TUGAS FITOKIMIA

“Identifikasi Senyawa Isolat”

KELOMPOK : 5 (LIMA)
KELAS : FARMASI E

SUSI MELINDAH (201310410311052)

CHAIRUL ISA (201310410311064)
REVIANI (201310410311076)
RAISA FATMALA PUTRI (201310410311158)
WENDY NORA MARTIAN (201310410311177)
ACH. KHAIRUL HIDAYAT (201310410311198)
RISA PUSPITA ISWANDARI (201310410311266)
DEWI SUKMALINI (201310410311286)

DOSEN:
Siti Rofida, M.Farm., Apt.

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH MALANG
MARET, 2016
 KATA PENGANTAR

Dengan memanjatkan puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang telah
memberikan rahmat dan karunianya sehingga, penulis dapat menyelesaikan Tugas
Artikel Fitokimia ini dengan baik dan tepat waktu. Sholawat dan salam semoga
senantiasa tercurahkan kepada Nabi Muhammad SAW dan umatnya.

Artikel ini membahas tentang Identifikasi Senyawa Isolat. Adapun tujuan

dari praktikum ini yaitu mahasiswa memahami hal-hal yang berkaitan dengan apa
saja identifikasi yang dilakukan dan bagaimana cara identifikasi senyawa isolate
terutama senyawa dari bahan alam.

Penulis menyadari bahwa artikel ini masih sangat jauh dari kesempurnaan.
Oleh sebab itu, diharapkan saran dan kritik yang bersifat konstruktif demi
kesempurnaan di masa mendatang. Penulis berharap semoga artikel ini dapat
memberikan manfaat khususnya bagi penulis dan bagi pembaca pada umumnya.

Malang, Maret 2016

Penulis

Page | i
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR……………………………………………………….. i
DAFTAR ISI……………………………………...………………………….. ii
IDENTIFIKASI SENYAWA ISOLAT……………………………………... 1
Identifkasi Senyawa Organik Bahan Alam……….………………........ 1
1. Menggunakan Pereaksi Warna……………………………………… 1
2. Identifikasi dengan Menggunakan Metode Kromatografi 2
3. Identifikasi dengan Menggunakan HPLC 5
4. Identifikasi Struktur Molekul Menggunakan Metode Spektroskopi... 7
a. Spektrofotometri Sinar Tampak (UV-Vis) ………………………... 7
b. Spektroskopi Inframerah (IR)………..…………………………….. 10
c. Spektroskopi NMR………..……………………………………….. 12
d. Spektroskopi MS………..…………………………………..……… 15

DAFTAR PUSTAKA………………………………………………………... 17

Page | ii
 IDENTIFIKASI SENYAWA ISOLAT

Tumbuh-tumbuhan merupakan salah satu sumber senyawa alam hayati yang

memegang peranan penting yang digunakan sebagai obat untuk penyakit tertentu
dan merupakan warisan turun temurun dari nenek moyang kita. Bertitik tolak dari
sumber bahan alam hayati yang memiliki peranan penting dalam penyediaan
senyawa-senyawa kimia khususnya bidang obat-obatan maka pemerintah
menghimbau para ahli untuk meningkatkan penelitiannya dalam bidang tersebut,
hal ini merupakan suatu tantangan bagi para ahli untuk melibatkan diri melakukan
penelitian untuk menemukan senyawa-senyawa baru dari tumbuh-tumbuhan
tersebut (Effendi, 1982 dalam Malau 2011).
Perkembangan dalam penelitian bahan alam mengalami kemajuan yang
semakin cepat dengan ditemukannya teknik-teknik pemisahan secara kromatografi
dan penentuan struktur molekul secara spektroskopi pada pertengahan abad ke-20.
Dengan menggunakan metode tersebut beberapa struktur senyawa bioaktif
berhasil ditemukan, misalnya penemuan alkaloid seperti vinblastin dan vinkristin
dari tumbuhan Catharanthus roseus (tapak dara) sebagai obat kanker. Demikian
juga penemuan taksol dari tumbuhan Taxus brevifolia, serta taxoter hasil
modifikasinya yang dapat digunakan sebagai obat kanker kandungan. Hal ini
mendorong perusahaan-perusahaan farmasi untuk mengeksplorasi senyawa-
senyawa bioaktif dari tumbuhan sebagai lead compounds penemuan obat baru.
Prinsip dari pemisahan (isolasi) adalah adanya perbedaan sifat fisik dan
kimia dari senyawa yaitu kecendrungan dari molekul untuk melarut dalam cairan
(kelarutan), kecenderungan molekul untuk menguap (keatsirian), kecenderungan
molekul untuk melekat pada permukaan serbuk labus (adsorpsi, penserapan)
(Harborne, 1987).

Identifkasi Senyawa Organik Bahan Alam

1. Menggunakan Pereaksi Warna
Pengujian kandungan kimia secara kualitatif terhadap ekstrak atau
senyawa murni dapat dilakukan secara sederhana untuk menentukan golongan
senyawa yang diperoleh. Secara rinci beberapa pengujian sederhana yang
dapat dilakukan adalah sebagai berikut :
a. Uji sterol dan triterpenoids: ekstrak methanol dilarutkan dalam kloroform,
disaring dan filtrat diuji untuk sterol dan triterpenoids
1) Uji Salkowski : Beberapa tetes asam sulfat pekat ditambahkan ke
larutan kloroform dan diamati untuk warna merah di lapisan bawah
untuk sterol dan warna kuning keemasan menunjukkan adanya
Triterpenoid.
2) Libermann Buchard test: Beberapa tetesan hidrida asetat ditambahkan
ke dalam larutan kloroform, kocok dan teteskan 1 ml asam sulfat
pekat dengan hati-hati ditambahkan dari sisi tabung reaksi. Jika

Page | 1
 berwarna coklat kemerahan menunjukkan adanya sterol dan cincin
merah menunjukkan adanya triterpenoid.
b. Uji alkaloid: 0,5 g ekstrak diencerkan secara terpisah untuk 10 ml dengan
alkohol asam, direbus dan disaring. 5 ml ditambahkan 2 ml encer amonia.
5 ml kloroform ditambahkan dan kocok dengan lembut untuk mengekstrak
alkaloid. Lapisan kloroform diekstraksi dengan 10 ml asam asetat, dan
dibagi dalam 3 bagian, dan diuji sebagai berikut:
1) Uji Dragendroff : (kalium nitrat- bismut): Beberapa tetes larutan
Dragendroff ditambahkan ke dalam larutan kloroform, endapan coklat
kemerahan menunjukkan adanya alkaloid.
2) Uji Mayer : (Kalium iodida- merkuri) : Beberapa tetes reagent Mayer
ditambahkan ke dalam larutan kloroform , jika terbentuk endapan
putih menunjukkan adanya alkaloid.
3) Uji Wagner : (Yodium- kalium iodida dalam) : Beberapa tetes larutan
Wagner ditambahkan ke dalam larutan kloroform, jika terbentuk
endapan coklat menunjukkan adanya alkaloid.
c. Uji Saponin: Foam Test : Untuk 0.5 g ekstrak ditambahkan 5 ml air suling
dalam tabung reaksi. Larutan dikocok dengan kuat dan diamati
terbentuknya buih yang stabil. Buih itu dicampur dengan 3 tetes minyak
zaitun dan dikocok dengan kuat setelah itu diamati untuk pembentukan
emulsi.
d. Uji flavonoid : sampel dilarutkan dalam pelarut yang sesuai, sebanyak 2
ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan tambahkan beberapa tetes
larutan FeCl3, apabila terbentuk warna ungu menunjukkan positif
terhadapa flavonoid.

2. Identifikasi dengan Menggunakan Metode Kromatografi

Kromatografi adalah proses yang digunakan untuk memisahkan substansi
campuran menjadi komponen-komponen untuk dilakukan analisis, identifikasi
pemurnikan, dan/atau pengukuran senyawa. Hal ini sangat berguna diterapkan
untuk ekstrak biologis kompleks. Analisis, pemisahan dan pemurnian senyawa
organik dari campuran kompleks diperlukan dalam industri kimia atau dalam
penelitian fitokimia. Metodologi yang digunakan untuk memisahkan dan
mengisolasi zat sangat penting dalam kimia.

 Pengaplikasian Kromatografi
1. Analisis : Untuk menguji campuran, komponen dan hubungan di
antara senyawa.
2. Identifikasi : Untuk menentukan identitas dari campuran atau
komponen berdasarkan pada komponen dikenal.

Page | 2
 3. Pemurnian : Untuk memisahkan komponen dengan mengisolasi
senyawa yang menarik (diinginkan).
4. Kuantifikasi : Untuk menentukan jumlah satu atau lebih komponen
yang ditemukan dalam sampel.

Kromatografi adalah metode pemisahan fisika-kimia dengan fase gerak

(larutan pengembang yang cocok), dan fase diam (bahan berbutir). Dalam
kromatografi, molekul dari sampel memiliki interaksi yang berbeda terhadapt
fase diamnya dan bermigrasi di atasnya, yang mengarah ke perpisahan
mereka. Analit, yang memiliki lebih afinitas terhadap fase gerak akan
bergerak lebih cepat, sedangkan, yang memiliki afinitas yang lebih tinggi
untuk fase diam bergerak lebih lambat. Dengan cara ini, berbagai jenis
molekul dapat dipisahkan satu sama lain ketika mereka bergerak melalui fase
diam. Analit (Zat) yang memiliki afinitas yang sama dengan fase diam akan
cenderung tertahan dan nilai Rf-nya paling kecil.
Rf merupakan indikasi kuantitatif
seberapa jauh senyawa tertentu perjalanan
dalam pelarut tertentu pada fase diam yang
diberikan. Jika nilai Rf dari senyawa yang
tidak diketahui dekat, atau sama dengan nilai
Rf dari senyawa yang dikenal, maka dua
senyawa yang paling mungkin sama atau
identik. Rf didefinisikan sebagai rasio antara
jarak yang ditempuh oleh Pusat dari titik
(komponen sampel) dan jarak secara simultan
perjalanan dengan fase gerak.

Rf = b/a

Hal yang dilakukan pertama kali adalah mempersiapkan Chamber.

Page | 3
 Chamber harus disegel dengan baik dan harus cukup besar untuk tempat
plat yang akan dikembangkan. Hal ini juga harus bersih dan kering sebelum
digunakan. Pelarut mengembangkan ditempatkan dalam ruang chamber.
Pelarut benar-benar harus menutupi bagian bawah ruang untuk kedalaman
sekitar 0,5 cm. Kemudian, ruang chamber ditutup dan jangan sampai
terguncang. Ruang ini terus tertutup sehingga penguapan tidak mengubah
komposisi mengembangkan campuran pelarut. Setelah 15 menit, ruangan akan
jenuh dengan uap pelarut.

 Interpretasi Hasil
Nilai Rf dari masing-masing tempat harus dihitung dan karakteristik
masing-masing senyawa diperhatikan. Nilai Rf yang diperoleh bisa
dibandingkan dengan zat yang diketahui nilai Rf dan karakteristik senyawa
pembanding untuk membantu dalam identifikasi senyawa. Jika hal diatas
tidak didapatkan hasil, pengidentifikasian sampel harus ditentukan dengan
teknik lain, seperti mengukur titik leleh sampel atau dengan mengukur
spektrum resonansi magnetik nuklir.

 Multi-dimensi Chromatography
Dalam kromatografi planar, kromatografi dua dimensi berguna untuk
memisahkan campuran kompleks senyawa yang sama, misalnya, asam
amino, peptida, karbohidrat, steroid dan banyak senyawa organik lainnya .
Teknik ini memberikan cara mudah untuk memisahkan komponen
campuran. Prosedur untuk multi – dimensi kromatografi adalah sebagai
berikut :
1. Totolkan sampel di sudut kanan kromatogram.
2. Kertas atau plat direndam dalam pelarut seperti ditunjukkan pada
Gambar A.
3. Plat dieluasi dengan fase gerak yang sesuai.
4. Kemudian didapatkan spek noda yang saling bertumpukan pada satu
titik pada fase diam (plat). (Gambar B). Setiap senyawa bermigrasi
pada tempat yang sama mencerminkan kedekatan karakteristik pada
masing-masing senyawa
5. Kemudian putar lembaran plat 90° searah jarum jam seperti yang
ditunjukkan pada Gambar C dan lakukan eluasi kedua dengan
menggunakan pelarut yang berbeda.
6. Identitas setiap tempat dapat ditentukan dengan membandingkan
posisinya dengan posisi yang ditempati oleh zat yang diketahui dalam
kondisi yang sama.

Page | 4
3. Identifikasi dengan Menggunakan HPLC (Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi)
Kromatografi cair kinerja tinggi, lebih dikenal sebagai HPLC, adalah
yang paling banyak digunakan untuk tujuan studi analisis dalam produk alami
dan juga dalam industri farmasi, kosmetik dan makanan, dibandingkan dengan
menggunakan Gas Chromatography (GC). Alasannya adalah fleksibilitas dan
perlakuan analisis sampel yang diperlukan relatif sederhana. sementara GC
mengharuskan semua analit menjadi stabil, HPLC hanya membutuhkan analit
menjadi larut dalam fase gerak (Snyder et al., 1997). HPLC dilakukan paling
sering pada suhu kamar atau pada suhu tidak lebih tinggi dari 45ºC.
Karakteristik ini sangat cocok untuk analisis sampel alam, dengan dua
pengecualian besar, studi fraksi yang mudah menguap seperti minyak esensial
dan lipid. Dalam kasus pertama, berat senyawa non-polar praktis mustahil
untuk dideteksi dengan detektor yang tersedia di pasar. Dalam kasus kedua,
mengingat sifat dari fraksi lipid-terutama trigliserida atau ester lainnya, asam
lemak-efisiensi diperlukan untuk memisahkan komponen dari campurannya
hanya dapat diberikan oleh GC. Pada bidang lain di mana HPLC memiliki
keterbatasan parah dalam mendeteksi insektisida atau herbisida-
organophosphorous atau diklorinasi yang tidak dapat dideteksi baik sebagai
konsekuensi dari tingkat toleransi rendah dan/atau respon yang rendah untuk
sebagian besar detektor.

Page | 5
Kegunaan HPLC :
1. Pemisahan sejumlah seny.organik, anorganik, maupun seny.biologis
2. Analisis ketidakmurnian (impurities)
3. Analisis senyawa tdk mudah menguap (non volatile)
4. Penentuan molekul netral, ionik, maupun zwitter ion
5. Isolasi dan pemurnian senyawa
6. Pemisahan senyawa yang strukturnya hampir sama
7. Pemisahan senyawa dalam jumlah sekelumit (trace elements)
8. Menetapkan kadar senyawa tertentu

 Basics of HPLC Separation

Pemisahan kromatografi instrumental biasanya divisualisasikan oleh
plotting dari kromatogram, yang bisa dilakukan oleh pena-perekam
sederhana, tapi umumnya saat ini oleh beberapa sistem pengolahan data
(Lee, 2000). Dalam grafik ini, respon detektor diplot terhadap waktu
daripada volume elusi, dan senyawa eluting akan muncul sebagai puncak,
puncak yang dianggap sebagai waktu retensi (tR) yang mengidentifikasi
zat dengan cara yang sama bahwa retensi faktor (Rf) digunakan dalam
kromatografi planar.

 Resolusi Sistem kromatografi

Keandalan pemisahan kromatografi tergantung pada kemampuan metode
untuk menarik pemisahan analit dari setiap komponen lain dari campuran,
sebagai tujuan akhir, atau, lebih tepatnya, untuk dapat memberikan
jaminan yang memadai untuk kemurnian puncak menarik sistem deteksi
yang sedang digunakan. Hal ini terkait dengan Resolusi yang dapat
didefinisikan sebagai karakteristik pemisahan dua puncak yang berdekatan.
Hal ini dapat dihitung dari kromatogram menggunakan persamaan
dijelaskan di bawah.

 Komponen instrumen HPLC

Page | 6
 1. Wadah fase gerak
2. Sistem penghantaran fase gerak = Pompa
3. Alat utk memasukkan sampel
4. Kolom
5. Detektor
6. Wadah penampung buangan fase gerak
7. Tabung penghubung
8. Suatu komputer atau integrator atau perekam

4. Identifikasi Struktur Molekul Menggunakan Metode Spektroskopi

Elusidasi struktur molekul senyawa organic merupakan tahapan
terpenting dari penggunaan analisis spektroskopi modern. Dalam elusidasi
struktur molekul untuk menentukan struktur senyawa hasil sintesis jauh lebih
mudah dari pada elusidasi senyawa hasil isolasi. Oleh karena itu analisis
struktur molekul dari hasil sintesis sudah dapat diprediksi struktur molekulnya
berdasarkan reaktan yang digunakan serta mekanisme reaksinya. Sedangkan
dalam elusidasi struktur molekul senyawa hasil isolasi relatif lebih rumit,
karena struktur molekul yang sangat banyak kemungkinannya. Untuk
mempermudah analisis struktur senyawa hasil isolasi biasanya diperlukan
pengetahuan sebelumnya mengenai keragaman struktur senyawa yang telah
diperoleh dari tumbuhan yang memiliki kekerabatan yang dekat, misalnya
merupakan tumbuhan dalam genus atau famili yang sama. Biasanya senyawa
yang ditemukan dari tumbuhan dalam satu genus atau famili memiliki
hubungan kekerabatan senyawa metabolit sekundernya. Selanjutnya sebagai
tambahan informasi untuk mempermudah dalam analisis struktur senyawa
hasil isolasi juga diperlukan data sifat fisik, seperti kelarutan, tidak leleh,
maupun jenis pelarut yang digunakan dalam proses pemisahan.
Metode spektroskopi yang biasanya digunakan untuk identifikasi struktur
yang biasa digunakan antara lain:

a. Spektrofotometri Sinar Tampak (UV-Vis)

Spektrofotometri Sinar Tampak (UV-Vis) adalah pengukuran energi

cahaya oleh suatu sistem kimia pada panjang gelombang tertentu (Day,
2002). Spektroskopi UV-Vis digunakan untuk identifikasi adanya gugus
kromofor (fenolik, ikatan rangkap, dll.). Sinar ultraviolet (UV) mempunyai
panjang gelombang antara 200-400 nm, dan sinar tampak (visible)

Page | 7
mempunyai panjang gelombang 400-750 nm. Pengukuran
spektrofotometri menggunakan alat spektrofotometer yang melibatkan
energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga
spektrofotometer UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif
dibandingkan kualitatif. Konsentrasi dari analit di dalam larutan bisa
ditentukan dengan mengukur absorban pada panjang gelombang tertentu
dengan menggunakan hukum Lambert-Beer (Rohman, 2007).
Spektrofotometri merupakan salah satu metode dalam kimia analisis
yang digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara
kuantitatif dan kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi
dengan cahaya. Peralatan yang digunakan dalam spektrofotometri disebut
spektrofotometer. Septroskopi UV didasarkan pada penyerapan radiasi
UV-Vis dengan molekul, yang menyebabkan perpindahan beberapa
elektron baru dari basal menjadi keadaan energi positif. Spektrum
penyerapan UV-Vis dari konstituen tanaman dapat diukur dalam larutan
yang sangat encer terhadap larutan blanko menggunakan spektrofotometer
perekam otomatis. Spektrofotometri UV-Vis biasanya digunakan untuk
identifikasi senyawa tertentu. Salah satunya adalah phenylpropanoids.
Phenylpropanoids termasuk hydroxycoumarins, phenylpropenes dan
lignan. phenylpropanoids dapat diidentifikasi dengan pengukuran spektral
Misalnya, asam caffeic dan turunannya memiliki penyerapan karakteristik
UV di 243 nm dan 326 nm, dengan baku UV 300 nm. Hydroxycoumarins
menyerap pada panjang gelombang lebih panjang dari asam sinamat;
aesculetin, yang coumarin yang berkaitan dengan asam caffeic, memiliki
serapan pada 230, 260, 303 dan351 nm. Pengukuran besaran pergeseran
batokromik (bergeser lagi panjang gelombang) pada larutan alkali juga
bermanfaat untuk membedakan asam sinamat dan coumarin. Selain itu
bisa digunakan mengidentifikasi Senyawa flavonoid, Quinon, antrakinon
dan lain-lain.

Instrument Spektrofotometri UV-VIS

Prinsip Kerja

Page | 8
 Cahaya yang berasal dari lampu deuterium maupun wolfram yang
bersifat polikromatis di teruskan melalui lensa menuju ke monokromator
pada spektrofotometer dan filter cahaya pada fotometer. Monokromator
kemudian akan mengubah cahaya polikromatis menjadi cahaya
monokromatis (tunggal). Berkas-berkas cahaya dengan panjang tertentu
kemudian akan dilewatkan pada sampel yang mengandung suatu zat dalam
konsentrasi tertentu. Oleh karena itu, terdapat cahaya yang diserap
(diabsorbsi) dan ada pula yang dilewatkan. Cahaya yang dilewatkan ini
kemudian di terima oleh detector. Detector kemudian akan menghitung
cahaya yang diterima dan mengetahui cahaya yang diserap oleh sampel.
Cahaya yang diserap sebanding dengan konsentrasi zat yang terkandung
dalam sampel sehingga akan diketahui konsentrasi zat dalam sampel
secara kuantitatif.

Hal-Hal Yang Perlu Diperhatikan

1. Larutan yang dianalisis merupakan larutan berwarna
Apabila larutan yang akan dianalisis merupakan larutan yang tidak
berwarna, maka larutan tersebut harus diubah terlebih dahulu menjadi
larutan yang berwarna. Kecuali apabila diukur dengan menggunakan
lampu UV.
2. Panjang gelombang maksimum
Panjang gelombang yang digunakan adalah panjang gelombang
yang mempunyai absorbansi maksimal. Hal ini dikarenakan pada
panjang gelombang maksimal, kepekaannya juga maksimal karena pada
panjang gelombang tersebut, perubahan absorbansi untuk tiap satuan
konsentrasi adalah yang paling besar. Selain itu disekitar panjang
gelombang maksimal, akan terbentuk kurva absorbansi yang datar
sehingga hukum Lambert-Beer dapat terpenuhi. Dan apabila dilakukan
pengukuran ulang, tingkat kesalahannya akan kecil sekali.
3. Kalibrasi Panjang gelombang dan Absorban
Spektrofotometer digunakan untuk mengukur intensitas cahaya
yang dipancarkan dan cahaya yang diabsorbsi. Hal ini bergantung pada
spektrum elektromagnetik yang diabsorb oleh benda. Tiap media akan
menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu tergantung pada
senyawa yang terbentuk. Oleh karena itu perlu dilakukan kalibrasi
panjang gelombang dan absorban pada spektrofotometer agar
pengukuran yang di dapatkan lebih teliti.

b. Spektroskopi Inframerah (IR)

Page | 9
 Spektroskopi inframerah adalah sebuah metode analisi instrumentasi
pada senyawa kimia yang menggunakan radiasi sinar infra merah.
Spektroskopi inframerah berguna untuk mengetahui gugus fungsi yang
terdapat pada senyawa organik. Spektrofotometer infra merah terdiri atas
lima bagian utama, yaitu sumber radiasi, wadah sampel, monokromator,
detektor dan rekorder.
Bila suatu senyawa diradiasi menggunakan sinar infra merah, maka
sebagian sinar akan diserap oleh senyawa, sedangkan yang lainnya akan
diteruskan. Serapan ini diakibatkan karena molekul senyawa organik
mempunyai ikatan yang dapat bervibrasi. Vibrasi molekul dapat dialami
oleh semua senyawa organic, namun ada beberapa yang tidak terdeteksi
oleh spektrometri IR. Masing-masing ikatan akan mempunyai sifat yang
khas. Setiap serapan pada panjang gelombang tertentu menggambarkan
adanya suatu gugus fungsi spesifik. Yang menjadi parameter kualitatif
pada spektrofotometer IR adalah bilangan gelombang dimana muncul
akibat adanya serapan oleh gugus fungsi yang khas dari suatu senyawa.
Pada umumnya identifikasi suatu senyawa didasarkan oleh vibrasi
bengkokan, khususnya goyangan (rocking), yaitu yang berada di daerah
bilangan gelombang 2000-400 cm-1. Karena di daerah antara 400–2000
cm-1 merupakan daerah yang khusus yang berguna untuk identifkasi gugus
fungsional. Daerah ini menunjukkan absorbsi yang disebabkan oleh
vibrasi regangan. Dalam daerah 2000–400 cm-1 tiap senyawa organik
mempunyai absorbsi yang unik, sehingga daerah tersebut sering juga
disebut sebagai daerah sidik jari (fingerprint region). Daerah finger print
ini untuk setiap senyawa tidak akan ada yang sama sehingga merupakan
identias dari suatu senyawa. Berikut adalah contoh serapan yang khas dari
beberapa gugus fungsi :

Page | 10
 Contoh spectrum infra merah dari asam etanoat

c. Spektroskopi NMR

Page | 11
 Fenomena Resonansi Magnetik Inti (RMI) atau nucleic magnetic
resonance (NMR) pertama kali diperkenalkan pada tahun 1946 oleh dua
kelompok fisikawan yang bekerja secara terpisah, yaitu Edward Purcell
dari Harvard University dan Felix Bloch dari Standford University.
Spektrofotometri NMR adalah salah satu teknik utama yang
digunakan untuk mendapatkan informasi fisik, kimia, elektronik dan
tentang struktur molekul. Spektrofotometri NMR pada dasarnya
merupakan spektrofotometri absorbsi, sebagaimana spektrofotometri infra
merah maupun spektrofotometer ultraviolet. Pada kondisi yang sesuai,
suatu sampel dapat mengabsorpsi radiasi elektromagnetik daerah frekuensi
radio, pada frekuensi yang tergantung dari sifat-sifat sampel. Suatu plot
dari frekuensi puncak-puncak absorbsi versus intensitas puncak
memberikan suatu spektrum NMR.
NMR digunakan untuk menentukan struktur dari komponen alami dan
sintetik yang baru, kemurnian dari komponen, dan arah reaksi kimia
sebagaimana hubungan komponen dalam larutan yang dapat mengalami
reaksi kimia. Spektroskopi NMR merupakan alat yang dikembangkan
dalam biologi structural. Dasar dari spektroskopi NMR adalah absorpsi
radiasi elektromagnetik dengan frekuensi radio oleh inti atom. Frekuensi
radio yang digunakan berkisar dari 0,1 sampai dengan 100 MHz. Bahkan,
baru-baru ini ada spektrometer NMR yang menggunakan radio frekuensi
sampai 500 MHz.
Inti proton (atom hidrogen) dan karbon (karbon 13) mempunyai sifat-
sifat magnet. Bila suatu senyawa mengandung hidrogen atau karbon
diletakkan dalam bidang magnet yang sangat kuat dan diradiasi dengan
radiasi elektromagnetik maka inti atom hidrogen dan karbon dari senyawa
tersebut akan menyerap energi melalui suatu proses absorpsi yang dikenal
dengan resonansi magnetik. Absorpsi radiasi terjadi bila kekuatan medan
magnet sesuai dengan frekuensi radiasi elektromagnetik.
Pada Spektroskopi 1H NMR digunakan untuk menentukan jumlah dan
lingkungan proton (atom H dalam senyawa), dan Spektroskopi 13C NMR
untuk menentukan jumlah atom karbon dalam senyawa.

Page | 12
Komponen pada Spektrofotometer NMR
Instrumen NMR terdiri atas komponen-komponen utama berikut:
a. Magnet
Akurasi dan kualitas suatu alat NMR tergantung pada kekuatan
magnetnya. Resolusi akan bertambah dengan kenaikkan kekuatan
medannnya, bila medan magnetnya homogen elektromagnet dan
kumparan superkonduktor (selenoids). NMR beresolusi tinggi dan
bermagnet superkonduktor dengan frekuensi proton 470 MHz.
b. Generator medan magnet penyapu
Suatu pasangan kumparan terletak sejajar terhadap permukaan
magnet, digunakan untuk mengubah medan magnet pada suatu range
yang sempit.
c. Sumber frekuensi radio
Sinyal frekuensi oskilasi radio (transmiter) disalurkan pada
sepasang kumparan yang possinya 90º terhadap jalar dan magnet.
Suatu oskilator yang tetap sebesar 60, 90 atau 100 MHz digunakan
dalam NMR beresolusi tinggi.
d. Detektor sinyal
Sinyal frekuensi radio yang dihasilkan oleh inti yang beresolusi
dideteksi dengan kumparan yang mengitari sampel dan tegak lurus
terhadap sumber. Sinyal listrik yang dihasilkan lemah dan biasanya
dikuatkan dulu sebelum dicatat.
e. Perekaman (Rekorder)
Pencatat sinyal NMR disinkronisasikan dengan sapuan medan,
rekorder mengendalikan laju sapuan spektrum. Luas puncak dapat
digunakan untuk menentukan jumlah relatif inti yang mengabsorpsi.
f. Tempat sampel dan kelengkapannya (Tempat sampel dan probe)
Tempat sampel merupakan tabung gelas berdiameter 5mm dan dapat
diisi cairan sampai 0,4 ml. Probe sampel terdiri atas tempat kedudukan
sampel, sumber frekuensi penyapu dan kumparan detektor dengan sel
pembanding. Detektor dan kumparan penerima diorientasikan pada
90º. Probe sampel menggelilingi tabung sampel pada ratusan rpm
dengan sumbu longitudinal.

Untuk NMR beresolusi tinggi, sampel tidak boleh terlalu kental.

Biasanya digunakan konsentrasi larutan 2-15%. Pelarut yang baik unutk
NMR sebaiknya tidak mengandung proton seperti CS2, CCl4 . Pelarut –
pelarut berdeuterium juga sering digunakan seperti CDCl3 atau C6D6.
Prinsip Kerja Spektrofotometer NMR

Page | 13
 Metode spektroskopi jenis ini didasarkan pada penyerapan energi oleh
partikel yang sedang berputar di dalam medan magnet yang kuat. Energi
yang dipakai dalam pengukuran dengan metode ini berada pada daerah
gelombang radio 75-0,5 m atau pada frekuensi 4-600 MHz, yang
bergantung pada jenis inti yang diukur. Inti yang dapat diukur dengan
NMR yaitu :
a. Bentuk bulat
b. Berputar
c. Bilangan kuantum spin = ½
d. Jumlah proton dan netron ganjil, contoh : 1H, 19F, 31P, 11B, 13C

Di dalam medan magnet, inti aktif NMR (misalnya 1H atau 13C)

menyerap pada frekuensi karakteristik suatu isotop. Frekuensi resonansi,
energi absorpsi dan intensitas sinyal berbanding lurus dengan kekuatan
medan magnet.

Kegunaan Spektrofotometer NMR

Banyak informasi yang dapat diperoleh dari spektra NMR. Pada
umumnya metode ini berguna sekali untuk mengidentifikasi struktur
senyawa atau rumus bangun molekul senyawa organik. Meskipun
spektroskopi infra merah juga dapat digunakan untuk tujuan tersebut,
analisis spektra NMR mampu memberikan informasi yang lebih lengkap.
Dampak spektroskopi NMR pada senyawa bahan alam sangat penting. Ini
dapat digunakan untuk mempelajari campuran analisis, untuk memahami
efek dinamis seperti perubahan pada suhu dan mekanisme reaksi, dan
merupakan instrumen tak ternilai untuk memahami struktur dan fungsi
asam nukleat dan protein. Teknik ini dapat digunakan untuk berbagai
variasi sampel, dalam bentuk padat atau pun larutan.

d. Spektroskopi MS

Page | 14
 Spektroskopi massa adalah suatu metode untuk mendapatkan berat
molekul dengan cara mencari perbandingan massa terhadap muatan dari
ion yang muatannya diketahui dengan mengukur jari-jari orbit
melingkarnya dalam medan magnetik seragam.

Instrumentasi Spekstroskopi massa

a. Sumber Ion
Setelah melewati rangkaian gas kromatografi, sampel gas yang akan
diuji dilanjutkan melalui rangkaian spekstroskopi massa. Molekul-
molekul yang melewati sumber ion ini diserang oleh elektron, dan
dipecah menjadi ionion positifnya. Tahap ini sangatlah penting karena
untuk melewati filter, partikel-partikel sampel haruslah bermuatan.
b. Filter
Selama ion melulai rangkaian spekstroskopi massa, ion-ion ini melalui
rangkaian elektromagnetik yang menyaring ion berdasarkan perbedaan
masa. Para ilmuwan memisahkan komponen-komponen massa untuk
kemudian dipilih yang mana yang boleh melanjutkan yang mana yang
tidak (prinsip penyaringan). Filter ini terus menyaring ion-ion yang
berasal dari sumber ion untuk kemudian diteruskan ke detektor.
c. Detektor
Ada beberapa tipe detektor yang biasa digunakan. Kehadiran ion dan
elektron dapat dideteksi oleh detektor. Seluruh detektor ditutup dalam
oven yang lebih panas dibanding dengan temperatur kolom. Hal itu
menghentikan kondensasi dalam detektor. Hasil detektor akan direkam
sebagai urutan puncak-puncak; setiap puncak mewakili satu senyawa
dalam campuran yang melalui detektor.

Prinsip Kerja Spektroskopi Massa

Page | 15
 Sampel cair diuapkan dalam vakum di dalam wadah yang dipanaskan
dan uap itu dimasukkan ke dalam ruang pengionan. Sampel padat
dimasukkan kedalam ruang pengionan dengan meletakkannya pada ujung
alat pemasukan sample (Insertion probe).
Umumnya spektrum massa diperoleh dengan mengubah senyawa
suatu sample menjadi ion-ion yang bergerak cepat yang dipisahkan
berdasarkan perbandingan massa terhadap muatan.
Spektroskopi massa mampu menghasilkan berkas ion dari suatu zat
uji, memilah ion tersebut menjadi spektum yang sesuai dengan
perbandingan massa terhadap muatan dan merekam kelimpahan relatif tiap
jenis ion yang ada. Umumnya hanya ion positif yang dipelajari karena ion
negative yang dihasilkan dari sumber tumbukan umumnya sedikit.

Selain menggunakan identifikasi seperti yang telah dijelaskan diatas, dalam

elusidasi struktur molekul yang kompleks baik senyawa hasil sintesis maupun
isolasi tidak cukup hanya menggunakan data spektroskopi UV, IR, 1H NMR, 13C
NMR, dan MS, tetapi masih diperlukan data spektroskopi NMR dua dimensi
seperti HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence), HMBC
(Heteronuclear Multiple Bond Connectivity), 1H-1H COSY (Homonuclear
Correlated Spectroscopy), maupun NOESY (Nuclear Overhauser Effect
Spectroscopy). Spektroskopi dua dimensi HMQC dapat digunakan untuk
mengetahui proton-karbon dengan jarak satu ikatan, sehingga dapat diketahui
karbon yang mengikat proton dan karbon yang tidak mengikat proton.
Spektroskopi HMBC dapat mengetahui proton-karbon dengan jarak dua atau tiga
ikatan, sehingga dapat digunakan untuk mengetahui karbon-karbon tetangga yang
memiliki jarak dua sampai tiga ikatan dengan suatu proton tertentu. Untuk
mengetahui proton-proton yang berdampingan digunakan data spektroskopi 1H-
1H COSY, sedangkan untuk mengetahui struktur konfigurasi cis-trans digunakan
data spektroskopi NOESY. Dengan menggunakan data spektroskopi dua dimensi
elusidasi struktur menjadi semakin mudah dan secara tepat dapat menentukan
kerangka struktur molekul senyawa organik serumit apapun.
Dalam elusidasi struktur molekul biasanya dimulai dari data yang paling
sederhana, misalnya spektroskopi UV (kalau ada), selanjutnya IR, analisis data 1H
NMR dan 13C NMR, dengan memperhatikan data massa molekul dari
spektroskopi MS. Dari data-data tersebut biasanya sudah dapat memprediksi
struktur kerangka senyawa yang dianalisis, ada kemungkinan memiliki beberapa
alternatif struktur. Selanjutnya untuk menentukan struktur yang paling sesuai
dibuktikan dengan data fragmentasi dari spektroskopi MS.

DAFTAR PUSTAKA

Page | 16
Khopkar, S.M.. 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik, UI-Press, Jakarta.
Narwal, S.S. 2009. Isolation, Identification and characterization of
Allelochemicals/Natural Products. Haryana Agricultural University Hisar,
India.
Sastrohamidjojo, H., 1994. Spektroskopi Resonansi Magnetik Inti (Nuclear
Magnetic Resonance, NMR). Liberty, Yogyakarta.
Pavia, Donald L., Gary M. Lampman, George S. Kritz, Randall G. Engel
(2006). Introduction to Organic Laboratory Techniques (4th Ed.).
Thomson Brooks/Cole. pp. 797–817.
Skoog, Douglas A., Donald M. West, F. James Holler. 1991.  Fundamental of
Analytical Chemistry. Seventh Edition. New York: Saunders College
Publishing.
Atun, S. 2014. Metode Isolasi dan Identifikasi Struktur Senyawa Organik Bahan
Alam. Jurusan Pendidikan Kimia, FMIPA, Universitas Negeri Yogyakarta.

Page | 17