinkan karena kurangnya nutrisi untuk sel WiDr bertahan

hidup. Pada kelompok perlakuan, terlihat bahwa sel WiDr mengalami apoptosis

yang ditandai rusaknya membran sel dan inti sel yang terfragmentasi. Kerusakan

membran sel ini menyebabkan etidium bromide dapat masuk ke dalam sel dan

menghasilkan floresensi oranye, namun tidak semua sel WiDr pada kelompok

perlakuan mengalami apoptosis (Gambar 7B), hal serupa juga ditunjukkan pada

perlakuan ekstrak dengan doksorubisin (Gambar 7C). Sel yang mengalami

apoptosis akan berwarna oranye dan nukleus mengalami fragmentasi (fase late

apoptosis). Pada fase early apoptosis, sel mengalami kondensasi inti yang

ditunjukkan dengan adanya warna oranye pada nukleus, sehingga tampak sel

berwarna hijau bercampur oranye. Hal tersebut terjadi karena sel mulai

mengalami membran blebbing, sehingga etidium bromida mulai masuk ke dalam

sel (Pebriana, dkk., 2008). Pada penelitian ini tidak ditemukan sel yang

mengalami fase early apoptosis. Sel yang mati (nekrosis) berwarna merah

(ditunjukkan dengan panah berwarna biru) dan bentuk sel dalam keadaan utuh.

Sel yang mati (nekrosis) membran plasmanya pecah, sehingga jumlah etidium

bromida dan akridin oranye yang masuk kedalam sel lebih banyak dari pada sel
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
42

yang mengalami apoptosis dan warna yang dihasilkan semakin kuat. Dari hasil

metode double staining ini dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanol daun sirih

dapat menginduksi apoptosis walaupun tidak sebesar doksorubisin.

(A) (B)

(C)
Gambar 7. Hasil Uji Double Staining Ekstrak Etanol Daun Sirih.
Keterangan: Kontrol sel (A), perlakuan dengan ekstrak daun sirih 794,23 µg/mL (B), perlakuan
dengan doksorubisin konsentrasi 21 µg/mL.
Sel Hidup Nekrosis Apoptosis

Tabel I. Distribusi sel WiDr pada uji apoptosis dengan metode double staining

Sel Hidup ± (%)SD Nekrosis (%) ± SD Apoptosis (%) ± SD

Kontrol Sel 99,60 ± 0,37 0,37±0,38 0
Ekstrak Etanol Daun
16,98±1,02 11,6±4,5 71,44 ± 4,4
Sirih
Doksorubisin 5,42 ± 0,0005 2,98 ± 2,59 92,92 ± 2,20

Uji double staining merupakan uji kualitatif dan dapat dijadikan sebuah

uji semi-kuantitatif dengan syarat terdapat minimal tiga buah foto gambaran
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
43

keadaaan sel dalam satu preparat yang dianggap mewakili seluruh keadaan sel

dalam satu preparat. Hasil diketahui dengan bantuan blind reader. Tiga orang

diminta untuk menghitung jumlah sel yang mengalami apoptosis, nekrosis, dan sel

hidup tanpa mengetahui perlakuan yang diberikan terhadap sel yang diamati.

Tabel I (perlakuan ekstrak etanol daun sirih) menunjukkan sel yang mengalami

apoptosis sebanyak 71,4% ± 5,5 sel. Penelitian yang dilakukan oleh Immanuel

(2015) didapatkan presentase apoptosis doksorubisin terhadap kanker kolon WiDr

sebesar 92,92% ± 2,20, hal ini menunjukkan ekstrak etanol daun sirih dapat

menginduksi apoptosis walaupun tidak sebesar doksorubisin. Setelah dilakukan

uji double staining terhadap ekstrak etanol daun sirih, analisis aktivitas antikanker

dilanjutkan menggunakan metode imunositokimia untuk mengetahui interaksi

molekuler ekstrak etanol daun sirih terhadap COX-2.

D. Uji Penekanan Ekspresi COX-2 oleh Ekstrak Etanolik Daun Sirih dengan

Metode Imunositokimia

Imunositokimia merupakan uji yang dilakukan dalam penelitian dengan

tujuan untuk mengetahui seberapa besar kemampuan ekstrak dalam menghambat

ekspresi COX-2, suatu protein yang banyak diekspresikan oleh sel kanker WiDr.

Metode imunositokimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode

indirect (tidak langsung) yang dapat memberikan hasil lebih sensitif karena

antibodi primer dikenali oleh antibodi sekunder yang berikatan kovalen dengan

marker sehingga membuatnya mudah terdeteksi (Alberts, dkk., 1994).

PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
44

Pada penelitian ini, antibodi primer yang digunakan adalah antibodi

monoklonal primer COX-2. Antibodi ini berikatan dengan reseptor COX-2 yang

ada di sel kanker kolon WiDr dan memberikan warna coklat gelap ketika diberi

pewarna DAB dari reagen imunositokimia.

(A) (B) (C)

(D)
Gambar 8. Hasil Imunositokimia Sel kanker Kolon WiDr.
Keterangan: (A) Kontrol sel dengan antibodi (B) kontrol sel tanpa antibodi (C) perlakuan ekstrak
794,23 µg/mL (D) perlakuan doksorubisin 21 µg/mL
Sel yang mengekspresikan COX-2 :
Sel yang tidak mengekspresikan COX-2 :
Berdasarkan pengamatan, pewarnaan secara enzimatis oleh peroksidase

menyebabkan adanya warna yang berbeda antara sel yang mengekspresikan COX-

2 berlebih dan sel yang tidak mengekspresikan COX-2. Sel yang

mengekspresikan COX-2 berlebih berwarna coklat gelap (Gambar 8A), sel yang

sedikit mengekspresikan COX-2 berwarna coklat pudar sedangkan sel yang tidak

mengekspresikan COX-2 berwarna ungu (Gambar 8B). Warna coklat terjadi pada

sel karena pewarna DAB yang bereaksi dengan H2O2 dari Horse Radish
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
45

Peroxidase (HRP), sehingga menimbulkan warna coklat gelap, sedangkan HRP

berikatan pada antibodi primer dan antibodi sekunder yang aktif bekerja pada

COX-2. Pada sel WiDr yang telah diberi perlakuan ekstrak etanol daun sirih

(Gambar 8C), sel yang mengekspresikan COX-2 berlebih semakin sedikit

dibandingkan pada kontrol sel. Sel yang berwarna coklat gelap (mengekspresikan

COX-2 berlebih) dengan perlakuan doksorubisin (Gambar 8D) lebih sedikit

dibandingkan dengan perlakuan ekstrak etanol daun sirih, hal ini menandakan

bahwa ektrak daun sirih menekan ekspresi COX-2 walaupun tidak sebesar

perlakuan dengan doksorubisin.

Distribusi ekspresi COX-2 dapat diketahui dan dihitung menggunakan

metode scoring system. Perhitungan skor COX-2 dilakukan dengan menghitung

persentase sel yang mengekspresikan COX-2. Hasil positif atau negatif pada

pengujian imunositokimia atau ada tidaknya suatu protein dapat dilakukan dengan

metode skoring secara semi kuantitatif. Skoring dilakukan dengan menghitung

presentase sel yang mengekspresikan COX-2 dalam suatu preparat.

Tabel II. Jumlah rata-rata sel yang mengekspresikan COX-2 dalam tiap perlakuan.

Preparat %Rata-rata ± SD Skoring

Kontrol Sel 61,43 ± 5,21 +++
Perlakuan Ekstrak 37,00 ± 2,29 ++
Doksorubisin 34,32 ± 2,57 ++
Ket. : - = < 10%; + = < 25%; ++ = < 50%; +++ = < 75%; dan ++++ = < 90%

Hasil perhitungan menggunakan metode scoring system berdasarkan

analisis t-berpasangan (α = 0,05) menunjukkan bahwa penekanan ekspresi COX-2

pada kelompok perlakuan dan kontrol sel adalah berbeda bermakna. Hasil

perhitungan jumlah rata-rata sel yang mengekspresikan protein COX-2 pada

kelompok perlakuan (40,73 ± 2,53) lebih kecil dibandingkan kontrol sel (61,43 ±
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
46

5,21). Pada penelitian Immanuel (2015), rata-rata jumlah sel yang

mengekspresikan COX-2 pada doksorubisin sebesar 34,32 ± 2,57. Hal ini

menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun sirih memiliki kamampuan menekan

ekspresi protein COX-2 pada sel WiDr walaupun tidak sebesar doksorubisin.

Jumlah sel yang mengekspresikan COX-2 dihitung secara blind yang

melibatkan 3 orang blind reader yang tidak mengetahui perlakuan yang diberikan

terhadap sel yang diamati. Hal ini dilakukan untuk menghindari subyektivitas.

Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa daun sirih dapat menghambat ekspresi

protein COX-2 dan memiliki potensi yang berbeda tidak bermakna secara statistik

dengan uji t-berpasangan (α = 0,05). Jumlah rata-rata sel yang mengekspresikan

COX-2 pada tabel II mengalami penurunan pada perlakuan ekstrak etanol daun

sirih.

Tabel III. Hasil uji statistik t-test berpasangan ekspresi COX-2 antara ekstrak etanol daun
sirih dan kontol sel pada uji imunositokimia. BB=Berbeda bermakna, BTB=Berbeda tidak
bermakna

Ektrak Daun
Perlakuan Kontrol Sel Doksorubisin
Sirih
Kontrol Sel BB BB
Ekstrak Etanol Daun
BB BTB
Sirih
Doksorubisin BB BTB

Untuk mengetahui perbedaan bermakna dilanjutkan dengan analisis t-

berpasangan (α = 0,05) menunjukkan hasil thitung sebesar -21,75 µg/mL dan ttabel

sebesar 4,30 µg/mL, karena thitung lebih kecil dari pada ttabel maka kedua data

berbeda signifikan. Pada tabel III dapat dilihat bahwa adanya perbedaan bermakna

antara jumlah COX-2 pada sel kanker yang telah diberi perlakuan dengan ekstrak

etanol daun sirih dengan jumlah COX-2 pada kontrol sel. Uji imunositokimia
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
47

dalam penelitian ini menghasilkan bahwa aktivitas antikanker ekstrak etanol daun

sirih diperantarai oleh penekanan ekspresi protein COX-2 yang merupakan

biomarker yang dapat dijadikan molekul target dalam antikanker.

Pada penekanan ekspresi COX-2 ekstrak etanol daun sirih, senyawa aktif

yang memiliki aktivitas tersebut belum diteliti lebih lanjut pada penelitian ini,

namun ada dugaan bahwa senyawa aktifnya adalah flavonoid, karena pada

penelitian Perera, dkk.,(2001) melaporkan bahwa flavonoid berperan dalam

regulasi enzim COX-2. Pada penelitian Achmad, Armun, Supriatno, dan Singgih

(2014), senyawa flavonoid mempunyai kemampuan menghambat aktivasi Nuclear

Factors Kappa B (NF-қB). NF-κB merupakan protein regulator ekspresi sejumlah

gen yang berperan dalam proses pembentukan kanker, protein anti apoptosis, gen

pengatur adhesi molekul, dan gen pengatur siklus sel. NF-κB dipertahankan dalam

sitoplasma oleh protein inhibitor IκB. Inaktivasi NF-κB oleh flavonoid

diperantarai melalui penghambatan ikatan DNA dengan NF-κB. Beberapa

mediator dalam jalur transduksi di antaranya fosfoinositid 3-kinase (Akt)

diketahui mengaktivasi NF-κB melalui fosforilasi dari IκB. NF-κB yang

teraktivasi bertranslokasi ke inti dan menyebabkan transkripsi beberapa gen

(misalnya COX-2). Flavonoid diketahui menghambat jalur fosfoinositid 3-kinase

(Akt), sehingga tidak dapat mengaktivasi NF-κB. NF-κB yang tidak teraktivasi

tidak dapat bertranslokasi ke inti dan tidak meregulasi COX-2.

 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Ekstrak etanol daun sirih memiliki aktivitas sitotoksik dengan IC50

sebesar 794,23 µg/mL terhadap sel kanker kolon WiDr

2. Ekstrak etanol daun sirih menginduksi apoptosis pada sel kanker kolon

WiDr

3. Apoptosis yang diakibatkan oleh ekstrak etanol daun sirih terhadap sel

kanker kolon WiDr diperantarai oleh penekanan ekspresi protein COX-2

B. Saran

1. Perlu dilakukan uji sitotoksik ekstrak etanol daun sirih pada sel normal

untuk mengetahui selektifitasnya.

2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui fraksi aktif dari

ekstrak etanol daun sirih yang selanjutnya diteliti mekanisme induksi

apoptosis, aktivitas sitotoksik, penekanan ekspresi COX-2 pada sel

kanker kolon WiDr.

48
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

DAFTAR PUSTAKA

Achmad, H., Armyn, S.A., Supriatno, Singgih, M.F., 2014, Anti-cancer Activity
And Anti-Proliferation Ant Nest Flavonoid Fraction Test (Myrmecodya
Pendans) Human Tongue Cancer Cells In Sp-C1, IOSR-JDMS, Vol. 13,
Issue 6 Ver. II, 01-05.

Alberts, B., dkk., 1994, Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, New
York, 186-188.

Albert, M. L. 2004. Death-defying immunity: do apoptotic cells influence antigen

processing and presentation, Nat. Rev. Immunol. 4:223-231.

Alfarabi, M., Bintang, M., Suryani, Safithri, M., 2010, The Comparative Ability
of Antioxidant Activity of Piper crocatum in Inhibiting Fatty Acid
Oxidation and Free Radical Scavenging, HAYATI Journal of Biosciences,
Vol. 17, No. 4, pp. 201-204.

Allen, J.I., 1995, Molecular Biology of Colorectal Cancer : a Clinician’s View,

Perspect Colon Rectal Surgery, 8:181-202.

Andrawulan, 1995, Karakterisasi Antioksidan Alam Dari Daun Sirih (Piper Betle
L.) Pemisahan Komponen Dalam Oleoresin Daun Sirih Dengan
Kromatografi Lapis Tipis, Skripsi, Institut Pertanian, Bogor.

Astuti, P., Alam, G., Hartati, M.S., Sari, D., Wahyuono, S., 2005, Uji Sitotoksik
Senyawa Alkaloid dari Spons Petrosia sp. : Potensial Pengembangan
Senyawa Antikanker, Majalah Farmasi Indonesia, Vol.16, pp. 58-62.

ATCC, 2014, WiDr, All Rights Reserved, http://www.atcc.org/products/all/CCL-

218.aspx diakses pada 5 Januari 2015.

Awik, P.D.N., Sukardiman, Tri, W.N., 2009, Uji Sitotoksisitas Dan Efek Ekstrak
Spons Laut Aatos suberitoides Terhadap Sel Kanker Payudara (T47D)
Secara In Vitro, Department of Biology, Sepuluh Nopember Institute of
Technology, Surabaya, pp. 2-11.

Biranti, F., Nursid, M., Cahyono, B., 2009, Analisis Kualitatif B-Karoten dan Uji
Aktivitas Karetinoid Dalam Alga Coklat Turbinaria Decurrens, J.Sains &
Mat.,Vol 17(2): 98-104.

Breyer, R.M., Bagdassarian, C.K., Myers, S.A., and Breyer, M.D., 2001,
Prostanoid receptors: subtypes and signaling, Annual Review of
Pharmacology and Toxicology, 41, 661–690.

49
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
50

Brown, J.R., DuBois, R.N., 2005, COX-2: a molecular target for colorectal cancer
prevention, J Clin Oncol, 23(12):2840-55.

Brownson, D.M., Azios, N.G., Fuqua, B.K., Dharmawardhane, S.F., Mabry, T.J.,
2002, Flavonoid effects relevant to cancer, J Nutr, 132(11 Suppl):3482S-
3489S.

Buchwalow, Bocker, 2010, Immunohistochemistry: Basics and Methods,

Springer, pp. 345-346.

Corwin, E., 2008, Handbook of Pathophysiology, Lippincott Williams & Wilkins,

USA, pp. 23-28.

David, M.L., dan Shivdasani, R.,2001, Toeard Mecanism. Based Cancer Care
Research Opportunities For Spesific Disease and Disondens, JAMA
Vol.285. 5 : 588-9.

Demeule, M., Michaud-Levesque, J., Annabi, B., Gingras, D., Boivin, D., Jodoin,
J., Lamy, S., Bertrand, Y., Beliveau, R., 2002, Green tea catechins as
novel antitumor and antiangiogenic compounds, Curr Med Chem
Anticancer Agents, 2(4):441-63.

Doyle, A., dan Griffiths, J.B., 2000 Cell and Tissue Culture: Laboratory
Procedures in Biotechnology, John Willey & Sons LTD, New York, 62-
64.

Elmore, S., 2007, Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death, Toxicol

Pathol., 35(4), pp. 495–516.

Feletou, M., Huang, Y., Vanhoutte, P.M., 2011, Endothelium-mediated control of

vascular tone: COX-1 and COX-2 products, British Journal of
Pharmacology, (164) 894–912.

Fournier, D. B., Gordon, G. B., 2000, COX-2 and colon cancer: potential targets
for chemoprevention, J Cell Biochem Suppl., 34:97-102.

Grady, W.M., 2004, Genomic instability and colon cancer, Cancer Metastasis
Rev., 23(1-2):11-27.

Hanahan, D., Weinberg, R.A., 2000, The hallmarks of cancer, Cell press,
100(1):57-70.

Hasballah, K., Murniana, Al Azhar, 2005, Aktivitas antibakteri ekstrak daun

Eclipta alba L. Hassk serta ekstrak dan minyak atsiri daun Piper betle L.
terhadap bakteri penyebab karies gigi, Jurnal Kedokteran Yarsi,13(3):281-
7.
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
51

Immanuel, H., 2015, Uji Aktivitas Antikanker Ekstrak Etil Asetat Daun Keladi
Tikus (Typhonium flagelliforme) Terhadap Sel Kanker Kolon WiDr
Melalui Penekanan Ekspresi Protei COX-2, Skripsi, Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Jusril, Lajis, N.H., Mooi, L.Y., Abdullah, M.A., Sukari, M.A., Ali, A.M., 2003,
Antitumor promoting and actioxidant activities of anthraquinones isolated
from the cell suspension culture of Morinda elliptica, Asia Pacific Journal
of Molecular Biology and Biotechnology, Vol. 1(1), pp. 3-7.

Kangralkan, V.A., Kulkarni, A.R., 2013, In Vitro Antitumor Activity of Piper

betle Leaf, Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical,
Vol. 4, Issue 4:1158-1561.

Kavanagh, K., 2007, New Insight in Medical Mycology, Springer, The

Netherlands, p. 32.

Khomsan, A., 2009, Rahasia Sehat dengan Makanan Berkhasiat, Buku Kompas,
Jakarta, pp. 16-17.

King, R.J.B., 2000, Cancer Biology, 2nd Ed., Pearson Eduation Limited, London.

Krisnuhoni, E., 2004, Colorectal cancer profile in Cipto Mangunkusumo hospital

histopatological aspects : The multidisciplinary cancer management of
solid tumors : breast, colorectal and the sarcomas, Jakarta, pp. 24-30.

Kumar V., Cotran R.S., Robbins S.L. 2007. Buku Ajar Patologi. Volume 2. Edisi
7. Jakarta : EGC. pp. 12-887.

Kumari, O.S., Rao, N.B., 2014, Phyto Chemical Analysis of Piper betle leaf
extract, World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, vol.4,
pp. 699-703.

Kurnijasanti, R., Hamid, I. S., Rahmawati, K., 2008, Efek Sitotoksik In Vitro dari
Ekstrak Buah Mahkota Dewa (Phaleria Macrocarpa) Terhadap Kultur Sel
Kanker Mieloma, J. Penelit. Med. Eksakta, 1: 48-54.

Leone, V., Palma, A., Ricchi, P., Acquaviva, F., Giannouli, M., Prisco, A.M.,
Iuliano, F., Acquaviva, A.M., 2007, PGE2 inhibits apoptosis in human
adenocarcinoma Caco-2 cell line through Ras-PI3K association and
cAMP-dependent kinaseA activation, Am J Physiol Gastrointest Liver
Physiol, 293(4):G673-81.
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
52

Levlero, M., De Laurenzi, V., Coatanzo, A., Gong, J., Wang, J.Y., Melino, G.,
2000, The p53/p63/p73 family of transcription factors: overlapping and
distinct function, J Cell Sci, 113 (Pt 10): 1661-70.

Lin J, Zhang SM, Wu K, Willett WC, Fuchs CS,Giovannucci E.,2006, Flavonoid

intake and colorectal cancer riskin men and women. American journal of
epidemiology,164(7):644–51.

Lowe, S.W., Lin, A.W., 2000, Apoptosis in cancer, Carcinogenesis, Cold Spring
Harbor Laboratory, 21 (3):485-95.

Lüpertz R., Wätjen W., Kahl R., Chovolou Y., 2010, Dose- and time-dependent
effects of doxorubicin on cytotoxicity, cell cycle and apoptotic cell death
in human colon cancer cells, Institute of Toxicology, 271(3):115-2.

Meiyanto, E., Hermawan, A., Jumedi, S., Fitriasari, A., Susidarti., R.A., 2011,
Nobiletin Increased Cytotoxic Activity Of Doxorubicin On Mcf-7 Cells
But Not On T47d Cells, Vol. 3, 129-137.

Minotti, G., Menna, P., Salvatorelli, E., Cairo,G., dan Gianni, L. 2004.
Anthracyclins: Molecular Advances and Pharmacologic Developments in
Antitumor Activity and Cardiotoxicity. Pharmacol Rev., 56:185-228.

Moeljanto, R. D., Mulyono, 2003, Khasiat & manfaat daun sirih: obat mujarab
dari masa ke masa, Agromedia Pustaka, Jakarta, hal 10.

Mukhtar, H., Das, M., Khan, W.A., Wang, Z.Y., Bik, D.P., Bickers, D.R.,
Exceptional activity of tannic acid among naturally occurring plant
phenols in protecting against 7,12-dimethyl bez(a)anthracene-,
bezo(a)pyrene-, 3-methyl cholanthrene-, and N-methyl-N-nitrosurea-
induced skin tumorigenesis in mice, Cancer Res, 48:2361-5.

Murakami, A., Ali, A. M., Mat-Salleh, K., Koshimizu, K., Ohigashi, H., 2000,
Screening for the in vitro anti-tumor-promoting activities of edible plants
from Malaysia, Biosci Biotechnol Biochem., 64(1):9-16.

Nolfo, F., Rametta, S., Marventano, S., Grosso, G., Mistretta, A., Drago,F., et al.,
2013, Pharmacological and Dietary Prevention for Colorectal Cancer,
BMC Surgery, 13(2):S16, 1.

Nugroho, T., 2003, Pengaruh pemaparan kombinasi ekstrak meniran (Phyllanthus

niruri Linn) dan ekstrak sirih (Piper betle Linn) terhadap viabilitas tumor
adenocarcinoma mammae mencit C3H secara in vitro, Tesis, Program
Magister Ilmu Biomedik, Program Pasca Sarjana Universitas Diponegoro,
Semarang.
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
53

Palozza, P., 2005, ß-Carotene Downregulates the Steady-State and Heregulin-α–

Induced COX-2 Pathways in Colon Cancer Cells, J. Nutr., 135: 129–136.

Paranjpe, R., Gundala, S.R., Lakshminarayana, N., Sagwal, A., Asif, G., Pandey,
A., Aneja, R., 2013, Piper betel leaf extract: anticancer benefits and bio-
guided fractionation to identify active principles for prostate cancer
management, Carcinogenesis. Vol. 34(7):1558-66.

Pawarta, O.A., Rita, W.S., Yoga, R., 2009, Isolasi dan Uji Antiradikal Bebas
Minyak Atsiri Pada Daun Sirih (Piper betle Linn) Secara Spektroskopi
Ultra Violet-Tampak, Jurnal Kimia, Vol.3, 7-13.

Pebriana, R.B., Wardhani, B.W.K., Widayanti, E., Wijayanti, N.L.S., Wijayanti,

T.R., Riyanto, S., Meiyanto, E., Pengaruh Ekstrak Metanolik Daun Kenikir
(Cosmos caudatus Kunth.) Terhadap Pemacuan Apoptosis Sel Kanker
Payudara, Pharmacon, Vol. 9, No. 1, Juni 2008, 21-26.

Perera, P., Ringbom, T., Huss, U., Vasage, M., dan Bohlin, L., 2001, Search for
Natural Product which Affect Cyclooxygenase-2, in Tringali, C., (Ed.),
Bioactive Compounds from Natural Sources: Isolation, Characterisation,
and Biological Properties, Taylor and Francis, London, 434-465.

Pfizer, 2014, Data Sheet Celebrex, Pfizer New Zealand Ltd., pp. 1-33.

Pradhan, D., Suri, K.A., Pradhan, D.K., Biswasroy, 2013, Golden Heart of the
Nature: Piper betle L. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry,
Vol. 1 (6), 147-167.

Price, S. A., Wilson, L. M., 2003, Pathophysiology: clinical concepts of disease

processes, Universitas Michigan, Mosby, 363-367.

Pusponegoro, A.D., 2004,Epidemiologi Keganasan Saluran Cerna. Proceeding

temu ilmiah multimodalitas terapi pada keganasan saluran cerna. Dalam:
the multidisciplinary cancer management of solid tumors: breast,
colorectal and the sarcomas today & tomorrow. Jakarta.

Rajakariar, R., Yaqoob, M.M., Gilroy, D.W., 2006, COX-2 in inflammation and
resolution, Mol Interv, 6(4):199-207.

Richard, W., 2011, Control for Immunocytochemistry: An Update, JHC, 59(1), 6-

12.

Riss, T.L., 2013, Cell Viability Assays, Assays Guidance Manual, 2-13.
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
54

Sano, H., Kawahito, Y., Wilder, R. L., Hashiramoto, A., Mukai, S., Asai, K., et
al., 1995, Expression of cyclooxygenase-1 and -2 in human colorectal
cancer, Cancer Res., 55(17):3785-9.

Sayin, V.I., Ibrahim, M.X., Larsson, E., Nilsson, J.A., Lindahl, P., Bergo, M.O.,
2014, Antioxidants Accelerate Lung Cancer Progression in Mice, Sci
Transl Med, 6, 1-8.

Schmitz, G., Lepper, H., and Heldrich, M., 2001, Pharmacards: Lernkatensystem
Pharmakologie und Toxikologie, 3rd Ed, diterjemahkan oleh Setiadi, L.,
hal 239, EGC, Jakarta.

Sinicrope, F.A., Gill, S., 2004, Role of cyclooxygenase-2 in colorectal cancer,

Cancer Metastasis Rev, 23(1-2):63-75.

Soeripto, dkk., 2003. Gastro-intestinal Cancer in Indonesia. Asian Pacific Journal

of Cancer Prevention, (Online), Vol. 4, No. 4,
(http://www.apocp.org/cancer_download/Vol4_No4/Soeripto.pdf, diakses
27 maret 2015).

Srisadono, A., 2008, Skrining Awal Ekstrak Etanol Daun Sirih (Piper betle Linn)
Sebagai Antikanker Dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BLT),
Skripsi, Fakultas Kedokteran, Universitas Diponegoro, Semarang.

Stringer, J. L., 2006, Basic Concepts In Pharmacology: A Student’s Survival

Guide, Edisi 3, diterjemahkan oleh Huriawati Hartanto, hal 291, EGC,
Jakarta.

Sudarsono, Agus, P., Didik, G. dkk., 1996, Tumbuhan obat, Yogyakarta, BP

UGM.

Sudiana, I.K., 2008, Patobiologi Molekuler Kanker, Salemba Medika, Jakarta, pp.
35-52.

Tjindarbumi, D., Mangunkusumo, R., 2002, Cancer in Indonesia, present and

future, Jpn J Clin Oncol, 32 Suppl:S17-21.

University of Iowa, 2015, Dealing with Cancer Therapy Hair Loss

http://www.uihealthcare.org/2column.aspx?id=22774 diakses pada 21
Januari 2015.

Venkatesan, P., Puvvada, N., Dash, R., Prahanth, K.B.N., Sarkar, D., Azab, B.,
Pathak, A., Kundu, S.C., Fisher, P.B., 2011, The potential of celecoxib-
loaded hydroxypatite-chitosan nanocomposite for the treatment of colon
cancer, Biomaterials, 32(15):3794-806.
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
55

Vikash, C., Shalini, T., Asha, R., Singh, D.P., Chaudhary, S.K., 2012, Piper betel:
Phytochemistry, Traditional Use 7 Pharmacological Activity-A Riview.
IJPRD, 4(04): 216-223.

Wagh, V., Mishra, P., Thakkar, A., Shinde, V., Sharma, S., Padigaru, M., Joshi,
K., 2011, Antitumor activity of NPB001-05, an orally active inhibitor of
Bcr-Abl tyrosine kinase, Front Biosci (Elite Ed)., 3:1349-64.

Wicaksono, M. H. B., Permana, S., 2013, Potensi Fraksi Etanol Benalu Mangga
(Dendrophthoe pentandra) sebagai Agen Anti Kanker Kolon pada Mencit
(Mus musculus Balb/c) setelah Induksi Dextran Sulvat (DSS) dan
Azoxymethane (AOM), Jurnal Biotropika, Edisi 1(2):75.

Widowati, W., Mozef, T., Risdian, C., Yellianty, 2013, Anticancer and free
radical scavenging potency of Catharanthus roseus, Dendrophthoe
petandra, Piper betle and Curcuma mangga extracts in breast cancer cell
lines, Oxid Antioxid Med Sci. 2013; 2(2): 137-142.

Wolf, G., 2002, The Effect of ß-carotene on Lung and Skin Carcinogenesis,
Carcinogenesis, 23:1263-1265.

World Health Organization, 2012, Cancer, http://www.who.int/mediacentre/factsh

Eets/fs297/en/ diakses pada tanggal 18 Juni 2015.

Worthley, D.L., 2010, Colorectal Cancer: Molecular Features and Clinical

Opportunities, Clin Biochem Rev., 31(2): 31–38.

Zekri, A.R.N., dkk., 2005, Mismatch repair genes (hMLH1, hPMS1, hPMS2,
GTBP / hMSH6, hMSH2) in the pathogenesis of hepatocellular
carcinoma, World Journal of Gastroenterology, 11(20):3020-3026.

Zhang, H. Dan X.F., Sun, 2002, Overexpression of COX-2 correlate with

advanced stages of colorectal cancer, Am. TG., 97(4): 1037-1041.

Zheng Z., Huang W., Yang Y, Li Z., Cai J, Su H., 2000, Detection of antitumor
and antimicrobial activities in marine organism associated actinomycetes
isolated from the Taiwan Strait, China. Microbiol Lett, 188:87–91.

Zhao, Y., Usatyuk, P.V., Gorshkova, I.A., He D., Wang, T., Moreno-Vinasco, L.,
Geyh, A.S., Breysse, P.N., Samet, J.M., Spannhake, E.W., Garcia, J.G.,
Natarajan, V., 2009, Regulation of COX-2 expression and IL-6 release by
particulate matter in airway epithelial cells, Am J Respir Cell Mol Biol,
40(1):19-30. doi: 10.1165.
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

LAMPIRAN

56
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
57

Lampiran 1. Viabilitas sel kanker kolon WiDr dengan perlakuan ekstrak

etanol daun sirih hijau

% Viabilitas Sel
Konsentrasi Rata-rata SD
V1 V2 V3
2000 24,390 24,290 27,578 25,419 1,871
1000 28,874 25,785 27,280 27,313 1,545
500 84,679 86,273 83,284 84,745 1,496
250 101,918 109,093 100,722 103,911 4,527
100 103,812 105,107 106,801 105,240 1,499
10 102,317 101,719 101,952 101,952 0,320
5 102,317 103,114 95,042 100,158 4,448
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
58

Lampiran 2. Dokumentasi uji sitotoksik MTT assay

Konsentrasi (µg/mL) Gambar Sel

2000

500

Kontrol Sel
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
59

Lampiran 3. Dokumentasi uji double staining

Keterangan Gambar (Perbesaran 400 kali)

Double staining Kontrol Sel

Double staining Ekstrak Etanol Daun

Sirih (1)

Double staining Ekstrak Etanol Daun

Sirih (2)

Double staining Perlakuan

Doksorubisin
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
60

Lampiran 4. Dokumentasi uji imunositokimia

Keterangan Gambar

Kontrol sel (1)

Kontrol sel (2)

Kontrol sel (3)

Kontrol Sel Tanpa Antibodi

PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
61

Perlakuan dengan ekstrak etanol

daun sirih

Perlakuan dengan Doksorubisin

 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

Lampiran 5. DISTRIBUSI SEL WIDR PADA UJI APOPTOSIS DENGAN METODE DOUBLE STAINING

1. Perlakuan dengan Ekstrak Etanolik Daun Sirih Hijau

Sel Pengamat 1 Pengamat 2 Pengamat 3

Bagian Apoptosis Nekrosis Hidup Apoptosis Nekrosis Hidup Apoptosis Nekrosis Hidup
1 12 2 3 11 3 3 12 2 3
(Total Sel : 54) (70,6%) (11,8%) (17,6%) (64,7%) (17,6%) (17,6%) (70,6%) (11,8%) (17,6%)
2 18 0 1 16 2 1 18 0 1
(Total Sel : 37) (94,7%) (0%) (5,3%) (84,2%) (10,5%) (5,3%) (94,7%) (0%) (5,3%)
3 12 2 5 9 4 6 10 4 5
(Total Sel : 85) (63,9%) (10,52%) (26,3%) (47,4%) (21,05%) (31,6%) (52,6%) (21,05%) (26,3%)
Rata-rata tiap
76,40 7,44 16,4 65,43 16,38 18,17 72,63 10,95 16,4
pengamat (%)

Apoptosis Nekrosis Hidup

Rata-Rata Pengamat 1 (%) 76,40 7,44 16,40
Rata-Rata Pengamat 2 (%) 65,43 16,38 18,17
Rata-Rata Pengamat 3 (%) 72,63 10,95 16,40
Rata-Rata Keseluruhan(%) ±SD 71,4±5,5 11,6±4,5 16,98±1,02

62
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

2. Kontrol Sel

Bagian Apoptosis Nekrosis Hidup

Pengamat 1 (%) 0 0,36 99,53
Pengamat 2 (%) 0 0 100
Pengamat 3 (%) 0 0,73 99,27
Rata-Rata Keseluruhan(%) ±SD 0 0,37±0,38 99,60±0,37
3. Doksorubisin

Sel Pengamat 1 Pengamat 2 Pengamat 3

Bagian Apoptosis Nekrosis Hidup Apoptosis Nekrosis Hidup Apoptosis Nekrosis Hidup
1 93,75% 0 6,25% 93,75% 0 6,25% 81,25% 12,25% 6,25%
2 100% 0 0 85,71% 14,28% 0 100% 0 0
3 90% 0 10% 90% 0 10% 90% 0 10%
Rata-rata tiap
94,58 0 5,41 93,75 4,76 5,42 90,41 4,17 5,41
pengamat (%)

Apoptosis Nekrosis Hidup

Rata-Rata Pengamat 1 (%) 94,58 0 5,42
Rata-Rata Pengamat 2 (%) 93,75 4,76 5,42
Rata-Rata Pengamat 3 (%) 90,42 4,17 5,42
Rata-Rata Keseluruhan(%) ±SD 92,92±2,20 2,98±2,59 5,42±0,0005

63
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

Hasil Analisis Statistik Pada Uji Apoptosis Dengan Metode Double Staining

1. Uji normalitas dengan Shapiro-Wilk Test

a. Ekstrak etanol daun sirih hijau
Prosedur uji :
(1) Menentukan hipotesis
H0 : data berdistribusi normal
H1 : data tidak berdistribusi normal
(2) Data hasil penelitian diurutkan dari yang terkecil hingga yang terbesar besar.
(3) Taraf kepercayaan, α = 0,05
(4) Menghitung statistik uji
 Nilai D
Rumus : D =
Keterangan :
: angka ke i pada data
: rata-rata data
Urutan rata-rata tiap
Pengamat Rata-rata tiap pengamat
pengamat ( )
1 76,40 65,43 -6,06 36,72
2 65,43 72,63 1,14 1,30
3 72,63 76,40 4,91 24,11
71,49 D 62,13

 Nilai T
Rumus :T3 =
Keterangan :
: koefisien test Shapiro Wilk
: angka ke pada data
: angka ke i pada data

64
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

1 0,7071 65,43 76,40 10,97 7,76 60,22 0,97

(5) Menghitung singnifikansi uji

Signifikansi uji nilai T3 dibandingkan dengan nilai tabel Shapiro Wilk, untuk melihat posisi nilai probabilitasnya (p).
Jika nilai p lebih dari 5%, maka Ho diterima ; H1 ditolak. Jika nilai p kurang dari 5%, maka Ho ditolak ; H1 diterima.

Nilai T3 = 0,97 terletak diantara 0,959 (α = 0,5) dan 0,998 (α = 0,9). Nilai p tersebut lebih dari 5%, bearti H0 diterima, H1 ditolak, dan data
berdistribusi normal.

b. Doksorubisin
Prosedur uji :
(1) Menentukan hipotesis
H0 : data berdistribusi normal
H1 : data tidak berdistribusi normal
(2) Data hasil penelitian diurutkan dari yang terkecil hingga yang terbesar besar.
(3) Taraf kepercayaan, α = 0,05
(4) Menghitung statistik uji
 Nilai D
Rumus : D =
Keterangan :
: angka ke i pada data
: rata-rata data

65
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

Urutan rata-rata tiap

Pengamat Rata-rata tiap pengamat
pengamat ( )
1 94,58 90,42 -2,5 6,25
2 93,75 93,75 0,83 0,69
3 90,42 94,58 1,66 2,76

92,92 D 9,7

 Nilai T
Rumus :T3 =
Keterangan :
: koefisien test Shapiro Wilk
: angka ke pada data
: angka ke i pada data

1 0,7071 90,42 94,58 4,16 2,94 8,64 0,89

(5) Menghitung signifikansi uji

Signifikansi uji nilai T3 dibandingkan dengan nilai tabel Shapiro Wilk, untuk melihat posisi nilai probabilitasnya (p).
Jika nilai p lebih dari 5%, maka Ho diterima ; H1 ditolak. Jika nilai p kurang dari 5%, maka Ho ditolak ; H1 diterima.

Nilai T3 = 0,89 terletak diantara 0,789 (α = 0,1). dan 0,959 (α = 0,5). Nilai p tersebut lebih dari 5%, bearti H0 diterima, H1 ditolak, dan
data berdistribusi normal.

66
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

2. Uji kesamaan variansi

Prosedur uji :
a. Menentukan hipotesis
H0 : kedua data memiliki kesamaan variansi
H1 : kedua data tidak memiliki kesamaan variansi
b. Taraf kepercayaan, α = 0,05
c. Data hasil penelitian diurutkan dari yang terkecil hingga yang terbesar besar.
Doksorubisin Ekstrak etanol daun sirih meah
90,42 65,43
93,75 72,63
94,58 76,40

d. Menghitung nilai variansi tiap kelompok data menggunakan program microsof excel (F-Test Sample of Variances)
Ekstrak etanol daun sirih hijau Doksorubisin
Rata-rata 71,49 92,92
Variansi 31,07 4,85
Observasi 3 3
df 2 2
F-hitung 6,41
Nilai signifikansi 0,13
F-tabel 19
e. Kesimpulan
Nilai F-hitung dibandingkan dengan nilai F-tabel. Jika nilai F-hitung < F-tabel, maka H0 diterima, H1 di tolak.Jikan nilai F-hitung >
F-tabel, maka H0 ditolak; H1 di terima.
Pada penelitian ini, nilai F-hitung (=6,41) < F-tabel (=19), maka H0 diterima, H1 ditolak, dan kedua data memiliki kesamaan
variansi.

67
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

3. Uji t-berpasangan
Prosedur uji :
1) Menentukan hipotesis
H0 : kedua data berbeda signifikan
H1 : kedua data tidak berbeda signifikan
2) Taraf kepercayaan, α = 0,05
3) Data hasil penelitian diurutkan dari yang terkecil hingga yang terbesar besar.
Doksorubisin Ekstrak etanol daun sirih hijau
90,42 65,43
93,75 72,63
94,58 76,40

4) Menghitung nilai t tiap kelompok data menggunakan program microsof excel (t-Test : Paired Two Sample for Means)
Ekstrak etanol daun sirih hijau Doksorubisin
Rata-rata 71,49 92,92
Variansi 31,07 4,85
Observasi 3 3
Korelasi Pearson 0,99
Selisih rata-rata pada hipotesis 0
Ekstrak etanol daun sirih hijau Kontrol sel
df 2
t-hitung -10,87
Nilai signifikansi (uji 1 pihak) 0
t-tabel (uji 1 pihak) 2,92
Nilai signifikansi (uji 2 pihak) 0,01
t-tabel (uji 2 pihak) 4,30
5) Uji signifikansi
Uji signifikansi dengan membandingkan besarnya nilai t-hitung dengan nilai t-tabel. Jika nilai t-hitung < t-tabel, maka H0 diterima,
H1 di tolak. Jika nilai F-hitung > F-tabel, maka H0 ditolak; H1 di terima.
Pada penelitian ini, nilai t-hitung (=-10,87) < t-tabel (=4,30), maka H0 diterima, H1 ditolak, dan kedua data berbeda signifikan.

68
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

Hasil Perhitungan Uji Ekspresi COX-2 dengan Metode Imunositokimia

1. Perlakuan dengan Ekstrak Etanolik Daun Sirih Hijau

Preparat 1 Preparat 2 Preparat 3

Pengamat
(total sel = 135) (total sel = 121) (total sel = 101)
47 40 40
1
(34,81%) (33,06%) (39,60%)
50 44 41
2
(37,04%) (36,36%) (40,60%)
46 47 39
3
(34,07%) (38,84%) (38,61%)
Rata-rata tiap pengamat (%) 35,31 36,09 39,60
Rata-rata keseluruhan(%)±SD 37,00 ± 2,29

2. Kontrol sel

Preparat 1 Preparat 2 Preparat 3

Pengamat
(total sel = 225) (total sel = 240) (total sel = 145)
155 135 88
1
(68,89%) (55,25%) (60,69%)
160 145 97
2
(71,11%) (60,42%) (66,90%)
135 125 82
3
(60%) (52,08%) (56,55%)
Rata-rata tiap pengamat (%) 66,67 56,25 61,38
Rata-rata keseluruhan(%)±SD 61,43 ± 5,21

69
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

3. Doksorubisin

Total Sel Tiap

Preparat Pengamat 1 Pengamat 2 Pengamat 3
Preparat
49 45 34
1 127
(38,58%) (35,43%) (26,77%)
45 34 40
2 102
(44,11%) (33,33%) (39,21%)
43 51 45
3 152
(28,28%) (33,55%) (29,60%)
Rata-rata tiap pengamat (%) 36,99 34,10 31,86
Rata-rata keseluruhan(%)±SD 34,32 ± 2,57

70
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

Hasil Analisis Statistik Pada Uji Imunositokimia

4. Uji normalitas dengan Shapiro-Wilk Test

c. Ekstrak etanol daun sirih hijau
Prosedur uji :
(6) Menentukan hipotesis
H0 : data berdistribusi normal
H1 : data tidak berdistribusi normal
(7) Data hasil penelitian diurutkan dari yang terkecil hingga yang terbesar besar.
(8) Taraf kepercayaan, α = 0,05
(9) Menghitung statistik uji
 Nilai D
Rumus : D =
Keterangan :
: angka ke i pada data
: rata-rata data
Urutan rata-rata tiap
Pengamat Rata-rata tiap pengamat
pengamat ( )
1 35,31 35,31 -1,69 2,86
2 36,09 36,09 -0,91 0,83
3 39,60 39,60 2,6 6,76

37,00 D 10,45

 Nilai T
Rumus :T3 =
Keterangan :
: koefisien test Shapiro Wilk
: angka ke pada data

71
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

: angka ke i pada data

1 0,7071 35,31 39,60 4,29 3,03 9,18 0,88

(10) Menghitung singnifikansi uji

Signifikansi uji nilai T3 dibandingkan dengan nilai tabel Shapiro Wilk, untuk melihat posisi nilai probabilitasnya (p).
Jika nilai p lebih dari 5%, maka Ho diterima ; H1 ditolak. Jika nilai p kurang dari 5%, maka Ho ditolak ; H1 diterima.

Nilai T3= 0,88terletak diantara 0,789 (α = 0,1) dan 0,959 (α = 0,5). Nilai p tersebut lebih dari 5%, bearti H0 diterima, H1 ditolak, dan data
berdistribusi normal.

d. Kontrol sel
Prosedur uji :
(6) Menentukan hipotesis
H0 : data berdistribusi normal
H1 : data tidak berdistribusi normal
(7) Data hasil penelitian diurutkan dari yang terkecil hingga yang terbesar besar.
(8) Taraf kepercayaan, α = 0,05
(9) Menghitung statistik uji
 Nilai D
Rumus : D =
Keterangan :
: angka ke i pada data
: rata-rata data

72
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

Urutan rata-rata tiap

Pengamat Rata-rata tiap pengamat
pengamat ( )
1 66,67 56,25 -5,18 26,83
2 56,25 61,38 -0,05 0,0025
3 61,38 66,67 5,24 27,46

61,43 D 54,29

 Nilai T
Rumus :T3 =
Keterangan :
: koefisien test Shapiro Wilk
: angka ke pada data
: angka ke i pada data

1 0,7071 56,25 66,67 10,42 7,38 54,46 1,003

(10) Menghitung singnifikansi uji

Signifikansi uji nilai T3 dibandingkan dengan nilai tabel Shapiro Wilk, untuk melihat posisi nilai probabilitasnya (p).
Jika nilai p lebih dari 5%, maka Ho diterima ; H1 ditolak. Jika nilai p kurang dari 5%, maka Ho ditolak ; H1 diterima.

Nilai T3= 1,00 terletak pada α = 0,999. Nilai p tersebut lebih dari 5%, bearti H0 diterima, H1 ditolak, dan data berdistribusi normal.

73
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

a. Doksorubisin
Prosedur uji :
(1) Menentukan hipotesis
H0 : data berdistribusi normal
H1 : data tidak berdistribusi normal
(2) Data hasil penelitian diurutkan dari yang terkecil hingga yang terbesar besar.
(3) Taraf kepercayaan, α = 0,05
(4) Menghitung statistik uji
 Nilai D
Rumus : D =
Keterangan :
: angka ke i pada data
: rata-rata data

Urutan rata-rata tiap

Pengamat Rata-rata tiap pengamat
pengamat ( )
1 36,99 31,86 -2,46 6,05
2 34,10 34,10 -0,22 0,05
3 31,86 36,99 2,67 7,13

34,32 D 13,23

 Nilai T
Rumus :T3 =
Keterangan :
: koefisien test Shapiro Wilk
: angka ke pada data
: angka ke i pada data

74
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

1 0,7071 31,86 36,99 5,13 3,63 13,18 0,996

(5) Menghitung singnifikansi uji

Signifikansi uji nilai T3 dibandingkan dengan nilai tabel Shapiro Wilk, untuk melihat posisi nilai probabilitasnya (p).
Jika nilai p lebih dari 5%, maka Ho diterima ; H1 ditolak. Jika nilai p kurang dari 5%, maka Ho ditolak ; H1 diterima.

Nilai T3= 0,996 terletak diantara 0,959 (α = 0,5). dan 0,998 (α = 0,9). Nilai p tersebut lebih dari 5%, bearti H0 diterima, H1 ditolak, dan
data berdistribusi normal.
4. Uji kesamaan variansi
a. Kontrol sel vs ekstrak etanol daun sirih hijau
Prosedur uji :
f. Menentukan hipotesis
H0 : kedua data memiliki kesamaan variansi
H1 : kedua data tidak memiliki kesamaan variansi
g. Taraf kepercayaan, α = 0,05
h. Data hasil penelitian diurutkan dari yang terkecil hingga yang terbesar besar.
Kontrol sel Ekstrak etanolik daun sirih hijau
56,25 35,31
61,38 36,09
66,67 39,60

75
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

i. Menghitung nilai variansi tiap kelompok data menggunakan program microsof excel (F-Test Sample of Variances)
Kontrol sel Ekstrak etanol daun sirih meah
Rata-rata 61,43 37
Variansi 27,15 5,22
Observasi 3 3
df 2 2
F-hitung 5,2
Nilai signifikansi 0,16
F-tabel 19
j. Kesimpulan
Nilai F-hitung dibandingkan dengan nilai F-tabel. Jika nilai F-hitung < F-tabel, maka H0 diterima, H1 di tolak.Jikan nilai F-hitung >
F-tabel, maka H0 ditolak; H1 diterima.
Pada penelitian ini, nilai F-hitung (= 5,2) < F-tabel (= 19), maka H0 diterima, H1 ditolak, dan kedua data memiliki kesamaan
variansi.

b. Kontrol sel vs doksorubisin

Prosedur uji :
(1) Menentukan hipotesis
H0 : kedua data memiliki kesamaan variansi
H1 : kedua data tidak memiliki kesamaan variansi
(2) Taraf kepercayaan, α = 0,05

3) Data hasil penelitian diurutkan dari yang terkecil hingga yang terbesar besar.
Kontrol sel Doksorubisin
56,25 31,86
61,38 34,10
66,67 36,99

76
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

(3) Menghitung nilai variansi tiap kelompok data menggunakan program microsof excel (F-Test Sample of Variances)
Kontrol sel Doksorubisin
Rata-rata 61,43 34,32
Variansi 27,15 6,61
Observasi 3 3
df 2 2
F-hitung 4,10
Nilai signifikansi 0,20
F-tabel 19
(4) Kesimpulan
Nilai F-hitung dibandingkan dengan nilai F-tabel. Jika nilai F-hitung < F-tabel, maka H0 diterima, H1 di tolak.Jikan nilai F-hitung >
F-tabel, maka H0 ditolak; H1 di terima.Pada penelitian ini, nilai F-hitung (=4,10) < F-tabel (=19), maka H0 diterima, H1 ditolak, dan
kedua data memiliki kesamaan variansi.

c. Ekstrak etanol daun sirih hijau vs doksorubisin

Prosedur uji :
(1) Menentukan hipotesis
H0 : kedua data memiliki kesamaan variansi
H1 : kedua data tidak memiliki kesamaan variansi
(2) Taraf kepercayaan, α = 0,05
(3) Data hasil penelitian diurutkan dari yang terkecil hingga yang terbesar besar.
Ekstrak etanol daun Doksorubisin
sirih hijau
35,31 31,86
36,09 34,10
39,60 36,99

77
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

(4) Menghitung nilai variansi tiap kelompok data menggunakan program microsof excel (F-Test Sample of Variances)
Doksorubisin Ekstrak etanol daun sirih hijau

Rata-rata 34,32 37
Variansi 6,61 5,22
Observasi 3 3
df 2 2
F-hitung 1,27
Nilai signifikansi 0,44
F-tabel 19
(5) Kesimpulan
Nilai F-hitung dibandingkan dengan nilai F-tabel. Jika nilai F-hitung < F-tabel, maka H0 diterima, H1 di tolak.Jikan nilai F-hitung >
F-tabel, maka H0 ditolak; H1 di terima.Pada penelitian ini, nilai F-hitung (=1,27) < F-tabel (=19), maka H0 diterima, H1 ditolak, dan
kedua data memiliki kesamaan variansi.

5. Uji t-berpasangan
a. kontrol sel vs ekstrak etanol sirih hijau
Prosedur uji :
6) Menentukan hipotesis
H0 : kedua data berbeda signifikan
H1 : kedua data tidak berbeda signifikan
7) Taraf kepercayaan, α = 0,05
8) Data hasil penelitian diurutkan dari yang terkecil hingga yang terbesar besar.
Kontrol sel Ekstrak etanol daun sirih hijau
56,25 35,31
61,38 36,09
66,67 39,60

78
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

9) Menghitung nilai t tiap kelompok data menggunakan program microsof excel (t-Test : Paired Two Sample for Means)
Ekstrak etanol daun sirih hijau Kontrol sel
Rata-rata 37 61,43
Variansi 5,22 27,15
Observasi 3 3
Korelasi Pearson 0,94
Selisih rata-rata pada hipotesis 0,00
Ekstrak etanol daun sirih meah Kontrol sel
df 2,00
t-hitung -13,42
Nilai signifikansi (uji 1 pihak) 0,0027
t-tabel (uji 1 pihak) 2,92
Nilai signifikansi (uji 2 pihak) 0,005
t-tabel (uji 2 pihak) 4,30
10) Uji signifikansi
Uji signifikansi dengan membandingkan besarnya nilai t-hitung dengan nilai t-tabel. Jika nilai t-hitung < t-tabel, maka H0 diterima,
H1 di tolak. Jika nilai t-hitung > t-tabel, maka H0 ditolak; H1 di terima.
Pada penelitian ini, nilai t-hitung (=-13,42) < t-tabel (=4,30), maka H0 diterima, H1 ditolak, dan kedua data berbeda signifikan.

b. Kontrol sel vs doksorubisin

Prosedur uji :
(1) Menentukan hipotesis
H0 : kedua data memiliki kesamaan variansi
H1 : kedua data tidak memiliki kesamaan variansi
(2) Taraf kepercayaan, α = 0,05
(3) Data hasil penelitian diurutkan dari yang terkecil hingga yang terbesar besar.
Kontrol sel Doksorubisin
56,25 31,86
61,38 34,1
66,67 36,99

79
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

(4) Menghitung nilai t tiap kelompok data menggunakan program microsof excel (t-Test : Paired Two Sample for Means)
Doksorubisin Kontrol sel
Rata-rata 34,32 61,43
Variansi 6,61 27,15
Observasi 3 3
Korelasi Pearson 1
Selisih rata-rata pada hipotesis 0
df 2
t-hitung -17,73
Nilai signifikansi (uji 1 pihak) 0
t-tabel (uji 1 pihak) 2,92
Nilai signifikansi (uji 2 pihak) 0
t-tabel (uji 2 pihak) 4,3
(5) Uji signifikansi
Uji signifikansi dengan membandingkan besarnya nilai t-hitung dengan nilai t-tabel. Jika nilai t-hitung < t-tabel, maka H0 diterima,
H1 di tolak. Jika nilai F-hitung > F-tabel, maka H0 ditolak; H1 di terima.
Pada penelitian ini, nilai t-hitung (=-17,73) < t-tabel (=4,30), maka H0 diterima, H1 ditolak, dan kedua data berbeda signifikan.

c. Doksorubisin vs ekstrak etanol daun sirih hijau

Prosedur uji :
(6) Menentukan hipotesis
H0 : kedua data memiliki kesamaan variansi
H1 : kedua data tidak memiliki kesamaan variansi
(7) Taraf kepercayaan, α = 0,05
(8) Data hasil penelitian diurutkan dari yang terkecil hingga yang terbesar besar.
Doksorubisin Ekstrak etanol daun sirih hijau
31,86 35,31
34,1 36,09
36,99 39,60

80
 PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

(9) Menghitung nilai t tiap kelompok data menggunakan program microsof excel (t-Test : Paired Two Sample for Means)
Ekstrak etanol daun sirih meah Doksorubisin
Rata-rata 37 34,32
Variansi 5,22 6,61
Observasi 3 3
Korelasi Pearson 0,96
Selisih rata-rata pada hipotesis 0
df 2
t-hitung -6,34
Nilai signifikansi (uji 1 pihak) 0,01
t-tabel (uji 1 pihak) 2,91
Nilai signifikansi (uji 2 pihak) 0,02
t-tabel (uji 2 pihak) 4,30

(10) Uji signifikansi

Uji signifikansi dengan membandingkan besarnya nilai t-hitung dengan nilai t-tabel. Jika nilai t-hitung < t-tabel, maka H0 diterima,
H1 di tolak. Jika nilai F-hitung > F-tabel, maka H0 ditolak; H1 di terima.
Pada penelitian ini, nilai t-hitung (=-6,34) < t-tabel (=4,30), maka H0 diterima, H1 ditolak, dan kedua data berbeda signifikan.

81
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

Lampiran 6. Determinasi Tanaman Sirih

hijau

82
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi dengan judul “SKRINING

AKTIVITAS SITOTOKSIK EKSTRAK
ETANOLIK DAUN SIRIH (Piper betle L.)
TERHADAP SEL KANKER KOLON WiDr”
dengan nama lengkap Gigih Prayoga merupakan anak
pertama dari dua bersaudara pasangan Bapak Dwi
Sulistyo Utomo dan Ibu Trisnani. Penulis dilahirkan di
Kebumen, pada tanggal 14 September 1992. Penulis
menempuh pendidikan formal di TK Putra VIII
Gombong (1997-1999), SD Negeri Srampadan
Gombong (1999-2005), SMP Negeri 2 Gombong
(2005-2008), dan SMA Negeri 1 Gombong (2008-
2011). Penulis melanjutkan studi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta pada tahun 2011. Semasa perkuliahan, penulis memiliki pengalaman
sebagai Asisten Dosen Biofarmasetika (2015). Penulis aktif dalam mengikuti
kegiatan kepanitiaan seperti koordinator dari seksi P3K dalam acara Pharmacy
PerformanceAnd Event Cup (2012), dan sebagai koordinator keamanan dalam
acara Donor Darah Jaringan Mahasiswa Kesehatan Indonesia (JMKI) (2013).
Penulis juga aktif dalam kegiatan organisasi seperti Ikatan Senat Mahasiswa
Farmasi Seluruh Indonesia sebagai koordinator divisi informasi dan komunikasi
(2011-2012), Jaringan Mahasiswa Kesehatan Indonesia Komisariat Sanata
Dharma sebagai anggota Divisi Pengkaderan dan Pengembangan Hubungan
(2012-2013), serta sebagai ketua Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas (DPMF)
Farmasi (2014-2015).

83