GENETIKA MOLEKULER ° DAN APLIKASINYAGENETIKA MOLEKULER DAN APLIKASINYA Dr. Siti Gomo Attas, M.Hum, Desain cover ‘Zahra Muthmainnah, Solihin, $.Pd. Sumber frcep m fata Tetak : Amira Dzatin Nabila Ukuran = vii, 75 him, Uk: 15.5x23 cm ISBN : 978-623-7022-86-2 ISBN Bilektronis : 978-623-209.018-7 Cotakan Pertama: Desember 2018 Hak Cipta 2018, Pada Peaulis Ts diltar tanggung jawab percetakan ‘Copyright © 2018 by Deepublish Publisher Al Right Reserved Hak cipta dilindungi undang-undang Dilarang keras menerjemabkan, memfotokopi, atau ‘memperbanyak sebagian atau sclueuh isi buku ini tanpa izin tertulis dari Penesbit. PENERBIT DEEPUBLISH (Grup Penerbitan CV BUDI UTAMA) Anggota IKAPI (076/DIY/2012) JhRajawali, G. Blang 6, Ne 3, Drono, Sardonoharjo, Ngagliy Sleman .Kaliurang Kin.9,3 — Yogyakarta 55581 Telp/ aks: (0274) 4533427 Websit yww.decpublish.co.id www penerbitdecpublish.com Hi-mail: es@decpublish.co.idISOLASI DNA GENOM (TUMBUHAN DAN “/! DNA (DeoxyriboNucleic Acid) merupakan asam nukleat pembawa Pesan genetik dalam kehidupan. Informasi genetik terletak di dalam inti Sel dan tersusun rapi membentuk kromosom. Pola DNA penyusun kromosom inilah yang menentukan karakteristik sifatijenis rambut, warna kulit dan sifat-sifat khusus yang berbeda antara satu individu dengan lainnya DNA ditemukan pertama kali pada tahun 1869. Melalui teknologi X- ray diketahui bahwa DNA memiliki struktur yang tertata secara rapi dan memiliki model rantai ganda DNA yang dipublikasikan deh Watson dan Crick di jurnal Nature pada tahun 1953. Sejak itu, teknik pemurnian DNA mengalami perkembangan yang pesat dan menjadi prosedur rutin yang dilakukan didalam penelitian molekuler diberbagai bidang DNA terletak didalam sel. Oleh karena itu untuk mendapatkan DNA diperlukan tahap khusus yang biasanya dilakukan di laboratorium tertentu. Untuk mengeluarkan DNA dari sel maka teknik pemurnian DNA secara biokimia dilakukan dengan cara metusak dinding sel Menggunakan larutan bufer tententu dan campuran berbagai jenis deterjen. Dengan terbukanya lapisan membran sel maka DNA dapat dikeluarkan dan diendapkan dengan penambahan alkohol. finsip kerja isolasi dan purifikasi DNAterdiri atas 5 tahap yaitu: pemecahan membran sel, penghilangan protein, penghilangan RNA, presipitasi DNA, pengukuran kemurnian dan kuantitas DNA Gurzycki, 2003), ‘ Genetika Molekuler dan Aplikasinya O7 (27'yTRIAGE RISC MR 398th ee 9 7 g 3 2 3 5 i 3 a £ n ac eRe et ad weg w & — TERNIK><— aye Mayes es =ALQA 39.17.121 Bknik Biolog’ Molekular © Dr, Iman Permana Maksum dkk. Fenyunting, Adnan Abi Wildan Cover, Adlhan Nury ‘Ojo! MASA Diterbitkan oleh ALQAPRINT JATINANGOR Ang gota Ikapi Nomor 006/33.4/99 Jalan Cibeusi Kawasan Pendidikan Jatinangor ‘Telp, (022) 878 33 6744081312247263 ‘Sumedang 45363/ Bandung 40600 ‘e-mail algaprint@yahoo co id slgaprintjatinangor@ gmail com ‘Cetakan Penama, Shafar 1439 H/Oktober 2017ISOLASI, PERBANYAKAN, DAN KARAKTERISASI DNA 1.1 IsoLast DNA olekul DNA dapat diisolasi dari berbagai organisme sebagai sumber DNA, yang dimulai dari kelompok sel cukariot, seperti: manusia, hewan, dan tumbuhan, juga sampai ke sel prokariot, seperti bakteri dan juga virus. Pada manusia dan hewan terdapat dua bentuk DNA yaitu DNA kromosom yang berlokasi di inti sel dan DNA mitokondria yang berlokasi di organel mitokondria, sedangkan pada tanaman terdapat bentuk tambahan DNA lainnya yaitu DNA kloroplas yang terdapat di organel kloroplas. Pada bakteri terdapat dua bentuk DNA yaitu DNA kromosom dan DNA plasmid. iTeoax Bota! Mausxuiae Dalam melakukan lisis kita harus mempertimbangkan beberapa hal, antara lain: 1. Pemahaman tentang organisasi sel organisme tertentu (sebagai sumber DNA). 2. Pemahaman tentang struktur dan komposisi dan dinding sel organisme tertentu. 3. Pemahaman tentang bagaimana cara memecahkan yang efektif dan aman untuk reaksi selanjutnya. 4. Konsep perlindungan molekul DNA hasil lisis dari aktivitas nuklease selama proses lisis. 5. Konsep menghilangkan kemungkinan adanya inhibitor untuk reaksi PCR pada sumber DNA, contoh menghilangkan Fe- heme dengan Tris-EDTA (TE) pada isolasi DNA dari sel darah sampai diperoleh sel limfosit (Gambar 1.1). mia membran SAMPEL DARAH 200 ml. sampel darah © + 1000 mL bufer TE, vortex © Sentrifugasi 12.000 pm (1 menit) PELET PUTIH Gambar 1.1 Prosedur penghilangan inhibitor dari sel darah.Sampel darah dicuci beberapa kali oleh bufer Tris-EDTA (TE) sampai diperoleh pelet putih yang merupakan sel limfosit. Uraian di atas dapat dijelaskan lebih dalam contoh komposisi bufer lisis berikut ini: bufer Tris-HCI, EDTA, detergen (Tween-20, Triton X100, Nonidet P40 atau SDS (sodium dodecyl sulfate), enzim Proteinase K, Selulase, atau Lisozim. Detergen digunakan untuk merusak susunan fosfolipid bilayer (lipid) dari membran sel, membran inti sel, atau membran mitokondria. Enzim proteinase K digunakan m2untuk menghidrolisis secara enzimatik protein membran. Enzim selulase digunakan untuk menghidrolisis ikatan f-1,4 glikosidik struktur selulosa dinding sel tanaman. Enzim lisozim digunakan untuk menghidrolisis ikatan B-1,4 glikosidik NAM-NAG (N-asetilmuramat- N-asetilglukosamin) pada struktur peptidoglikan dinding sel bakteri. Reaksi enzimatik perlu dipertahankan dengan sistem bufer pada pH tertentu sesuai dengan pH optimal untuk kerja enzim tersebut. EDTA ditambahkan untuk menginaktivasi enzim nuklease dengan cara mengkhelat logam Mg™ sebagai pusat aktif dari enzim tersebut, sehingga DNA tetap utuh. Pemahaman tentang penggunaan pereaksi lisis yang efektif dan aman untuk reaksi selanjutnya adalah dalam pemilihan detergen yang efektif untuk lisis tetapi aman untuk keperluan PCR. Sebaiknya detergen yang digunakan adalah detergen non ionik seperti tween-20, triton X100, nonidet P40, sedangkan penggunaan SDS sebaiknya harus diperhatikan konsentrasi yang tepat untuk lisis tetapi tidak menyebabkan denaturasi enzim DNA polimerase pada proses PCR. Isolasi DNA plasmid dapat dilakukan dengan metode miniprep, yaitu untuk isolasi sejumlah kecil DNA plasmid (~1 pg/mL) dengan cara lisis alkali (Birnboim dan Doly, 1979) dan prosedur pendidihan cepat (rapid and boiling procedure) (Holmes and Quigley, 1981), atau pemurnian kromatografi yang tersedia secara komersil (Qiagen, Pharmacia, Promega, dll). Metode miniprep lebih efisien dibandingkan metode maxiprep (menggunakan gradien cesium klorida atau kolom kromatografi), screening transforman yang lebih cepat melalui penguraian restriksi DNA yang diisolasi. Jika klon target ditemukan, sejumlah besar DNA dapat diisolasi dengan metode maxiprep.