SKRIPSI
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS AIRLANGGA
SURABAYA
2012
SKRIPSI
Disetujui oleh:
ii
Disetujui Oleh:
Mengetahui,
Ketua Departemen Kimia
Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga
iii
iv
KATA PENGANTAR
Puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan hidayah-Nya, sehingga
penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “ Pemurnian Parsial dan
Karakterisasi Enzim β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina
fulica”.
Penulisan skripsi ini tidak lepas dari bantuan berbagai pihak. Oleh karena
itu, dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Ibu Dr. Afaf Baktir, M.S. selaku dosen pembimbing I yang telah meluangkan
waktunya untuk memberikan saran, nasehat dan masukan dalam penyelesaian
proposal ini.
2. Bapak Dr. Purkan, M.Si. selaku dosen pembimbing II atas bimbingan dan
nasehatnya selama penyusunan proposal ini.
3. Ibu Aning, M.Si. selaku dosen wali atas motivasi dan dukungan yang telah
diberikan.
4. Keluarga, bapak, Ibunda, adikku Muhammad Saiful Mujad, bulek Suprihatin,
nenek, kakek dan Valihudddin Rizal tercinta atas dukungan dan semangat baik
moral maupun spiritual demi terselesaikannya proposal ini.
5. Teman-teman UKM Penalaran, Ditty, Muhaymin, aezzi dimitra, nararya, bima
fajar ,fajar shodiq, sobir, ratna, yanis, nimaz, nurul dan lain-lain, terimakasih
untuk kebersamaan dan perjuangan selama ini.
6. Buat Resti, Amel, Riza, Wike, Ve, Rista, Adel, Culan, Julie, Aya, luluk dan
teman-teman kimia lain, terimakasih untuk dukungan kalian.
7. Teman-teman kozt mulyorejo, mbak eka, mbak ida, mbak dinar, mbak finda,
mbak iin, mbak ayu, Cuwi, mbak dora, mbak dyan, terimakasih sudah
merawat, mendukung dan menemani saya selama 4 tahun ini.
8. Teman-teman KKN Tanjungharjo, Fariz, Fitra, Niniz, Ekki, Nikita dan lain-
lain terimakasih untuk kebersamaan kalian.
9. Terimakasih buat Plus Minus Digital yang telah memberikan banyak pelajaran
hidup padaku tentang bagaimana susahnya bekerja. Semoga suatu saat engkau
dapat menjadi besar dan bermanfaat bagi semua. Amien.
10. Terimakasih buat temen-temen Biokim blazt (Dita, Siska, Nadya, Rohiz, Mb
Kunsah, dan Ainur) atas bantuan dan kerjasamanya.
11. Terimakasih buat temen-temen PKL, Mbak Ade dan pembimbing di
Bioteknologi, LIPI, Bogor.
Skripsi ini disusun sebagai syarat tugas akhir yang harus diselesaikan dalam
meraih gelar sarjana S1. Penulis menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini
masih banyak kekurangan, sehingga kritik dan saran yang membangun sangat
diharapkan demi kesempurnaan proposal ini.
vi
ABSTRAK
vii
ABSTRACT
β-1 ,3-glucanase are enzymes that can degrade the cell walls of the fungus
composed of β-1, 3 glucan. The aim of this study are to partial purification and
characterization of the enzyme β-1 ,3-glucanase isolated from the digestive fluids
of Achatina fulica. Partial purification of β-1 ,3-glucanase was done by organic
solvent (acetone) on the various factions to get the optimum fraction. The results
obtained specific activity of the largest faction is the fraction of 40-75%. In the
specific activity of this fraction is 0.249 U/mg, in the other hand the specific
activity of crude enzyme extract is 0.092 U/mg. Thus, the purity of the enzyme
increased 1.81 times with % yield is 90.4%. The fraction of 40-75% which is a
fraction with the greatest specific activity was then carried out the characterization
of temperature and pH optimum. The optimum temperature obtained from the
research activity of the enzyme β-1 ,3-glucanase at 370C and pH optimum enzyme
activity of β-1 ,3-glucanase at pH 6.
viii
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ................................................................................... i
LEMBAR PERNYATAAN ............................................................................. ii
LEMBAR PENGESAHAN ............................................................................. iii
LEMBAR PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI ....................................... iv
KATA PENGANTAR ..................................................................................... v
ABSTRAK ....................................................................................................... vii
ABSTRACT ..................................................................................................... viii
DAFTAR ISI ................................................................................................... ix
DAFTAR TABEL ........................................................................................... xi
DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... xii
DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................... xiii
BAB I PENDAHULUAN .............................................................................. 1
1.1 Latar Belakang Masalah.................................................................... 3
1.2 Rumusan Masalah ............................................................................. 3
1.3 Tujuan Penelitian .............................................................................. 4
1.4 Manfaat Penelitian ............................................................................ 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA .................................................................... 5
2.1 Enzim ................................................................................................ 5
2.1.1 Struktur enzim........................................................................... 5
2.1.2 Klasifikasi enzim ...................................................................... 6
2.1.3 Mekanisme kerja enzim ............................................................ 7
2.1.4 Faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim ............................. 9
2.2 Enzim β-1,3 Glukanase ..................................................................... 11
2.3 β-1,3 Glukan...................................................................................... 13
2.4 Achatina fulica ................................................................................... 13
2.4.1 Klasifikasi Achatina fulica........................................................ 14
2.4.2 Karakteristik umum Achatina fulica ......................................... 15
2.4.3 Sistem pencernaan Achatina fulica ........................................... 16
2.5 Pemurnian Enzim ............................................................................... 17
2.6 Fraksinasi Pelarut Organik ................................................................. 19
BAB III METODE PENELITIAN .................................................................. 22
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ........................................................... 22
3.2 Alat dan bahan Penelitian ................................................................. 22
3.2.1 Alat-alat penelitian ................................................................... 22
3.2.2 Bahan-bahan penelitian ............................................................ 22
3.3 Diagram Alir Penelitian .................................................................... 23
3.4 Prosedur Penelitian............................................................................ 24
3.4.1 Karantina Achatina fulica ........................................................ 24
3.4.2 Panen ekstrak kasar enzim Achatina fulica .............................. 24
3.4.3 Uji aktivitas spesifik enzim β-1,3-glukanase ........................... 24
3.4.4 Pembuatan kurva standar glukosa ............................................ 25
3.4.5 Pemurnian parsial dengan fraksinasi aseton ............................ 26
ix
DAFTAR TABEL
Nomor Judul
xi
DAFTAR GAMBAR
xii
DAFTAR LAMPIRAN
Nomor Judul
1. Pembuatan reagen
2. Tabel penentuan kurva progress
3. Tabel penentuan kurva standar protein
4. Perhitungan aktivitas spesifik enzim
5. Data Karakterisasi enzim
6. Tabel fraksinasi aseton
xiii
BAB 1
PENDAHULUAN
kedokteran dan pertanian tidak lepas dari peranan enzim sebagai biokatalisator.
keuntungan, antara lain lebih efisien, ramah terhadap lingkungan, dan dapat
produk, reaksi tersebut berlangsung di daerah sisi katalitik atau sisi aktif (Dawn et
al., 2000)
salah satu enzim hidrolitik. Enzim ini dapat ditemukan pada sebagian besar
bakteri, jamur, tanaman tingkat tinggi dan hewan invertebrata. Terdapat dua
ikatan β-1,3-glukan secara berurutan, dari ujung non-reduksi suatu polimer atau
oligosakarida (Reese & Mandels, 1959). Substrat spesifik bagi enzim ini adalah
ditemukan pada dinding sel jamur patogen (Adams, 2004). Oleh karena itu, enzim
Candida albicans. Jamur ini bersifat patogen terutama pada tubuh yang
yang berupa campuran dari beberapa tipe sel, yaitu khamir, rizoid dan matriks
Komponen ini dapat dihidrolisis dengan enzim β-1,3-glukanase (Nett et al., 2007).
Achatina fulica mengakibatkan produksi dinding sel tidak lengkap. Hal ini karena
protein lain sehingga aktivitas enzim dapat ditingkatkan. Pemurnian parsial enzim
dilakukan dengan fraksinasi pelarut organik karena memiliki efek presipitasi yang
bagus (Sopes, 1994). Selain itu, pelarut organik tidak memecahkan gugus
prostetik dari molekul protein seperti pada pengendapan dengan garam (Bintang,
2010). Pelarut organik yang digunakan adalah aseton karena aseton mudah
aseton?
Achatina fulica.
beberapa bidang. Salah satunya untuk bidang kesehatan yaitu sebagai alternatif
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Enzim
adalah substansi baru yang terbentuk setelah setelah reaksi Masing-masing enzim
mengkatalisis suatu reaksi biokimia spesifik. Enzim hanya bereaksi dengan satu
substrat dan mengubah substrat tersebut menjadi suatu produk. Enzim secara
yang berlangsung dalam tubuh. Hal ini disebabkan karena urutan asam amino
spesifik yang unik yang membentuk enzim serta mengikat dan mengaktifkan
tiga dimensi spesifik yang dibentuk oleh struktur primer, sekunder dan tersiernya.
Selain itu, enzim juga ada yang memiliki struktur kuartener karena tersusun atas
lebih dari satu rantai protein (McMurry and Marry, 1994). Struktur primer
merupakan urutan linear asam amino yang disatukan oleh ikatan peptida. Struktur
struktur regular, berulang dan lokal yang terjadi akibat adanya ikatan hidrogen
ruang residu asam amino yang berdekatan dengan urutan linear dan membentuk
struktur α heliks, β sheet dan loop. Konformasi tersier protein terdiri atas beberapa
jenis ikatan antara lain : ikatan hidrogen yang terdapat diantara gugus R residu
asam amino rantai samping yang berdekatan, ikatan ion diantara gugus R yang
berlawanan, interaksi hidrofobik dari gugus R asam amino hidrofobik dan ikatan
Berdasarkan jenis reaksi yang dikatalisis oleh enzim maka enzim dibagi
1. Oksidoreduktase
oksidasi atau reduksi suatu bahan. Dalam golongan ini terdapat 2 jenis enzim
b. Dehidrogenase adalah enzim yang aktif dalam pengambilan atom hidrogen dari
laktat dehidrogenase.
2. Transferase
Enzim transferase adalah enzim yang ikut serta dalam reaksi pemindahan
(transfer) suatu radikal atau gugus. Enzim yang termasuk dalam golongan ini
3. Hidrolase
pangan, yaitu enzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis suatu substrat atau
4. Liase
Enzim liase adalah enzim yang aktif dalam pemecahan ikatan C-C dan
ikatan C-O dengan tidak menggunakan melekul air. Yang termasuk dalam
5. Isomerase
isomer dari substrat, atau dengan perubahan isomer posisi. Yang termasuk dalam
6. Ligase
bersama atau penggabungan dua molekul substrat dengan partisipasi dari ATP.
jenis reaksi tertentu yang dapat dikatalisis oleh enzim tertentu dan hanya substrat
tertentu yang dapat dikatalisis. Enzim mempunyai sisi aktif, yaitu sisi yang ada
pada enzim yang dapat melakukan fungsi pengarahan, pengikatan, dan katalisis,
yang tidak terdapat pada protein pada umumnya. Sisi aktif enzim pada umunya
berbentuk celah, yang tersusun atas sisa asam amino bagian rantai polipeptida
enzim. Substrat enzim sebelum diurai atau digandengkan harus masuk dulu ke
dalam celah. Dalam hal ini substrat yang masuk ke dalam celah harus memenuhi
beberapa syarat yaitu, komplementer dengan celah dan harus ada bagian yang
pemodelan “lock and key “ dan “induced fit”. Pada pemodelan lock and key sisi
aktif enzim memiliki kesesuaian hanya dengan satu macam substrat saja, sama
seperti dengan kunci yang dapat masuk dengan tepat ke dalam gembok.
Gambar 2.1 Mekanisme kerja enzim model lock and key (Stryer et al., 2002)
spesifik dapat dijelaskan dengan lebih luas. Pada induced fit dijelaskan bahwa
beberapa enzim cukup fleksibel dalam mengubah bentuk dan ukuran sisi aktif
mereka untuk disesuaikan dengan ruang yang diperlukan oleh substrat yang
berbeda. Dengan demikian enzim dan substrat dapat bergabung dan interaksi
Gambar 2.2 Mekanisme kerja enzim model induced fit (Stryer et al., 2002)
terjadinya suatu reaksi. Hal ini karena dalam suatu reaksi enzim bekerja dengan
menurunkan energi aktivasi, yaitu jumah energi dalam kalori yang diperlukan
untuk membawa semua molekul pada 1 mol senyawa pada suhu tertentu menuju
tingkat transisi pada puncak batas energi. Enzim juga mempunyai suatu afinitas
bersifat sementara.
1. Konsentrasi Substrat
Konsentrasi yang tinggi dapat memperbesar laju reaksi. Tapi jika konsentrasi
substrat diperbesar maka tidak akan ada lagi penambahan laju reaksi (Stryer,
2002). Keadaan ini telah dijelaskan oleh Michealis – Menten dengan hipotesis
mereka tentang terjadinya kompleks enzim substrat. Untuk dapat terjadi kompleks
Kontak ini terjadi pada suatu tempat atau bagian enzim yang disebut
bagian aktif. Pada konsentrasi substrat rendah, bagian aktif enzim ini hanya
substrat yang berhubungan dengan enzim pada bagian aktif tersebut. Dengan
demikian konsentrasi kompleks enzim substrat makin besar dan hal ini
substrat tertentu, semua bagian aktif telah dipenuhi oleh substrat atau telah jenuh
2. Suhu
Pada suhu rendah reaksi berlangsung lambat, sedangkan pada suhu yang
tinggi reaksi berlangsung cepat. Disamping itu, karena enzim adalah suatu
Apabila terjadi proses denaturasi, maka bagian aktif enzim akan terganggu dan
3. pH
lingkungannya. Enzim dapat berbentuk ion positif, ion negatif atau ion bermuatan
enzim substrat. Di samping pengaruh terhadap struktur ion pada enzim, pH rendah
atau pH tinggi dapat pula menyebabkan terjadinya proses denaturasi dan ini akan
4. Inhibitor
sebagai katalis dapat terjadi apabila penggabungan substrat pada bagian aktif
enzim mengalami hambatan. Molekul atau ion yang dapat menghambat reaksi
pada umumnya disebabkan oleh terjadinya modifikasi sebuah gugus fungsi atau
lebih yang terdapat pada molekul enzim. Hambatan reversibel dapat berupa
enzim.
secara berurutan, dari ujung non-reduksi suatu polimer atau oligomers, sehingga
Mandels, 1959).
yang dinamakan laminarin dan banyak ditemukan pada dinding sel jamur patogen
(Adams, 2004). Salah satu jamur patogen yang dapat menginfeksi manusia yaitu
C.albicans. Jamur ini merupakan jamur patogen penyebab kandiasis dalam tubuh.
Percobaan yang dilakukan oleh Nett et al. (2007) menunjukkan bahwa kandungan
β-1,3 glukan meningkat pada dinding sel C.albicans dalam bentuk biofilm
dibandingkan dengan sel bebas. Dinding sel C.albicans itu sendiri terdiri dari
inilah yang merupakan struktur yang sangat penting bagi fungsi biologik jamur
bagi membran dan sitoplasma didalamnya. Oleh karena itu, untuk menghambat
(Kirstee et al, 2005). Tanda panah menunjukkan sisi pemotongan enzim terhadap
substrat.
2.3 β-1,3-glukan
2005). Ikatan glikosidik adalah ikatan antara dua molekul monosakarida. Ikatan
ini terbentuk antara gugus hidroksil dari atom C nomor satu yang juga disebut
karbon anomerik dengan gugus hidroksil dan atom C pada molekul gula yang
lain.
kekuatan tarik ke dinding sel jamur (de Nobel et al, 2001). Dinding sel Candida
albicans juga tersusun dari mannoprotein, β-glukan, kitin, komponen protein, dan
lipid ( Bernadus, 2007). Sehingga untuk menekan pertumbuhan dinding sel jamur
Mannoprotein
β-glukan
β-glukan-kitin
Mannoprotein
Membran plasma
Gambar 2.4 Struktur dinding sel C.albicans dengan komponen utama β-
glukan.
Mauritrius dan mungkin juga Afrika timur. Pada tahun 1847 seorang kolektor
Calcutta. Di situ Achatina fulica berkembang baik dan tersebar luas tanpa ada
musuhnya. Di Sumatra dan Jawa hewan ini telah merusak perkebunan karet. Pada
tahun itu juga telah mencapai Taiwan dan disambut hangat orang-orang jepang
Subkingdom : Metazoa
Phyllum : Mollusca
Kelas : Gastropoda
Subkelas : Pulmonata
Ordo : Styllomotophora
Famili : Achatinidae
Genus : Achatina
Kelamin
Saluran
Pencernaan
Mata Insang
Perut
Tentakel Ginjal
Hati
Mulut
Ganglia otak
Tembolok Tali saraf Kaki
Bekicot (Achatina fulica) merupakan salah satu jenis molusca dengan ciri-
ciri umum bertubuh lunak dan terbungkus dalam rumah berkapur yang berasal
dari sekretnya sendiri. Rumah berkapur atau biasa disebut dengan cangkang ini
(Santoso, 1989). Pada bagian kepala terdapat dua tentakel sebagai alat peraba
Bagian bawah kaki terdapat kelenjar yang dapat mengeluarkan lendir pada saat
berjalan. Achatina fulica aktif di waktu malam dan bergerak maju, dengan
gelombang aksi otot-otot pada sisi ventral kaki, di atas bekas lendir yang dibuat
oleh kelenjar kaki di bawah mulut. Dengan radula, tanaman hijau yang lunak dan
tidak berbulu dipegang oleh rahang lalu diparut dengan radula (Radiopoetro,
1988).
fisik dan ketahanan hidup yang tinggi serta mudah berkembang biak di daerah
yang kompleks.
Ingluvies berupa sebuah kantong besar dengan deretan glandulae salivales dalam
enzim diastase, yaitu yang menguraikan hidrat arang. Ingluvies juga berisi cairan
yang berasal dari glandulae digestoriae yang mengalir dari tempat keluarnya
kedalam ventriculus, cairan ini berisi enzim – enzim dan termasuk juga
didalamnya enzim cytase yang mencerna seluosa, seperti halnya pada Helix, yaitu
Enzim cytase tersebut berasal dari bakteri hidup di dalam intestinum dan
ingluives. Enzim ini menghancurkan dinding sel tumbuh- tumbuhan sehingga isi
ventriculus yang berupa kantong yang cukup luas tetapi sederhana,dilingkupi oleh
cabang dan berakhir buntu pada gerombolan sel – sel. Dikenal ada tiga macam
sel, yaitu:
concha. Lanjutan ventriculus ialah intestinum yang berjalan berkelok – kelok yang
berakhir pada rektum yang bermuara keluar melalui anus. Penyerapan hasil – hasil
hemiselulase, amilase, maltase, dan sukrase. Disamping itu, dygestive gland siput
enzim hidrolitik yang terdiri dari enzim β-1,3-glukanase dan enzim β-1,4-
enzim yang menghidrolisis ikatan β-1,3-glukan pada dinding sel jamur patogen
enzim spesifik dari senyawa lain yang tidak dikehendaki. Tahap-tahap pemurnian
tergantung tujuan akhir, apakah untuk tujuan komersial sebagai enzim industri
atau tujuan riset. Untuk kepentingan riset, biasanya enzim perlu dimurnikan
beberapa tahap dengan resiko terjadi kehilangan yang cukup besar (hingga 90%).
berdasarkan sifat kelarutan, ukuran, muatan afinitas pengikatan protein itu sendiri.
Oleh karena itu campuran protein selanjutnya dipisahkan dengan berbagai seri
pemisahan.
enzim yang dikehendaki dari ratusan protein yang mempunyai stuktur kimia dan
biofisika protein. Jumlah protein enzim diakhir proses pemurnian tidak hanya
bergantung pada material awal tetapi juga bergantung pada proses. Ada protein
yang hilang pada setiap pemurnian, oleh karena itu perlu memaksimalkan langkah
kerja sehingga dapat memperoleh enzim yang optimal (Harris dan Angal, 1989)
Harris (1989) menyebutkan ada tiga faktor yang harus diperhatikan dalam
pemurnian enzim yaitu faktor kualitas, kuantitas dan ekonomis. Faktor kualitas
dari protein murni akan menentukan kualitas enzim yang diperlukan sedangkan
ekonomis merupakan kunci penting bila akan dipakai dalam industri atau
Pemurnian enzim dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain dengan
cara pengendapan dalam garam ammonium sulfat (salting out) atau pelarut
lain harga relatif murah, kelarutannya tinggi, pH larutan tidak berubah secara
ekstrem, dan tidak bersifat toksik. Kerugiannya ialah konsentrasi garam yang
pengotor. Pengendapan protein dengan pelarut organik seperti aseton lebih mudah
dan penguapan.
Namun, untuk pemurnian protein lebih mudah menggunakan aseton karena aseton
tidak memilik efek azeotrop seperti etanol. Prinsip kerja dari fraksinasi dengan
protein dengan pelarut organik aseton didasarkan pada sifat yang tidak saling larut
dielektrikum pelarut air dan mengurangi solvasi air terhadap residu hirofilik
enzim. Posisi air di sekitar daerah hidrofobik dari permukaan protein akan
Bagian hidrofobik
Pelarut organik
Gambar 2.6 Agregasi protein karena interaksi antara air dan pelarut
organik (Scopes, 1994).
dilakukan pada suhu dibawah 00C. Pada suhu diatas 100C, akan terjadi
denaturasi.
Perubahan
struktur
Interaksi internal
hidrofobik
Molekul pelarut organik
berinteraki dengan
residu hidrofobik
Pemecahan interaksi
internal hidrofobik
Denaturasi
Gambar 2.7 Proses denaturasi protein jika suhu pelarut organik lebih dari
0oC (Scopes, 1994)
BAB III
METODE PENELITIAN
Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga pada bulan Februari 2012 -
Juli 2012.
glukosa anhidrat, aseton, buffer fosfat, asam sitrat, buffer sitrat, reagen Lowry C,
gelas yang biasa digunakan di laboratorium kimia seperti gelas ukur, gelas arloji,
pipet tetes, pipet volume dll. Alat-alat yang digunakan adalah sentrifugator
blender (Philip), neraca analitik (Kern 870), timbangan (Kern 444-45), water bath,
Achatina fulica
Cairan Pencernaan
Enzim β-1,3-glukanase
Uji Penentuan
Hasil pemurnian parsial
aktivitas kadar
spesifik β- Karakterisasi protein
1,3- Enzim
Data kadar
glukanase
protein
Data aktivitas Penentuan Penentuan
spesifik β-1,3- pH suhu
glukanase optimum optimum
dengan habitat asli Achatina fulica. Proses karantina bertujuan agar Achatina
fulica tersebut berada pada kondisi nutrisi yang sama dengan pemberian sumber
makanan berupa serat seperti kubis, daun singkong dll sehingga kandungan enzim
hidrolase dalam cairan pencernaan Achatina fulica maksimal serta lebih homogen.
Cangkang ekor (apex) Achatina fulica dipecah, cairan yang keluar dari
ekor Achatina fulica ditampung. Cairan ini berasal dari kelenjar pencernaan yang
kecepatan 4000 rpm selama 20 menit. Jika terdapat endapan dan supernatan, maka
Preparat ekstrak kasar enzim dari cairan pencernaan Achatina fulica harus segera
kemudian dilarutkan dalam labu ukur 100 mL akuades dalam labu ukur 100 mL
dibuat pada variasi konsentrasi 2-8 mg/mL. Penentuan kurva standar glukosa
DNS 3 mL, dikocok dan dipanaskan pada penangas air mendidih 100oC selama 15
menentukan jumlah glukosa yang terbentuk, yaitu dengan metode DNS (Asam
pada suhu 37oC selama 10 menit. Hasil Inkubasi ditambahkan dengan 450 µL
DNS lalu tabung diletakkan dalam penangas air mendidih selama 15 menit.
Kemudian segera didinginkan dalam air es selama 20 menit. Gula pereduksi yang
gula pereduksi yang dihitung sebagai glukosa per menit pada kondisi percobaan.
diketahui kadar protein. Aktivitas spesifik adalah total unit aktivitas enzim per
dimulai dari prosentase aseton 0-40% dan 40-75%. Ekstrak enzim β-1,3-
volume aseton sesuai dengan tabel fraksinasi pada lampiran. Setelah penambahan
fraksi selanjutnya.
didapatkan dari fraksinasi masih kecil maka, dilakukan fraksinasi lagi dengan
yang berbeda. Dimungkinkan dalam tahap fraksinasi ini masih belum optimum,
artinya, masih ada enzim yang belum terendapkan pada rentang prosentase aseton.
gram BSA (Bovin Serum Albumin) pada labu ukur 100 ml. Dengan demikian
didapatkan larutan induk dengan konsentrasi 10.000 µg/ml. Dari larutan induk
kemudian dibuat larutan standar dengan variasi konsentrasi 100-500 µg/ml. Dari
di vortex pada suhu ruang selama 5-10 menit. Selesai di vortex kemudian
ditambahkan 0,25 ml larutan D dan di vortex lagi. Setelah 20-30 menit, diukur
pada suhu ruang selama 5-10 menit. Selesai di vortex kemudian ditambahkan 0,25
ml larutan D dan di vortex lagi. Setelah 20-30 menit, diukur absorbansinya pada
menginkubasikan enzim dan substrat laminarin 1 mg/mL pada variasi suhu 300C,
glukanase dengan substrat laminarin 1 mg/mL pada kisaran pH 4-8. Buffer sitrat
Aktivitas enzim dapat dihitung dengan membuat kurva baku glukosa yang
dibuat dari absorbansi pada panjang gelombang 550 nm terhadap kadar glukosa
Y=bx+a
Dengan ketentuan :
Y= absorbansi
b=Kemiringan Kurva
a=intersept
U= (X) x FP
BM X Waktu Inkubasi
Keterangan :
FP = Faktor Pengenceran
BAB IV
Achatina fulica yang digunakan pada penelitian ini didapat dari kota
Kediri, Jawa Timur. Sebelum dilakukan isolasi cairan pencernaan, Achatina fulica
berada pada kondisi nutrisi homogen yang berupa serat seperti kubis, daun
hidrolase dalam cairan pencernaan Achatina fulica dapat maksimal. Hal ini
berdasarkan teori enzim induktif yaitu enzim yang dibentuk karena adanya
pertukaran udara. Kandang dibuat lembab dan terlindung dari cahaya matahari
secara langsung agar sesuai dengan habitat asli Achatina fulica. Kandang juga
harus dalam keadaan bersih agar Achatina fulica berada dalam keadaan steril.
Kelembapan kandang dapat dijaga dengan diberi pelepah pisang atau wadah berisi
air.
dipanen setiap akan dilakukan percobaan agar enzim tidak mengalami penurunan
ekor yang terhubung dengan kelenjar pencernaan. Cairan yang keluar ditampung
pada gelas beker dalam es agar tidak terjadi perubahan aktivitas. Hal ini karena,
aktivitas enzim salah satunya dipengaruhi oleh faktor suhu. Dari 50 ekor Achatina
biomassa sel sehingga harus dipisahkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 4000
dan kerapatan lebih besar daripada protein mengendap , sedangkan protein enzim
digunakan standar glukosa pada variasi konsentrasi 2-8 mg/ml. Pembuatan kurva
digunakan untuk pengukuran aktivitas enzim β-1,3 glukanase sebelum dan setelah
kontrol, sedangkan nilai x merupakan kadar glukosa yang terbentuk dari aktivitas
enzim.
OD λ 550 nm
Glukosa (mg/ml)
inkubasi tertentu. Untuk menentukan waktu inkubasi yang optimal dibuat kurva
progres aktivitas enzim terhadap waktu pada selang waktu 10-50 menit. Kurva
untuk mendapatkan waktu inkubasi yang optimal. Vo didapatkan dari titik saat
kurva berbentuk garis lurus selanjutnya kurva tidak lurus lagi dengan V lebih
12
persatuan waktu maksimal dan meningkat tajam sampai masa inkubasi 10 menit.
Dalam kondisi ini enzim berada pada kecepatan awal (Vo). Pada Gambar 4..2,
nilai slope garis mula-mula tinggi namun slope menurun dimulai menit ke-12.
Setelah waktu 12 menit, kecepatan reaksi enzim menurun dari Vo dan hampir
tidak terbentuk produk lagi. Kecepatan reaksi enzim yang mengalami penurunan
dari Vo ini antara lain dapat disebabkan karena inhibisi enzim oleh produk atau
suhu reaksi enzimatis. Semakin lama waktu inkubasi, produk yang terbentuk akan
menjenuhi enzim. Sedangkan faktor suhu yaitu pada waktu inkubasi yang
semakin lama bagi enzim tertentu dapat mengalami perubahan struktur pada sisi
aktif. Sehingga dari Gambar 4.2 dapat disimpulkan bahwa, waktu inkubasi yang
diperlukan untuk membentuk 1µmol glukosa per menit dalam kondisi percobaan.
Jumlah glukosa yang dihasilkan dalam campuran reaksi berbanding lurus dengan
aktivitas enzim.
menit. Pada proses tersebut terjadi hidrolisis ikatan glikosida β-1,3 pada glukan
menghomogenkan larutan. Jika ada beberapa sampel enzim yang akan ditentukan
reaksi antara substrat dan enzim. Kadar glukosa yang terbentuk ditentukan dengan
menggunakan metode DNS. Hal ini karena, gula pereduksi dapat bereaksi dengan
DNS yang kemudian diukur secara spektrofotometri pada panjang gelombang 550
nm. Reaksi ini dibuktikan dengan adanya perubahan warna larutan dari warna
Gula Pereduksi
adanya gugus aldehid pada glukosa yang tidak lain merupakan suatu gula
pereduksi.
yang berfungi untuk mengurangi pengaruh pengotor berupa glukosa yang dapat
terdeteksi dengan reagen DNS. Komposisi kontrol sama dengan komposisi sampel
tetapi berbeda pada perlakuan. Urutan perlakuan pada komposisi kontrol yaitu
ditambahkan substrat. Hal ini bertujuan supaya enzim menjadi non aktif saat
bereaksi dengan subtrat baru kemudian ditambahkan DNS. Uji aktivitas enzim
kuantitas enzim yang terkandung, akan tetapi penting untuk menentukan aktivitas
spesifik enzim. Protein yang terkandung pada enzim β-1,3 glukanase diukur
pereaksi lain (Folin-Ciocalteau phenol) yang bereaksi dengan residu tyrosine dan
tryptophan dalam protein. Reaksi ini menghasilkan perubahan warna dari kuning
menjadi biru. Semakin banyak kandungan protein pada larutan, semakin biru
serum albumin (BSA). Kurva standar dibuat dari larutan BSA dengan variasi
konsentrasi 100-500 µg/ml dan diukur pada panjang gelombang 750 nm. Dari
kadar protein enzim tahap purifikasi parsial dan ekstrak kasar enzim.
OD λ 750 nm
kasar enzim β-1,3-glukanase. Dalam penelitian ini dipilih aseton sebagai pelarut
organik untuk fraksinasi, karena aseton lebih mudah dipisahkan dari protein yaitu
dielektrikum pelarut dan mengurangi solvasi air terhadap residu hirofilik enzim.
Posisi air di sekitar daerah hidrofobik dari permukaan protein akan digantikan
oleh pelarut aseton dan segera terjadi interaksi hidrofobik. Pengendapan terjadi
dibawah 00C. Pada suhu diatas 100C, akan terjadi denaturasi (Scopes, 1994). Oleh
karena itu, digunakan dry es karena dapat menjaga suhu hingga di bawah 00C.
Pada penelitian ini, penambahan enzim pada aseton dilakukan saat suhu aseton -
sesuai dengan tabel fraksinasi pada lampiran. Kemudian, campuran enzim dan
aseton diaduk dengan pengaduk magnetik stirer selama 7 menit dalam keadaan
rpm selama 20 menit. Suhu dalam sentrifuga adalah -100C sehingga sebelum
campuran enzim dan aseton dimasukkan dalam sentrifuga, suhu sentrifuga harus
aseton dibutuhkan lebih sedikit untuk pengendapan. Pada setiap endapan yang
terbentuk dari fraksinasi hanya mengandung protein, karena biomassa sel dan
enzim awal. Pelarut dan partikel yang relatif lebih kecil berada dalam supernatan.
Endapan protein pada setiap fraksi harus dibebaskan dari aseton, karena
aseton juga dibantu dengan kertas saring steril yaitu dengan meletakkan kertas
dalam aquades sampai tepat larut. Setelah bau aseton hilang kemudian dilakukan
Berdasarkan Tabel 4.1, aktivitas spesifik enzim terbesar pada fraksi 40-75
yaitu 0,1004 U/mg. Namun aktivitas spesifik enzim masih menyebar pada fraksi
0-40 yaitu sebesar 0,087. Untuk mengumpulkan aktivitas enzim pada 1 fraksi
Berdasarkan Tabel 4.2, aktivitas spesifik enzim terbesar pada fraksi 50-
70% yaitu 0,11074 U/mg. Nilai aktivitas spesifik pada fraksi ini lebih besar
percobaan ke-2 aktivitas spesifik enzim masih menyebar pada fraksi 0-50% yaitu
spesifik sebesar 0,113 U/mg, pada fraksi 40-60% hasil aktivitas spesifik sebesar
0,119 U/mg dan pada fraksi 60-80% hasil aktivitas spesifik sebesar 0,0138 U/mg.
Berdasarkan Tabel 4.3, aktivitas spesifik terbesar pada fraksi 40-60%. Aktivitas
spesifik fraksi 40-60% ini lebih besar dari pada aktivitas spesifik terbesar dari
percobaan 2. Jadi, aktivitas enzim sudah lebih terkumpul pada 1 fraksi. Namun,
dilakukan percobaan lagi yaitu dengan fraksi lebih besar dari 40-60% namun lebih
kecil dari 60-80%. Pemurnian parsial dengan fraksinasi aseton memang harus
untuk nilai fraksi selanjutnya harus tepat agar aktivitas enzim dapat meningkat
dan terkumpul dalam 1 fraksi. Sehingga fraksi yang tepat untuk percobaan ke-4
yaitu fraksi 0-45%, 45-70% dan 70-80%. Dari percobaan ke-4 ini diharapkan
fraksi dapat terkumpul pada fraksi 45-70% mengacu dari hasil percobaan ke-3.
sebesar 0,139 U/mg, fraksi 45-70% sebesar 0,2504 U/mg dan fraksi 70-80%
sebesar 0,031 U/mg. Aktivitas spesifik terbesar pada fraksi 45-70%. Dari tiga
percobaan yang sebelumnya, aktivitas spesifik pada fraksi ini paling besar. Pada
fraksi terakhir yaitu 70-80%, aktivitas spesifik sangat kecil dari aktivitas spesifik
parsial enzim β-1,3-glukanase dengan fraksinasi aseton yaitu pada fraksi 45-70%.
Namun, pada fraksi 0-40% masih terdapat aktvitas spesifik enzim β-1,3-
glukanase. Kemungkinan hal ini karena adanya isozim yang merupakan kelompok
enzim yang mengkatalisa reaksi yang sama tetapi berbeda dalam sifat fisik, kimia
dan imunologinya. Enzim dapat membentuk isozim memiliki sifat oligomer yang
terdiri dari 2 atau lebih monomer (subunit). Dengan demikian, pada proses
fraksinasi, isozim yang terdiri dari beberapa monomer terpisah saat pengendapan,
membentuk unit-unit dan menyebar pada fraksi berikutnya. Untuk melihat adanya
isozim ini dapat dengan menggunakan metode zimogram. Nilai aktivitas spesifik
pada hasil fraksinasi lebih besar dari ekstrak kasar yaitu 0,137. Sehingga ada
terjadinya proses denaturasi. Apabila terjadi proses denaturasi, maka bagian aktif
enzim akan terganggu dan dengan demikian aktifitas enzim menjadi berkurang dan
kecepatan reaksinya pun akan menurun. Penentuan suhu optimum enzim dilakukan
pada suhu 300C, 370C, 450C dan 500C. Untuk penentuan suhu optimum prosedurnya
sama seperti penentuan aktivitas enzim, namun berbeda pada suhu inkubasi.
OD λ 550 nm
Suhu (0C)
Laju reaksi enzimatik sangat dipengaruhi suhu. Pada penelitian yang telah
dilakukan, peningkatan suhu dari 300C sampai dengan 370C meningkatkan aktivitas
energi kinetik mempercepat gerak vibrasi, translasi, serta rotasi enzim dan substrat,
kovalen (ikatan hidrogen, ikatan vander waals, interaksi hidrofobik, dan interaksi
sebagai katalis suatu reaksi. Karena merupakan suatu protein, enzim sangat rentan
mengakibatkan aktivitas enzim ikut mengalami perubahan. Karena itu tiap enzim
pH 7 dan pH 8.
OD λ 550 nm
Pada pH ini enzim berada pada tingkat ionisasi yang paling sesuai untuk berikatan
dengan substrat. Konformasi enzim dalam bentuk yang sangat stabil, sehingga
menyusun pusat aktif enzim, dan juga muatan residu-residu asam amino penyusun
denaturasi, sehingga aktivitas yang dihasilkan sangat kecil. Hal ini terjadi ketika
BAB V
5.1 KESIMPULAN
1,81 kali.
ini, nilai aktivitas spesifik enzim β-1,3 glukanase sebesar 0,249 U/mg.
5.2 SARAN
enzim β-1,3 glukanase yang lebih murni. Dengan demikian, enzim β-1,3-
glukanase dapat dimanfaatkan untuk berbagai bidang salah satunya untuk bidang
kesehatan yaitu sebagai alternatif pengobatan anti jamur yang lebih efektif.
DAFTAR PUSTAKA
Adams DJ, 2004, Fungal cell wall chitinases and glucanases, Microbiology.,150:
2029 -2035.
Anggoro M.D, Widyastuti S.M, Margino S, 2005, Isolasi dan karakterisasi β-1,3
glukanase akar semai tusam (Pinus Merkusii Jungh. Et De Vriese) yang
berasosiasi dengan fungi ektomikorisa, Jurnal Perlindungan Tanaman
Indonesia., 11 (2) : 88-95
Bernadus, Janno. B.B, 2007, Respon serologi protein dan mannoprotein membran
sel Candida albicans, BIK Biomed, Departemen Parasitologi Fakultas
Kedokteran Unsrat, Manado., 3(4) : 176-182
Dawn M., Allan M., Collen S, 2008, Biokimia Kedokteran Dasar, Sebuah
Pendekatan Klinis : 98-101
de Nobel H, Sietsma JH, van den Ende H & Klis FM, 2001, Molecular
organization and construction of the fungal cell wall. The Mycota, A
Comprehensive Treatise on Fungi as Experimental Systems for Basic
Applied Research , Springer, New York., 3 : 181-200
Harris ELV, 1989, Concentration of the extract. Didalam harris ELV, Angal S,
Editor Protein purification Methods. Apractical Approach. Oxford : IRL
PC : 125-161.
Kirstee Martin, Barbara M. McDougall, Simon McIlroy, Jayus, Jiezhong Chen &
Robert J. Seviour, 2005, Biochemistry and molecular bioloy of exocellular
fungal β-1,3 and β-1,6 glukanase. Biotechnology Research Centre, La
Trobe University, Bendigo, Victoria., 31 : 168-192
Malek, E.A, 1980, Snail Transmitted Parasitic Disease, CRC Press Inc, Boca Raton
Florida., 1 : 324-334
McMurry J., Mary E. C., 1994, Fundamental of organic and biological Chemistry,
Prentice Hall, New Jerse
Scopes RK, 1994, Protein purification principles and practice, Third edition,
Springer Verlag, New York.
Stryer, Lubert, Berg, Jeremy M., Tyomoczko, John L., 2002, Biochemistry, Fifth
edition, W.H. Freeman and Company, New York.
Voet, Donald and Judith G. Voet, 2004, Biochemistry Volume I, J. Wiley and
Sons, Canada
43,85 6,15 6
19,5 30,5 7
2,65 47,35 8
30,7 19,3 4
24,3 25,7 5
17,9 32,1 6
6,5 43,6 7
0 0.208
5 0.281
10 0.357
20 0.432
30 0.449
40 0.451
50 0.451
Konsentrasi Absorbansi
100 0.443
200 0.833
300 1.317
400 1.66
0,405-0,208 = 0,197
Y= 0,121x – 0,064
0,261 =0,121x
x= 2,157 mg/ml
= 2,157 x 1000
180 x 10 75
= 0,015 U/ml
15.0,015 = 20. N2
N2 = 0,011 U/ml
Kadar protein
Absorbansi sampel protein :
Y= 0,004x + 0,029
0,519= 0,004x
X = 129,75
15.129,75 = 20. N2
Aktivitas spesifik :
Lampiran 5
Data Karakterisasi Enzim β-1,3 Glukanase
Tabel Penentuan Suhu Optimum Aktivitas Enzim β-1,3 Glukanase
SuhuoC Absorbansi
30 0,341
37 0,458
45 0,375
50 0,281
pH Absorbansi
4 0,131
5 0,326
6 0,428
7 0,405
8 0,208