Makalah Dasar-dasar Rekayasa Genetik

TRANSFORMASI DNA REKOMBINAN KE DALAM SEL

Kelompok III

Sri Restyati H031191018

Ismi Sri Rahayu H031191019

Fia Apriani Fatrial H031191020

Marhama p. H031191022

Wahidah H031191023

Alfiyah Nur’aini Musyahadah H031191025

DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2021
 KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat dan

hidayah-Nya sehingga kami dapat menyelesaikan tugas makalah yang berjudul

“Tranformasi DNA Rekombinan ke dalam Sel” ini tepat pada waktunya. Adapun

tujuan dari penulisan dari makalah ini adalah untuk memenuhi tugas dosen pada

mata kuliah Dasar-dasar Rekayasa Genetik. Selain itu, makalah ini juga bertujuan

untuk menambah wawasan tentang transformasi DNA rekombinan ke dalam sel

bagi para pembaca dan juga bagi penulis. Kami mengucapkan terima kasih kepada

Ayahanda Dr. Abdul Karim, M.Si yang telah memberikan tugas ini sehingga

dapat menambah pengetahuan dan wawasan sesuai dengan bidang studi yang

kami tekuni. Kami juga mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang

telah membagi sebagian pengetahuannya sehingga kami dapat menyelesaikan

makalah ini. Kami menyadari, makalah yang kami tulis ini masih jauh dari kata

sempurna. Oleh karena itu, kritik dan saran yang membangun akan kami nantikan

demi kesempurnaan makalah ini.

 DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL .......................................................................................... i

KATA PENGANTAR ........................................................................................ ii

DAFTAR ISI ....................................................................................................... iii

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang ....................................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah ................................................................................. 1

1.3 Tujuan Penulisan ................................................................................... 2

1.4 Manfaat Penulisan ................................................................................. 2

BAB II PEMBAHASAN

2.1 Pengertian Teknologi DNA Rekombinan ............................................ 3

2.2 Pengertian Transformasi DNA ............................................................. 3

2.3 Vektor Kloning ....................................................................................... 3

2.5 Komponen Kloning ................................................................................ 5

2.5 Tahapan-Tahapan Kloning ................................................................... 13

2.6 Transformasi Pada Sel Non Bakteri .................................................... 18

2.7 Aplikasi dan Dampak dari Teknologi DNA Rekombinan ................. 18

BAB III KESIMPULAN .................................................................................... 21

DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 22

 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Bioteknologi merupakan cabang ilmu yang mempelajari pemanfaatan

makhluk hidup maupun produk dari makhluk hidup. Pada abad ke-21,

perkembangan bioteknologi semakin pesat. Perkembangan ini tidak lepas dari

peran para ilmuan yang mengembangkan berbagai Teknik bioteknologi. Salah

satu Teknik bioteknologi modern yang sering didengar antara lainteknik kultur

jaringan dan rekayasa genetic atau yang biasa dikenal dengan Teknik DNA

rekombinan (Galih, 2018).

Rekayasa genetik merupakan teknik untuk menghasilkan molekul DNA

yang berisi gen baru yang diinginkan atau kombinasi gen-gen baru atau dapat

dikatakan sebagai manipulasi organisme. Hal ini bertujuan untuk memindahkan

gen yang dikehendaki untuk mengembangkan dan memperbaiki sifat tanaman,

hewan dan makhluk hidup lain. Teknik DNA Rekombinan melibatkan upaya

perbanyakan gen tertentu didalam suatu sel yang bukan sel alaminya

sehingga sering pula dikatakan sebagai kloning gen. Sedangkan

transformasi adalah proses masuknya molekul DNA asing dalam protoplas atau

sel inang yang mengakibatkan perubahan materi genetika (Gillian dkk., 2010).

1.2 Rumusan Masalah

Rumusan masalah dari penulisan makalah ini adalah:

1. Apa pengertian DNA rekombinan?

2. Apa saja komponen kloning?

3. Apa saja tahapan DNA rekombinan?

4. Apa pengertian dari transformasi DNA rekombinan?

5. Apa pengaplikasian dan dampak dari DNA rekombinan?

1.3 Tujuan Penulisan

Adapun tujuan dari penulisan makalah ini adalah:

1. Mendeskripsi pengertian DNA rekombinan.

2. Menguraikan komponen kloning.

3. Menguraikan tahapan DNA rekombinan.

4. Mendeskripsi pengertian transformasiDNA rekombinan.

5. Mendeskripsikan pengaplikasian dan dampak dari DNA rekombinan.

1.4 Manfaat Penulisan

Adapun penulisan makalah dapat menambah wawasan dan pengetahuan

mengenai transformasi DNA rekombinan ke dalam sel, pengaplikasian serta

dampak dari DNA rekombinan yang secara teoritis dipelajari di bangku

perkuliahan.
 BAB II

PEMBAHASAN

2.1 Pengertian Teknologi DNA Rekombinan

Teknologi DNA rekombinan merupakan teknik penggabungan DNA dari

spesies yang berbeda sehingga akan diperoleh organisme baru dengan sifat-sifat

yang diinginkan. Secara garis besar, teknologi DNA rekombinan (rekayasa

genetika) melibatkan penyisipan informasi genetik baru ke dalam organisme,

biasanya bakteri, untuk memberikan kemampuan baru. Metode ini tidak

mengikuti rangkaian prosedur yang pasti. Pemilihan metode bergantung kepada

gen mana yang akan dipindahkan dan jenis organisme mana yang akan menerima

informasi genetik baru (Noviendri, 2007).

2.2 Pengertian Transformasi DNA

Transformasi DNA merupakan salah satu metode untuk memasukkan

DNA ke dalam sel bakteri. Metode transformasi saat ini dipakai secara luas untuk

mentransfer plasmid yang mengandung bahan genetika (Bernadus dkk., 2019).

Secara alami plasmid dapat dipindahkan ke sel inang baru melalui proses

konjugasi atau dengan cara lain, yaitu plasmid dimasukkan ke dalam bakteri yang

dibuat kompeten, sehingga untuk sementara dinding sel bersifat permiabel dan

dapat dilewati molekul DNA kecil, proses itulah yang disebut dengan proses

transformasi (Artama, 1991 dalam Noviendri, 2007).

2.3 Vektor Kloning

Kloning adalah proses mengkombinasikan beberapa DNA dan

memperbanyak DNA rekombinan tersebut di dalam sel. Sejak ditemukannya

enzim restriksi (enzim yang dapat memotong DNA pada urutan yang spesifik) dan

ditemukannya enzim ligase (enzim yang dapat menyambungkan potongan DNA),

maka DNA dari organisme apa saja dapat diisolasi, dipotong-potong,

disambungkan kembali dan dipindahkan ke organisme lain. Proses pemindahan

DNA ke dalam sel disebut transformasi dan sel yang dihasilkan disebut

transforman. Agar suatu DNA dapat diperbanyak di dalam sel, maka DNA

tersebut harus disisipkan ke dalam suatu plasmid (berfungsi sebagai

vektor/pembawa) yang dapat bereplikasi di dalam sel. Kumpulan sel-sel yang

mengandung plasmid rekombinan yang sama disebut sebagai suatu klon. Pada

kloning gen, suatu fragmen DNA yang mengandung gen yang akan di klon

disisipkan pada molekul DNA vektor untuk menghasilkan molekul DNA

rekombinan (Muthiadin, 2014).

Kloning melibatkan lima komponen utama, yaitu : fragmen DNA (gen)

yang akan di kloning (disebut juga DNA sisipan), DNA vektor (bisa plasmid,

bakteriofaga atau cosmid), enzim restriksi, enzim ligase dan sel inang (bakteri

atau ragi) (Muthiadin, 2014).

Gambar 1. Proses Kloning

2.4 Komponen Kloning

Gambar 2. Komponen kloning

 DNA sisipan

Tujuan kloning adalah memperbanyak suatu fragmen DNA dari suatu

organisme dalam suatu sel inang. Namun tujuan akhirnya bisa bermacam-

macam, diantaranya: produksi protein penting dengan skala besar, untuk

deteksi patogen atau sel abnormal. Menurut (Muthiadin, 2014) DNA sisipan

bisa diperoleh dengan dua cara, yaitu :

1. Produk PCR.

2. Fragmen DNA hasil pemotongan dengan enzim restriksi

 DNA Vektor

Vektor merupakan suatu mulekul DNA sirkular yang bertindak sebagai

wadah untuk membawa DNA sisipan masuk ke dalam sel inang dan

bertanggung jawab atas replikasinya (Muthiadin, 2014). Sejumlah vektor

dari prokariotik, eukariotik dan vektor sintesis telah banyak digunakan

dalam sistem kloning DNA. Secara garis besar ada 4 vektor yang sering
digunakan dalam proses pengklonan gen (sebagai vektor kloning), yaitu

plasmid, fage, kromosom buatan dari khamir (YAC = yeast artificial

chromosome) dan kosmid (Noviendri, 2007). Menurut (Muthiadin, 2014)

berdasarkan fungsinya vektor dapat dibagi dua, yaitu :

1. Vektor kloning. Vektor kloning hanya berfungsi untuk

memperbanyak fragmen DNA yang disisipkan, sehingga fragmen

DNA tersebut hanya direplikasi, tidak di transkripsi. Biasanya vektor

ini digunakan untuk tujuan sekuensing atau untuk perbanyakan DNA

yang nantinya akan di sisipkan ke vektor ekspresi. Vektor kloning

harus memiliki situs pengenalan endonuklease restriksi, dimana

informasi genetik dapat disisipkan. Selain itu, menurut (Noviendri,

2007) beberapa vektor kloning telah direkayasa untuk mengandung

suatu situs kloning ganda atau dikenal multiple cloning site (MCS),

yang masing-masing mengandung beberapa situs restriksi yang

berbeda. Karakteristik penting yang harus dimiliki oleh suatu vektor

kloning adalah: (1) stabil dalam sel inang, (2) mengandung gen

resistensi antibiotik tertentu, sehingga memudahkan seleksi dari gen

rekombinan (Artama, 1991 dalam Noviendri, 2007), (3) memiliki

titik ori (sebagai titik awal replikasi), sehingga bisa bereplikasi atau

multiplikasi sendiri. Dengan kata lain, plasmid tersebut dapat

berbiak autonom (Marx, 1991 dalam Noviendri, 2007) serta dapat

mengontrol replikasinya sendiri, (4) memiliki daerah restriksi atau

MCS, yang dapat dipotong dengan enzim restriksi endonuklease

tertentu (Artama, 1991 dalam Noviendri, 2007), (5) berukuran kecil,

 (6) dipotong pada situs tunggal oleh endonuklease restriksi, (7) tidak

ditransfer dengan konjugasi, (8) cirinya dengan mudah dideteksi,

dan (9) dengan mudah diisolasi dari sel.

2. Vektor ekspresi digunakan untuk memproduksi protein dari gen

yang diklon. Vektor ekspresi merupakan vektor yang mana

disamping dapat bereplikasi sendiri juga mengandung sinyal-sinyal

ekspresi, sehingga gen yang di klon juga akan ditranskripsi menjadi

mRNA dan kemudian ditranslasi menjadi protein. Vektor ekspresi

memungkinkan untuk produksi protein hewan, manusia atau

tanaman di dalam bakteri. Tiga sinyal ekspresi yang paling penting

adalah : (1) Promotor transkripsi, (2) terminator transkripsi, dan (3)

tempat pengikatan ribosom. Selain sistem vektor ekspresi untuk

bakteri, juga terdapat beberapa sistem vektor ekspresi untuk

Saccaromyces cerevisiae dan vektor ekspresi untuk Pichia pastoris.

Kedua jenis sistem ekspresi ini terbukti dapat memproduksi protein

eukariot dengan hasil yang tinggi dan berfungsi seperti protein natif

(asli) (Muthiadin, 2014).

 Plasmid

Plasmid merupakan DNA rantai ganda yang berbentuk sirkular dan terdapat

bebas di dalam sel. Plasmid dapat bereplikasi sendiri di dalam sel inang

karena mempunyai suatu urutan DNA spesifik yang disebut ori (origin of

replication/titik awal replikasi). Plasmid hampir selalu membawa satu gen

atau lebih yang menyebabkan ciri-ciri penting yang ditunjukkan oleh bakteri

inang, misalnya plasmid yang membawa gen resistan antibiotik. Banyak

 spesies bakteri mempunyai plasmid, tetapi plasmid yang digunakan dalam

teknologi DNA rekombinan bukan plasmid dalam bentuk alami, melainkan

yang sudah direkayasa. Plasmid tersebut telah diberi sisi pengenalan

beberapa enzim restriksi agar dapat disisipi dengan DNA asing. Plasmid

juga telah diberi dua gen marker, satu gen diperlukan untuk mendeteksi

dengan mudah adanya plasmid di dalam sel, dan gen yang kedua diperlukan

untuk mendeteksi adanya DNA asing (Muthiadin, 2014). Menurut

(Noviendri, 2007) berdasarkan kemampuan memperbanyak diri secara

alami maka plasmid dapat dibagi dua, yaitu: (1) plasmid stringent, yaitu

plasmid dengan kontrol replikasi ketat, dimana hanya terdapat 1 kopi

plasmid tiap genom bakteri, (2) plasmid relaxed, yaitu plasmid dengan

kontrol replikasi yang tidak begitu ketat, sehingga dalam satu sel dapat

dijumpai 1-20 kopi plasmid (Artama, 1991 dalam Noviendri, 2007). Tipe

plasmid ini berguna untuk penelitian DNA rekombinan karena memiliki

jumlah kopi yang banyak (high copy number). Plasmid ini bereplikasi tidak

tergantung pada replikasi DNA kromosom sel inang (Nicholl, 1994 dalam

Noviendri, 2007). Sedangkan stringent control (pengendalian yang kuat)

memperbanyak diri dengan kecepatan yang hampir sama dengan kromosom

selnya, dan terdapat hanya dalam satu atau beberapa kopi plasmid per sel.

Jumlah kopi ini menunjukkan jumlah molekul plasmid masing-masing

ditemukan dalam satu sel bakteri (Brown, 1991 dalam Noviendri, 2007).

 Bakteriofag

Bakteriofag merupakan virus yang menginfeksi bakteri. Bakteriofag

mempunyai struktur yang sangat sederhana, hanya terdiri dari satu molekul
 DNA atau RNA yang membawa sejumlah gen, dan dikelilingi oleh selubung

atau kapsid yang disusun oleh molekul protein. Pada proses infeksi bakteri

oleh faga, partikel fage melekat pada bagian luar bakteri dan memasukkan

DNA kromosomnya ke dalam sel. Molekul DNA fage kemudian

mengadakan replikasi, gen-gen fage mengatur sintesis protein komponen

kapsid. Partikel-partikel fage yang baru kemudian dirakit dan dilepaskan

dari bakteri. Sama seperti plasmid, DNA fage yang digunakan dalam

teknologi DNA rekombinan sudah dimodifikasi dengan penambahan sisi

restriksi. Perbedaanya dengan plasmid, bakteriofage dapat menampung

fragmen DNA dengan ukuran yang lebih besar (Muthiadin, 2014).

 Kosmid

Kosmid merupakan vektor yang dikonstruksi dengan menggabungkan kos

dari DNA l dengan plasmid. Kemampuannya untuk membawa fragmen

DNA sepanjang 32 hingga 47 kb menjadikan kosmid lebih menguntungkan

daripada fag l dan plasmid (Muthiadin, 2014).

 Fasmid

Selain kosmid, ada kelompok vektor sintetis yang merupakan gabungan

antara plasmid dan fag l. Vektor yang dinamakan fasmid ini membawa

segmen DNA l yang berisi tempat att. Tempat att digunakan oleh DNA l

untuk berintegrasi dengan kromosom sel inang pada fase lisogenik

(Muthiadin, 2014).

 Vektor YACs

Seperti halnya kosmid, YACs (yeast artifisial chromosomes atau kromosom

buatan dari khamir) dikonstruksi dengan menggabungkan antara DNA

 plasmid dan segmen tertentu DNA kromosom khamir. Segmen kromosom

khamir yang digunakan terdiri atas sekuens telomir, sentromir, dan titik

awal replikasi. YACs dapat membawa fragmen DNA genomik sepanjang

lebih dari 1 Mb. Oleh karena itu, YACs dapat digunakan untuk mengklon

gen utuh manusia, misalnya gen penyandi cystic fibrosis yang panjangnya

250 kb. Dengan kemampuannya itu YACs sangat berguna dalam pemetaan

genom manusia seperti yang dilakukan pada Proyek Genom Manusia

(Muthiadin, 2014).

 Enzim Restriksi

Digunakan untuk memotong DNA. Pada tahun 1960, Werner Arber &

Hamilton Smith menemukan enzim dari mikroba yang dapat memotong

DNA utas ganda. Enzim tersebut dikenal dengan nama enzim restriksi atau

endonuklease restriksi. Enzim tersebut mengenal dan memotong DNA pada

sekuens spesifik yang panjangnya 4 sampai 6 pasangan basa. Secara alami,

bakteri menghasilkan enzim restriksi untuk menghancurkan DNA fage yang

menginfeksinya (yang masuk ke dalam sel bakteri) (Tjaholeksono, 2016).

Endonuklease restriksi adalah enzim bakteri yang mengenal sekuen

nukleotida spesifik dalam suatu molekul DNA double-stranded, dan

memisahkan DNA pada lokasi tersebut. Enzim-enzim ini memotong DNA

ke dalam fragmen-fragmen dari berbagai ukuran, tergantung dari jumlah

waktu situs pengenalan enzim yang berulang dalam molekul. Endonuklease

restriksi merupakan enzim yang umumnya diisolasi dari mikroorganisme

prokariotik (Artama, 1991 dalam Noviendri, 2007). Menurut Brown (1991

dalam Noviendri, 2007), bahwa ada tiga jenis endonuklease restriksi yang
telah dikenal. Ketiga enzim tersebut masing-masing dibedakan oleh cara

kerjanya yang agak berbeda satu sama lain. Endonuklease tipe I dan III agak

kompleks dan hanya mempunyai peran yang sangat terbatas dalam rekayasa

genetika. Di lain pihak, endonuklease restriksi tipe II adalah enzim

pemotong yang begitu penting dalam rekayasa genetika (kegiatan kloning

gen). Endonuklease tipe II yang digunakan dalam eksperimen kloning

memiliki panjang sekuen pasangan basa pengenalan dari 4 sampai 8

nukleotida. Enzim ini dinamai berdasarkan sumber spesies bakteri asal

isolasinya. Sebagai contoh, endonuklease restriksi EcoRI artinya adalah

enzim restriksi pertama yang diisolasi dari bakteri Escherichia coli strain R,

dan enzim HindIII artinya, enzim restriksi ketiga yang diisolasi dari bakteri

Haemophilus influenzae strain D. Sejak awal tahun 1970an, kira-kira sudah

300 jenis enzim restriksi telah ditemukan (Prentis, 1990). Enzim restriksi ini

memiliki dua sifat yang membuatnya sangat bermanfaat. Sif at pertam a

adalah kekhususannya. Dalam hal ini tiap enzim mengenal dan memotong

hanya urutan nukleotida tertentu pada DNA. Sifat kedua adalah kemampuan

sebagian mereka untuk menghasilkan potongan runcing atau dikenal dengan

ujung bangku/ujung lengket (sticky ends) ketika mereka memotong DNA

yang beruntai ganda (Marx, 1991 dalam Noviendri, 2007). Kebanyakan

endonuklease restriksi akan berfungsi secara memadai pada pH 7,4 dan

dalam kekuatan ionik, biasanya NaCl serta semua endonuclease restriksi

tipe II membutuhkan Mg2+ untuk berfungsi (Brown, 1991; Artama, 1991

dalam Noviendri, 2007). Selain itu aktivitas endonuklease tipe II ini

seringkali dipacu pula oleh senyawa pereduksi seperti 2-merkaptoetanol

 atau ditiotretiol (Suhartono, 1989 dalam Noviendri, 2007). Membuat kondisi

yang tepat untuk aktivitas enzim adalah penting misalnya konsentrasi NaCl

atau Mg2+, apabila tidak tepat maka kondisi tersebut dapat menyebabkan

tidak saja penurunan aktivitas, tetapi dapat juga mengubah spesifisitas

enzim, sehingga pemotongan DNA terjadi pada urutan pengenal tambahan

yang tidak baku.

Gambar 3. Beberapa enzim restriksi dan situs pengenalannya

 Enzim Ligase

Digunakan untuk menyambung DNA. Pada tahun 1972, David Jackson,

Robert Simon, dan Paul Berg melaporkan bahwa mereka berhasil membuat

molekul DNA rekombinan. Mereka berhasil menggabungkan fragmen-

fragmen DNA dengan cara memasangkan (anneal) ujung sticky ends dari

satu fragmen dengan ujung sticky ends fragmen lainnya, kemudian

menyambungkan kedua ujung fragmen-fragmen tersebut secara kovalen

dengan mengunakan enzim DNA ligase. Keberhasilan membuat DNA

rekombinan ini terjadi tidak lama setelah enzim restriksi ditemukan dan
 diisolasi pertama kali dari E.coli oleh Hertbert Boyes yaitu pada tahun 1969

(Tjaholeksono, 2016).

2.5 Tahapan-Tahapan Kloning

Menurut (Muthiadin, 2014) tahapan pengerjaan 16kloning DNA/gen adalah

sebagai berikut :

1. Isolasi/ Preparasi DNA

Sebelum disisipkan ke suatu DNA vektor, maka DNA sisipan harus

diisolasi terlebih dulu. Selain itu DNA sisipan juga dapat diperoleh dari

produk PCR.

2. Pemotongan DNA dengan Enzim Restriksi

Molekul plasmid yang digunakan sebagai vektor harus dipotong untuk

membuka DNA lingkaran, sehingga molekul DNA asing bisa disisipkan.

Enzim restriksi merupakan suatu endonuklease yang mengenal urutan

spesifik pada molekul DNA dan memotong pada urutan yang spesifik

tersebut. Sisi pengenalan enzim restriksi umumnya merupakan suatu

polindrom, dimana urutan nukleotida rantai atas sama dengan urutan

nukleotida rantai bawah. Misalnya, enzim restriksi hanya terdapat pada

beberapa bakteri, dan berfungsi untuk mempertahankan diri dari infeksi

bakteriofaga. Contoh beberapa enzim restriksi dan sisi pengenalannya:

 Gambar 4. Enzim Restriksi

3. Penyambungan DNA dengan enzim ligase

Apabila dua molekul DNA mpunyaiujung rantai tunggal yang

komplementer, maka kedua ujung DNA tersebut dapat berpansangan,

kemudian enzim ligase dapat membentuk ikatan fosfodiester antara kedua

molekul DNA tersebut. Reaksi enzimatik ini memerlukan energi dari ATP.

Gambar 6. Penyambungan dengan enzim ligase

4. Transformasi Plasmid ke Sel Inang

Transformasi merupakan salah satu kemampuan bakteri untuk mengambil

DNA asing ke dalam sel. Kemampuan ini dimanfaatkan oleh peneliti

untuk memperbanyak suatu gen. Gen yang telah diinsersikan ke dalam

plasmid dimasukkan ke dalam bakteri dengan metode transformasi

(Brown, 2010). Transformasi yang terjadi pada DNA rekombinan dalam

plasmid ini tidak terjadi secara alami, melainkan harus diinduksi oleh zat-

zat tertentu. Sel bakteri yang telah mengalami suatu perlakuan fisik

sehingga dapat memperoleh kemampuan untuk mengambil DNA asing

adalah sel kompeten (Brown, 2010). Selain itu, sel kompeten ini juga

dapat mengambil DNA plasmid sirkuler. Sel biasa hanya dapat melakukan

transformasi DNA linier (Sword, 2003). Salah satu metode sederhana

untuk membuat sel menjadi kompeten (siap untuk ditransformasi) dengan

cara merendam sel bakteri ke dalam larutan garam dalam kondisi dingin,

contohnya kalsium klorida (CaCl2). Larutan garam ini dapat mengikat

DNA dan komponen lipopolisakarida dari dinding sel bakteri yang

bermuatan negatif, sehinga DNA terikat dengan dinding sel bakteri. Selain

itu, larutan lain yang dapat digunakan untuk pembuatan sel kompeten

adalah polietilene glikol (Sword, 2003). Transformasi dapat dilakukan

dengan beberapa cara, yaitu heatshock atau kejutan panas, elektroporasi

(Casali dan Preston, 2003), dan coldshock atau kejutan dingin (Ng, 2009).

Metode kejutan panas merupakan metode transformasi yang paling mudah

dilakukan dibandingkan metode lainnya. Metode ini menggunakan prinsip

kejutan suhu, yaitu 42℃, selama 90 detik (Hanahan dkk., 1983) atau 120
detik sehingga dinding sel bakteri terbuka dan plasmid dapat masuk dalam

sel (Sambrook dan Russel, 2001). Proses transformasi kejutan panas yang

terjadi pada sel bakteri pada dilihat pada Gambar 7. (Brown, 2010).

Gambar 7. Transformasi kejutan panas (Sumber : Brown, 2010)

Keterangan : Bakteri normal diberi perlakuan CaCl2 akan menjadi sel

kompeten. Ketika diberi kejutan panas, plasmid yang menempel pada

dinding sel bakteri akan masuk ke dalam sel.

Tranformasi kejutan panas memerlukan persiapan sel yang siap

ditransformasi atau sel kompeten. Sel kompeten dibuat dalam kondisi

dingin 4℃, sehingga terjadi kejutan suhu pada sel kompeten ketika

ditempatkan pada suhu 42℃. Sel kompeten dibuat dengan cara merendam

sel dalam larutan garam klorida, seperti CaCl2, MnCl2, dan MgCl2, untuk

meningkatkan permeabilitas membran sel sehingga plasmid dapat masuk

ke dalam sel (Brown, 2010). Sel kompeten yang diberikan kejutan panas

42℃ tetap hidup karena mengekspresikan protein kejutan panas, yaitu

heat-shock proteins (HSPs). Protein ini akan diekspresikan oleh sel apabila

sel dalam kondisi stress suhu (Arsene dkk., 2000). Secara umum, protein

kejutan panas dapat dikelompokkan menjadi tujuh kelompok berdasarkan

fungsinya, yaitu chaperon molekuler (protein pelipat), organisasi sel,

 transport dan detoksifikasi, degradasi protein, metabolism dan regulasi sel

(Ritcher dkk., 2010). Ekspresi respon kejutan panas Escherichia coli diatur

oleh faktor sigma-32 yang dikode oleh gen rpoH. Faktor ini akan berikatan

dengan promoter kejutan panas pada lokasi upstream dari gen kejutan

panas. Ketika kejutan panas terjadi, ekspresi faktor sigma-32 akan

meningkat sehingga ekspresi gen ini juga semakin banyak (Strauss dkk.,

1987). Gen rpoH dalam kondisi normal dieskpresikan oleh satu promoter,

sedangkan dalam kondisi stress suhu, gen ini akan diaktifkan oleh tiga

promoter. Akibatnya, ekspresi gen rpoH pun akan meningkat dari 50

molekul menjadi 30000 molekul (Yoo, 2010). Protein kejutan panas

bersifat sebagai chaperone, sehingga dapat melipat protein-protein lain

dalam sel, sehingga protein sel tidak rusak ketika terkena paparan panas

(Arsene dkk., 2000). Sel Escherichia coli memiliki sistem chaperon yang

berperan penting dalam kelangsungan hidup sel, yaitu hsPs70 (Singh dan

Gupta, 2009). Protein ini diekspresikan pada seluruh bagian sel, termasuk

sitoplasmik, periplasmik dan membran sel. Ekspresi protein hsPs70

tertinggi pada membran sel dibandingkan bagian sitoplasmik dan

periplasmik (Urban-Chmiel dkk., 2013). Kompleks protein hsPs ini dapat

bekerja optimum pada suhu 40-45℃. Apabila suhu melebihi 45℃,

kompleks protein ini mulai terdenaturasi (Thomas dan Baneyx, 1998).

5. Isolasi DNA plasmid rekombinan

DNA plasmid rekombinan, kemudian dapat diisolasi untuk kepentingan

pengerjaan berkutnya dengan menggunakan metoda yang sudah dijelaskan

di atas. DNA ini selanjutnya dapat di karakterisasi, misalnya disekuensing

 untuk menentukan urutan nukleotidanya atau dapat juga di potong dengan

enzim restriksi kemudian di kloning ke vektor ekspresi (Muthiadin, 2014).

2.6 Transformasi Pada Sel Non Bakteri

Cara memasukkan DNA ke dalam sel jamur, hewan dan tanaman juga

diperlukan jika organisme tersebut akan digunakan sebagai tuan rumah untuk

kloning gena. Secara umum, memasukkan sel ke dalam larutan garam biasanya

hanya efektif pada beberapa spesies bakteri, tetapi tidak pada organisme tingkat

tinggi, walaupun perlakuan dengan litium klorid atau litium asetat meningkatkan

pengambilan DNA oleh sel ragi, dan sekarang ini digunakan secara teratur dalam

transformasi Saccharomyces ceresivlae.

Penghalang utama pengambilan DNA adalah dinding sel. Sel hewam yang

dikultur, yang biasanya tidak mempunyai dinding sel mengabil DNA dengan

cepat, terutama jika DNA dipresipitasikan pada permukaan sel dengan kalsium

fosfat. Untuk jenis-jenis sel yang lain menghilangkan dinding sel. Enzim-enzim

yang dapat merusak dinding jamur atau tanaman telah tersedia dan protoplas yang

utuh dapat peroleh dalam kondisi yang tepat. Protoplas biasanya mengaambil

DNA dengan cepat; dengan cara lain transformasi dapat dimulai dengan teknik

khusus seperti elektroporasi. Sebuah transformasi dimungkinkan untuk

menginduksi protoplas agar membentuk dinding sel lagi sehingga dapat

membelah dan akhirnya mengalami regenerasi men- jadi organisme yang telah

ditransformasi. Namun demikian regenerasi bukan merupakan proses yang mudah

dan hal ini telah dicapai hanya ada seiumlah terbatas spesies jamur dan tanaman.

2.7 Manfaat dan Dampak Teknologi DNA Rekombinan

Sel mengandung dua asam nukleat, yaitu DNA dan RNA. Berkembangnya

ilmu pengetahuan, membuat manusia berupaya membuat kombinasi sifat-sifat

baru pada suatu makhluk hidup dengan cara melakukan perubahan langsung pada

genom DNAnya. Usaha ini dilakukan menggunakan teknologi yang disebut

teknologi DNA rekombinan.

Teknologi DNA rekombinan telah memberi banyak manfaat bagi

perkembangan ilmu pengetahuan dan kehidupan manusia dalam sehari-hari.ada

beberapa peran dan manfaat teknologi DNA rekombinan dalam berbagai bidang,

yaitu:

- Pada bidang kedokteran, dapat digunakan untuk dignosis penyakit. Para

ilmuwan kedokteran dapat mendiagnosis ratusan keleainan genetik manusia

dengan menggunakan teknologi DNA. Mereka dapat mengidentifikasi

individu yang mempunyai penyakit genetik sebelum gejalanya muncul atau

bakan sebelum lahir. Contohnya ialah dengan pemanfaatan PCR dan probe

asam nukleat berlabel untuk menelusuri patogen-patogen tertentu. Misalnya,

dengan mengetahui urutan DNA HIV, PCR dapat digunakan untuk

memperkuat (mengamplifikasi) dan kemudian mendeteksi DNA HIV dalam

sampel darah atau jaringan.

- Pada bidang farmasi, beberapa jenis obat-obatan, vaksin, hormon telah

diproduksi dengan memanfaatkan teknologi DNA rekombinan. Adapun

produk utama dari bidang farmasi yaitu produksi insulin, hormon

pertumbuhan dan aktivator plasminogen jaringan (TPA-Tissue Plaminogen

Activator). Protein ini membantu melarutkan darah yang membekudan

menurunkan resiko serangan jantung erikutnya jika diberikan sesegera

mungkin seetealh serangan pertama.

- Pada bidang forensik, pelaku atau tersangka dalam suatu kejahatan dapat

diketahui dengan melakukan pengujian DNA karena setiap orang memilki

urutan DNA yang unik (kecuali kembar identik). Analisa RFLP Southern

blotting merupakan metode mpuh untuk pendeteksian kemiripan dan

perbedaan sampel DNA dan hanya membutuhkan darah atau jaringan lain

dalam jumlah yang sangat sedikit (sekitar 1.000 sel).

- Pada bidang lingkungan, pengidentifikasian dan perekayasaan mikroba yang

mempunyai kemampuan sebagai penawar limbah toksik tertentu. Misalnya,

strain-strain bakteri telah dikembangkan dapat mendegradasi sejeumlah

senyawa yang dilepas selama kebocoran minyak.

- Pada bidang pertanian, penggunaan produk hasil metode DNA rekombian

seperti vaksin baru yang didesain ulang, antibodi ataupun hormon

petumbuhan. Contoh pada hewan, sapi perah disuntik dengan hormon

pertumbuhan sampi (BGH- Bovine Growth Hormone) yang dibuat oleh

E.Coli untuk menaikkan produksi susu dan meningkatkan perolehan bobot

dalam daging ternak. Contoh lain pada tumbuhan yaitu kapas transgenik.

Salah satu kapas transgenik yaitu kapas-bt yang mengandung gen penyandi

toksin yang berasa dari bakteri Bacillus turnigiensis (Bt). Toksin tersebut

dapat membunuh hama kapas sehingga kapas tersebut tahan terhadap

serangan hamanya (ulat).

Mahluk hidup yang materi genetiknya telah dimanipulasi secara artifisial

di laboratorium melalui rekayasa genetika disebut dengan mahluk hidup

transgenic atau rekayasa genetika mahluk hidup (genetically modified

organism/GMO) yang memiliki sifat unggul dibandingkan dengan mahluk hidup

asalnya. Namun dalam pengembangannya sampai saat ini, GMO masih

menimbulkan pro kontra (kontroversi) di tengah-tengah masyarakat dunia, baik

yang terjadi di negara dimana GMO dikembangkan maupun di negara-negara

pengguna produk GMO. Kontroversi penerimaan dan penggunaan produk GMO

hadir dalam berbagai aspek kehidupan masyarakat yaitu: pertanian, lingkungan,

kesehatan, agama, budaya dan etika.

Kelompok yang pro GMO beralasan bahwa ada potensi tak terbatas dalam

rekayasa genetika yang bermanfaat untuk mengurangi penggunaan pestisida,

mengatasi kekurangan pangan, dan menghasilkan makan-makanan yang lebih

bergizi serta obat-obatan. Sedangkan kelompok yang kontra/menolak berpendapat

produk pangan dan obat-obatan GMO belum diyakini aman untuk dikonsumsi

karena masih menimbulkan berbagai dampak negatif bagi kesehatan dan

lingkungan. Dampk negatif lainnya bagi para petani khususnya adalah sangat

merugikan mereka, karena petani non GMO tidak mampu meningkatkan

produktifitas yang lebih menguntungkan.

 BAB III

KESIMPULAN

Adapun kesimpulan dari pemaparan makalahini antara lain:

1. Teknologi DNA rekombinan merupakan teknik penggabungan DNA dari

spesies yang berbeda sehingga akan diperoleh organisme baru dengan sifat-

sifat yang diinginkan.

2. Kloning adalah proses mengkombinasikan beberapa DNA dan memperbanyak

DNA rekombinan tersebut di dalam sel. Kloning melibatkan lima komponen

utama, yaitu : fragmen DNA (gen) yang akan di kloning (disebut juga DNA

sisipan), DNA vektor (bisa plasmid, bakteriofaga atau cosmid), enzim

restriksi, enzim ligase dan sel inang (bakteri atau ragi).

3. Tahapan cloning terbagi menjadi isolasi atau preparasi DNA, pemotongan

DNA dengan enzim restriksi, penyambungan DNA dengan enzim ligase,

transformasi plasmid ke sel inang dan isolasi DNA plasmid rekombinan.

4. Transformasi DNA merupakan salah satu metode untuk memasukkan DNA ke

dalam sel bakteri.

5. Teknologi DNA rekombinan memilki banyak manfaat pada berbagai bidang

kehidupan, seperti pada bidang kedokteran, farmasi, forensik, lingkungan dan

pertanian. Namun dalam pengaplikasiaannya, rekayasa genetik ini

menghadirkan berbagai kontrovesi dikalangan penggunanya.

 DAFTAR PUSTAKA

Arsene, F., Tomoyasu, T., dan Bukau, B. 2000. The heat shock response of
Escherichia coli. International journal of food microbiology. 55(1-3): 3-9.

Artama, W. T. 1991. Rekayasa Genetika. Pusat Antar Universitas-Bioteknologi.

UGM, Jogjakarta.

Bernandus, Z.G., Fatimawali, dan Kolondam, B. 2019. Transformasi Plasmid

yang Mengandung Gen merB pada Escherichia coli BL21 (DE3). Jurnal
Pharmacon. 8(1): 196-202.

Brown, T. A. 2010. Gene cloning and DNA analysis. Blackwell Publishing,

Oxford.

Brown, T. 1991. Pengantar Kloning Gena. Yayasan Essentia Medica, Yogyakarta.

Casali, N. dan Preston, A. 2003. E. coli plasmid vectors : methods and

applications. Humana Press, New Jersey.

Hanahan, D. 1983. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.

Journal of molecular biology 166(1): 557-580.

Marx, J. L. 1991. Revolusi Bioteknologi. Edisi 1. Yayasan Obor Indonesia,

Jakarta.

Muthiadin, C. 2014. Pengantar Rekayasa Genetika. UIN Alauddin, Makassar.

Ng, N. 2009. Optimizing bacterial transformation efficiency : a study of heat and

cold shock parameters and DNA plasmid concentation. California state
science fair. California.

Nicholl, D. S. T. 1994. An Introduction to Genetic Engineering. Cambridge

University Press, USA.

Noviendri, D. 2007. Teknologi DNA Rekombinan dan Aplikasinya dalam

Eksplorasi Mikroba Laut. Jurnal Squalen. 2(2): 56-64.

Rasyid, H., 2003, Teknologi DNA antar Bioetika, Kepentingan dan Keselamatan
Umat Manusia, Jurnal Ilmiah Bestari, 16(35), 155-167.

Ritcher, K., Haslbeck, M., dan Buchner, J. 2010. The heat shock response : life on
the verge of death. Molecular cell 40 (1): 253 – 266.

Sambrook, J., dan Russel, D. W. 2001. Molecular cloning, third edition. Cold
Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Singh, B. dan Gupta, R. S. 2009. Conserved inserts in the Hsp60 (GroEL) and
Hsp70 (DnaK) proteins are essential for cellular growth. Molecular genetic
genomic.s 281(1): 361-373.

Straus, D. B., Walter, W. A., dan Gross, C. A. 1987. The heat shock response of
E. coli is regulated by changes in the concentration of σ32. Nature
329(1): 348-351.

Sword, W. E. 2003. Chemical transformation of E. coli. Dalam : Casali, N. dan

Preston, A. E. coli plasmid vectors : methods and applications. Humana
Press, New Jersey.

Thomas J. G. dan Baneyx, F. 1998. Roles of the Escherichia coli small heat shock
proteins IbpA and IbpB in thermal stress management: Comparison with
ClpA, ClpB, and HtpG in vivo. Journal of Bacteriology.
180(19): 5165- 5172.

Urban-Chmiel, R., Dec, M., Puchalski, A., dan Wernicki, A. 2013.

Characterizationi of heat-shock proteins in Escherichia coli strains under
thermal stress in vitro. Journal of medical microbiology.
62(1): 1897- 1901.

Yoo, L. 2010. The effect of rpoH for heat shock gene expression on plasmid
transformation. Journal of experimental microbiology and immunology.
14 (1): 108-111.