BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Penelitian

Sistem pengiriman obat berbasis Nanoteknologi/ nanotechnology Based Drug
Delivery System (NBDDS) untuk terapi anti kanker dirancang untuk mengubah
sifat molekul obat bebas yang tidak menguntungkan (agen antikanker) seperti
spesifisitas yang rendah dan toksisitas yang tinggi. Selama dekade terakhir
nanopartikel lipid padat/ Solid Lipid Nanoparticles (SLN) telah muncul sebagai
NBDDS potensial untuk pengiriman obat antikanker. Kelebihan yang ditawarkan
SLN meliputi kemudahan dalam meningkatkan produksi tanpa pelarut organik.
penggunaan excavator GRAS dan spektrum aplikasi yang luas (dermal, oral,
intravena). Selain itu, sebagian besar obat antikanker adalah lipofilik dan SLN
dapat digunakan untuk mengirimkan obat-obatan tersebut secara lebih efektif.
Untuk meningkatkan selektivitas agen antikanker generasi baru SLN seperti
nanopartikel hibrida polimer-lipid, kompleks nanolipid dan sLN yang telah lama
beredar telah dikembangkan. Ada banyak laporan yang dipublikasikan dimana
SLN telah digunakan untuk obat-obatan kanker encapsulation seperti
ascamptothecin, doxorubicin, etoposida dan paclitaxel.
Lendir dari lipida padat menunjukkan pengusiran obat setelah penyimpanan
jangka panjang, menghasilkan efisiensi enkapsulasi obat yang rendah. Pengusiran
obat-obatan terjadi karena kecenderungan lipid membentuk kristal sempurna pada
kristalisasi ulang. Penggunaan lipida kompleks (dengan struktur yang kurang
teratur seperti compritol 888 ATO) atau campuran lipida padat dan minyak
(kompleks nanolipid) telah disarankan untuk mengatasi masalah pengosongan
dan pemuatan obat SLN. Gagasan di balik pendekatan ini adalah bahwa lipid
kompleks memiliki ketidaksempurnaan yang tidak sempurna (menjadi trigliserida
dengan asam lemak yang berbeda) dalam struktur kisi mereka, dan penyertaan
minyak dengan lipid padat dapat menciptakan pemisahan dalam kemasan rantai
asam lemak, memberi lebih banyak ruang untuk obat tersebut. Tujuan dari
penelitian ini adalah untuk mengetahui efisiensi nanopartikel lipid padat untuk
menghasilkan asam lemak yang kurang baik, Chlorambucil (asam amino

1
aminolbenzenasaanoat 4-Ibis (2-kletetil)), yang merupakan turunan nitrogen
mustard dan antineoplastik yang cukup banyak digunakan. CLB adalah agen
alkilasi DNA, dengan titik lebur rendah (64-66 dan kelarutan tinggi dalam lipida
(Indeks Merck), Meskipun memiliki kelarutan dalam air yang rendah, ia
mengalami hidrolisis dalam media berair. Hidrolisis ini dipengaruhi oleh
beberapa faktor termasuk pH dan spesies ionik yang ada di sekitar molekul CLB.
Ketidakstabilan kimiawi CLB adalah keterbatasan utama dalam mencapai
kinerja terapeutik optimal. Karena alasan ini, enkapsulasi CLB dalam formulasi
berbasis lipid padat memiliki potensi untuk meningkatkan stabilitas dan spesifitas
tumor. Dalam studi saat ini, pemilihan lipida inti untuk pembuatan nanopartikel
lipid padat didasarkan pada kelarutan CLB pada lipida berbeda yang tersedia
(dibahas kemudian). Nanopartikel lipid yang dievaluasi untuk sifat fisiko-kimia;
stabilitas fisik dan kimia; dan farmakokinetik dan biodistribusinya setelah
pemberian intravena pada tikus. Farmakokinetik dan biodistribusi formulasi
nanopartikel lipid stabil dibandingkan dengan larutan CLB (CLB-Sol).

1.2 Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah :
1. Untuk mengetahui efisiensi formulasi nanopartikel lipid terhadap kanker
2. Untuk menetapkan kestabilan obat dalam formulasi nanopartikel lipid

1.3 Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini adalah :
1. Mengetahui jenis nanopartikel lipid yang efisien dalam formulasi dan
farmakokinetik
2. Mengetahui stabilitas obat dari formulasi nanopartikel lipid

1.4 Identitas Jurnal

Berikut adalah identitas dari jurnal yang review
1. Judul Asli : Formulation and Pharmacokinetics of
Lipid Nanoparticles of a chemically
Sensitive Nitrogen Mustard Derivate :
Chlorambucil

2
 2. Judul Bahasa Indonesia : Formulasi dan Farmakokinetik
Nanopartikel Lipid dari Turunan
Mustard Nitrogen yang Sensitif secara
Kimiawi
3. Sumber : International Jurnal of Pharmaceutics
4. Tahun : 2009
5. Penulis : Puneet Sharma, Srinivas Ganta,
William A. Denny, dan Sanjay Garg
6. Asal Penulis : Sekolah Farmasi dan Pusat Penelitian
Kanker Auckland, Universitas Auckland,
Selandia Baru
7. Reviewer : Zenith Virgina Ababiel (A 151 080)

BAB II
TATA KERJA
2.1 Bahan Penelitian

3
 Berikut adalah bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini :
1. Chlorambucil (CLB)
2. Praziquantel (standar internal)
3. Asam stearat
4. Tween 60
5. Tyloxapol
6. Asam oleat
7. Distearoyl phosphatidyl etanolamine polyethylene glikol 2000
8. Poloksamer F 68
9. Natrium Glikolokat
10. Precirol ATO 5
11. Compritol ATO 888
12. Dynasan 114
13. Glyceryl mono stearat
14. BASF
15. Gattefosse
16. Sasol

Reagen yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut :

1. Grade AR
2. Air
3. Buffer yang diperoleh dari reverse osmosis air demineral

2.2 Alat Penelitian

Berikut adalah alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah :
1. Seleksi Lipid :
a. HPLC
b. Shower bertekanan terkontrol

2. Teknik Preparatif :
a. Sirkulator air
b. Probe Sonicator/ Ultrasonic Procesor

4
 3. Teknik Analisis :
a. Hydro Malivern
b. Zetasizer
c. HPLC
d. Tabung centrisart
4. Stabilitas Fisik dan Kimia :
a. Chamber stabilitas
b. HPLC
5. Osmolalitas dan Pengukuran Ph :
a. Osmometer
b. Ph meter mettler toledo
6. Farmakokinetik dan Distribusi Jaringan
a. Terumo Syringe
b. Ultra tarrax homogenizer
7. Analisis Sampel Plasma dan Jaringan
a. Mixer vortex VX100 labnet
b. Vakum king
c. HPLC

2.3 Metode Penelitian

2.3.1 Seleksi Lipid
Pemilihan lipid dilakukan berdasarkan kelarutan CLB dalam lipid.
Tujuannya adalah untuk memberikan larutan yang bening dalam lipid yang
meleleh dibawah cahaya normal saat dilihat dengan mata telanjang. Lipid
yang digunakan antara lain adalah compritol 888 ATO, precirol ATO 5,
dynasan 114, gliseril monostearat dan asam stearat.
Cara kerjanya adalah 10 mg CLB dicampurkan dengan berbagai
jumlah lipid yang dipilih, masing-masing 10 ml dalam gelas. Lalu dipanaskan
pada suhu 5◦C diatas titik leleh lipid yang dipilih didalam Sirkulator Air.
Setelah mencair, kelarutan CLB diamati dalam lelehan lipid tersebut secara
visual.

5
2.3.2 Teknik Preparatif
Nanopartikel lipid dipreparasi dengan menggunakan teknik sonication
probe suhu terkontrol. 5 gram lipid dicampurkan dengan 0,01 gram CLB
didalam botol kaca 200 ml, dalam rakitan baja lapis stainless. Suhu dikontrol
menggunakan sirkulator air, pada suhu 75◦C. Ketika campuran lipid dan CLB
dilelehkan, akan didapatkan larutan yang bening, kemudian ditambahkan 5 ml
surfaktan panas (75◦C) sebagai fasa air dibawah ultra high sonication, yaitu
probe sonicator.
Dihasikan emulsi panas, kemudian disaring melalui filter 0,2 μm
kemudian didinginkan dengan suhu dibawah suh kristalisasi lipid (sampai
20◦C) untuk mendapatkan nanopartikel lipid. Sesaat setelah preparasi selalu
ada peningkatan volume pada formulasi (5,2 ml). Hal ini dikarenakan adanya
tetesan minyak yang meleleh dan temperatur yang tinggi.
Setelah penyaringan, formulasi didinginkan dan dibiarkan selama 1
jam pada temperatur 25◦C. Volume formulasi selalu bertambah 0,1 ml.
Amplitudo dan waktu saat ultrasonikasi dioptimalkan berdasarkan ukuran
partikel yang diperlukan dan kecenderunagn pembentukan gel formulasi
akhir.
Empat jenis nanopartikel telah dipreparasi, yaitu : nanopartikel lipid
padat/ Solid Lipid Nanoparticels (SLN) dan nanopartikel butil padat (PEG-
SLN) di preparasi menggunakan Distearoylphosphatidylethanolamine
Polyethylene Glycol 2000 (PEG 2000 DSPE dengan domain asam stearat),
nanolipid kompleks (NLC) di preparasi menggunakan asam oleat sebagai
tambahan lipid dan nanoprtikel lipid (LN) di preparasi menggunakan dimetil
distearil amonium bromida (DDAB). Konsentrasi lipid dijaga konstan pada
5% (b/v) asam stearat dalam 5 ml batch. Dalam formulasi LN, komposisi
lipid dalam 1% juga diuji.

2.3.3 Teknik Analisis

a. Evaluasi Ukuran Partikel dan Potensi Zeta

6
 Analisis ukuran partikel formulasi nanopartikel lipid dilakukan
dengan hamburan cahaya dinamis menggunakan alat analisa ukuran
partikel Malvern Hydro 2000SM (Malvern Instruments). Formulasi
ditambahkan setetes demi setetes ke unit dispersi sampel. Jarak laser
selalu terjaga antara 10% dan 20%. Karena sulit untuk mendapatkan
indeks bias absolut dari formulasi individu, nilai indeks bias 1,5
digunakan untuk analisis ukuran partikel. Analisis dilakukan secara
rangkap tiga dan nilai rata - rata distribusi volume digunakan untuk
analisis. Ukuran partikel rata-rata dinyatakan sebagai d (0,5) (50%
dari volume partikel di bawah nilai ini). Nilai d (0.9) menunjukkan
90% volume partikel di bawah ukuran tertentu. Untuk potensi zeta,
sampel diencerkan dengan air destilasi ganda dan ditempatkan di sel
elektroforesis Zetasizer.

b. Evaluasi Efisiensi Perangkap Obat dan HPLC

Digunakan dua metode untuk menjebak obat secara efisien/ Drug
Entrapment Efficiency (DEE), yaitu menggunakan metode ultrafiltrasi
dan pelarutan langsung.

1) Metode Ultrafiltrasi
Dalam metode ultrafiltrasi, formulasi adalah membran yang
disaring dengan menerapkan tekanan hidrostatik (melawan
membran) sehingga terjadi pemisahan partikel (tergantung pada
ukuran saringan) dan cairan bening. Dalam penelitian ini,
ultrafiltrasi dilakukan dengan menggunakan tabung Centrisart,
yang terdiri dari membran penyaring (potongan berat molekul
20.000 Da) di dasar ruang pemulihan sampel.
Sekitar 1 ml sampel formulasi CLB yang tidak dicerna
ditempatkan di ruang terluar dan ruang pemulihan sampel
diletakkan di atas sampel. Unit disentrifugasi pada 3500rpm selama
15 menit. Nanopartikel lipid bersama dengan obat yang
dienkapsulasi tetap berada di ruang luar sementara fasa berair

7
dipindahkan ke ruang pemulihan sampel melalui membran filter.
Konsentrasi CLB dalam fasa air diperkirakan menggunakan HPLC.
DEE (%) diperkirakan menggunakan rumus :

DEE (%) = W awal – W diperoleh/ W awal x 100%

dimana "W diperoleh" adalah jumlah obat dalam fasa berair

yang dihitung dari HPLC dan "W awal" adalah jumlah obat yang
ada pada formulasi awal.

2) Pelarutan Langsung
DEE obat ditentukan dengan mengukur konsentrasi CLB yang
tersisa (undegraded) pada formulasi. Untuk menentukan (DEE),
volume formulasi yang pasti diambil (dalam rangkap tiga) dan
diencerkan dengan metanol untuk menghasilkan konsentrasi akhir
10 ° g (secara teoritis) dan dianalisis dengan HPLC. DEE dihitung
sebagai berikut:

DEE (%) = W diperoleh / W awal x 100%

dimana "Wobtained" adalah jumlah obat yang dihitung dari

HPLC dan, "Winitial" adalah jumlah obat yang hadir pada
formulasi awal. CLB dan eksipien yang digunakan dalam
penelitian ini dapat larut dalam metanol. Karena CLB tidak stabil
dalam larutan surfaktan berair, penurunan DEE adalah indikasi
hilangnya obat dari nanopartikel lipid. Metode HPLC fase reverse
validated digunakan untuk analisis CLB dalam sampel. Seri
Agilent® 1100 LC terdiri dari pompa kuartener, kompartemen
kolom termostatted, degasser online, autosampler, dan detektor
PDA elektrokimia digunakan untuk analisis obat tersebut. Untuk
pengendalian instrumen, akuisisi dan pemrosesan data, sistem
kromatografi dihubungkan ke perangkat lunak Agilent

8
 Chemstation® LC / MS (Agilent Technologies, Jerman).
Pemisahan kromatografi dilakukan menggunakan kolom analisis
Gemini (250mm × 4.6mm, ukuran partikel 5? m) dari
Phenomenox, USA dan pracetak C18 dari kemasan yang sama
(12.5mm × 4,6 mm). Fase gerak terdiri dari asetonitril dan 0,2%
larutan asam asetat encer digunakan dalam komposisi 65:35 (v / v)
pada laju alir isokratik 1 ml / menit. Sebelum digunakan, fase
gerak selalu disaring melalui filter nilon 0,45 (Millipore, AS).
Volume sampel yang disuntikkan adalah 50 μL dan analisis
dilakukan pada panjang gelombang 258 nm. Sampler otomatis
suhu dipertahankan pada suhu 10 ◦C.
Metode HPLC divalidasi untuk linieritas (dari 0,1 sampai 30
g / ml), spesifisitas (pada puncak kemurnian dan resolusi), akurasi
(pada 0,1, 15 dan 30 g / ml) dan presisi. Metode HPLC ditemukan
linier pada kisaran 0,1-30 g / ml (R2> 0,999). Variabilitas intraday
standar kontrol kualitas pada 0,1, 15 dan 30 g / ml adalah 2,2%,
0,7% dan 1,3% RSD. Variabilitas antar hari pada konsentrasi di
atas adalah 4,5%, 1,9% dan 1,3% RSD. Nilai akurasi pada 0,1, 15
dan 30 μg / ml adalah 5%, 1,3% dan 1,0% (untuk intraday) dan
10%, 2,6% dan 1,7% (untuk interday) dari nilai sebenarnya.
Metode HPLC yang digunakan untuk penentuan CLB adalah
indikasi stabilitas sehubungan dengan puncak CLB yang
ditentukan oleh perangkat lunak Agilent Chemstation®.

2.3.4 Stabilitas Fisika dan Kimia

Studi stabilitas formulasi lipid (SLN, PEG-SLN, NLC dan (LN)
dilakukan selama 90 hari. Semua sampel stabilitas disiapkan secara rangkap
tiga dan disimpan pada 4-8 ◦C (Stability Chamber, WTC, Binder, Jerman).
parameter untuk studi stabilitas dipilih tergantung pada tujuan penelitian.
Ukuran partikel dilakukan untuk evaluasi stabilitas fisik formulasi. Untuk
menetapkan kestabilan obat dalam formulasi nanopartikel lipid, DEE

9
dievaluasi dengan menggunakan analisis HPLC. Pada setiap titik waktu
stabilitas, sampel dievaluasi untuk ukuran partikel dan DEE.

2.3.5 Osmolalitas dan Pengukuran pH

Pengukuran osmolalitas didasarkan pada metode titik beku seperti
yang dijelaskan dalam manual pengguna (Instrumen Lanjutan). Secara
singkat, setelah kalibrasi osmometer (Model 3D3, Instrumen Lanjutan, Inc.,
AS) dengan standar acuan (Instrumen Lengkap 100 dan 290 mOsm),
osmolalitas dicatat dengan 0,20 ml sampel. Osmolalitas formulasi disesuaikan
menjadi 300,6 ± 2,3 mOsm/ kgBB dengan manitol sebelum pemberian
intravena. PH diukur dengan menggunakan meter pH Mettler Toledo yang
dikalibrasi (Mettler-Toledo GmbH, Swiss).

2.3.6 Farmakokinetik dan Distribusi Jaringan

Digunakan tikus jantan dengan berat 25-30 gram. Hewan
diaklimatsasi setidaknya 1-2 minggu sebelum pengujian. Dosis 10 mg/kg
setiap formulasi diberikan melalui vena ekor Hewan (5ml/kg) dengan jarum
suntik Tuberkulin 1 cm3 (Terumo Sylringe) yang dilengkapi dengan jarum
pengukur 26. Kelompok kontrol menerima pembawa yang sesuai. Pada titik
waktu yang telah ditentukan (5,15,20,60 dan 90 menit). Tiga tikus dianastesi
dengan isofluran. Darah dikumpulkan dari sinus retro orbital ke dalam
tabung eppendorf yang mengandung larutan tetra asetat natrium etilena
diamina 7,5% dan di sentrfugasi pada 4500 rpm selama 15 menit untuk
isolasi plasma.
Setelah itu, tikus disterilisasi dengan mendislokasi leher rahim, ginjal,
jantung dan paru-paru dikumpulkan, dicuci, ditimbang dan dihomogenisasi
menggunakan ultra turraz homogenizer dalam 1 ml PBD (Ph 7,4). Setelah
pengumpulan, sampel plasma da jaringan disimpan pada suhu -20◦C sampai
analisis. Tumor juga dikumpulkan saat melakukan studi farmakokinetik pada
tikus pembawa tumor dan diproses seperti yang disebutkan di atas.

a. Preparasi Larutan CLB

10
 20 mg CLB dilarutkan dalam 1 ml etanol yang diasamkan (4,8 ml
asam klorida pekat ditambahkan ke etil alkohol 95% (v/v, dalam
volume 100 ml) dan di encerkan menjadi 10 ml dengan
propylenglycol/ dipotasium hidrogen fosfat buffer (20 gdipotassium
hydrogen phospate ditambah 450 m propylene glycol yang
diencerkan menjadi 11 ml dengan air untuk injeksi. pH akhir 7,4
karena stabilitas larutan CLB buruk. Lalu segera disuntik secara intra
vena sebanyak 5 ml/kgBB.

b. Analisis Sampel Jaringan dan Plasma

Untuk menentukan kandungan CLB, 5 μl dai I.S ( μg/ml)
ditambahkan kedalam 0,1 ml plasma atau homogenat jaringan.
Presipitasi protein dilakukan dengan penambahan 1 ml asetonitril
dingin. Setelah dilakukan vortexing selama 1 menit dengan mixer
vortex VX100 Labnet, sampel disimpan di es selama 30 menit dan
kemudian disentrifugasi pada 4500 rpm selama 15 menit untuk
mengendapkan protein. Supernatan tersebut kemudian dipindahkan ke
atbung uji bersih dan di vakum kering. Residu dilarutkan dengan fasa
gerak dan 50 μl disuntikkan kedalam HPLC untuk dianalisis. Hasil
analisis digunakan dan divalidasi untuk estimasi CLB dalam matriks
plasma dan jaringan. Kemudian dibuat kurva kalibrasi dengan
menggunakan enam standar kalibrasi (0,1-20 μg/ml, 5 μg/ml I.S).
ketepatan intraday dan interday ditentukan dengan analisis konsentrasi
0,1; 10 dan 20 μg/ml. Ketepatan-ketepatan metode pada masing-
masing konsentrasi dihitung sebagai persentase standarr deviasi
relatif. Efisiensi ekstraksi CLB dari plasma dan jaringan ditentukan
dengan membandingkan konsentrasi sampel yang diekstraksi (0,1; 10
dan 20 μg/ml) dengan standar yang tidak dikecualikan dengan
mengandung jumlah analit yang sama. Dalam semua kasus, lima
sampel ulangan dianalisis.

11
c. Farmakokinetik dan Distribusi Jaringan pada Tikus Pembawa
Tumor
Farmakokinetik dan distribusi jaringan CLB diselidiki pada tikus
yang diinokulasi secara subkutan dengan fragmen tumor usus-38 dari
tikus donor. Setelah volume tumor tumor mencapai 50 mm3, tikus
diberikan dosis awal 10 mg/kg CLB-sol atau LN melalui vena ekor.
Kelompok kontrol diobati dengan pembawa (tanpa obat apapun).

d. Farmakokinetik dan Analisis Statistika

Parameter farmakokinetik CLB pada tikus diperkirakan
menggunakan analisis non-kompartemen (NCA) dengan WinNonlin
versi 5.0. Data yang dipasang pada NCA menggunakan algoritme
kuadrat terkecil dengan berat seragam. Daerah di bawah konsentrasi-
waktu profil (AUC), waktu tinggal rata-rata (MRT), volume distribusi
pada keadaan mapan (VSS), total body clearance (CL) dan plasma
setengah umur untuk distribusi (t1/2α) dan fase eliminasi (t1/2β)
dihitung dengan aturan trapesium log-linear dengan ekstrapolasi
kemiringan terminal sampai tak terhingga oleh regresi log-linear.
Hasil farmakokinetik dianalisis secara statistik dengan menggunakan
Students independent sample t-test dan dinyatakan sebagai nilai p satu
arah. Perbedaan statistik antara kelompok dievaluasi oleh SigmaStat
3.5. Dalam semua analisis, nilai p <0,01 atau 0,05 dianggap signifikan
secara statistik.

12
 BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Studi kelarutan untuk seleksi lipid inti

Dalam formulasi SLN, kelarutan obat dalam lipid memrupakan penentu
efisiensi enkapsulasi nanopartikel lipid. Kelarutan lipid yang tinggi akan
menghasilkan efisiensi enkapsulasi yang tinggi dari fomulasi akhir. Untuk
mengetahui kelarutan CLB dalam lipid, dipilih asam lemak dan trigliserida untuk
lipid dengan titik lebur lebih dari ukuran ruangan, kelarutan harus ditentukan
dalam lipid yang meleleh.
Dari gambar dibawah (Gambar 3.1.) menujukkan jumalh lemak yang berbeda
yang dibutuhkan untuk melarutkan 10 mg CLB. Asam stearat memiliki potensi
tertinggi untuk melarutkan CLB, dan telah digunakan untuk formulasi SLN
intravena. Karena inilah asam stearat digunakan untuk penelitian lebih lanjut.

Gambar 3.1. kelarutan CLB dalam beberapa lipid

3.2 Preparasi dan karakterisasi nanopartikel lipid

Teknik sonication probe suhu terkontrol melibatkan penyebaran lipida yang
meleleh: butiran minyak obat dalam larutan surfaktan panas dengan sonication
ultrahigh untuk waktu yang optimal, menghasilkan pembentukan nanoemulsi
minyak nabati dalam air. Ini kemudian didinginkan (di bawah suhu kristalisasi
ulang dari lipid) untuk membentuk SLN. Kelemahan umum SLN yang dibuat

13
menggunakan lipid dengan titik lebur tinggi (titik lebur di atas suhu kamar) adalah
stabilitas fisik yang buruk atau pembentukan gel / pembentukan partikel
makroskopik pada pendinginan.
Dalam penelitian ini, komposisi dari masing-masing nanopartikel lipid (SLN,
PEG-SLN, NLC dan LN) dioptimalkan untuk memberikan stabilitas fisik yang
baik. Untuk persiapan formulasi akhir, frekuensi ultrasonik yang dioptimalkan
(amplitudo 60% ~120 Wenergy output) digunakan selama 4 menit. Bila diamati
setelah 90 hari, semua formulasi kecuali LN telah dipisahkan menjadi dua lapisan;
lapisan atas yang jelas (surfaktan di fasa berair) dan lapisan bawah putih (lipid
phase). Terlepas dari pemisahan fase ini, ukuran partikel rata-rata 146,8 (± 10,1)
nm diperoleh untuk semua formulasi, pada ukuran partikel (Gambar 3.2.).
Potensi Zeta diukur untuk komposisi komposisi LN yang berbeda. Dalam
formulasi LN tanpa CLB, potensi zeta nilai meningkat (terhadap skala positif) dari
-38 ± 1,7 menjadi -31,29 ± 3,41 mV karena konsentrasi DDAB meningkat dari 1
sampai 100? Dalam formulasi LN dengan CLB, nilai potensial zeta -7,04 ± 3,5mV
diamati.

Gambar 3.2. Ukuran Partikel Nanopartikel Lipid

3.3 Stabilitas fisika

Stabilitas fisik nanopartikel lipid ditentukan dengan mengukur ukuran
partikel formulasi pada 0, 15 dan 90 hari (Gambar 3.2). Perbedaan signifikan
secara statistik diperoleh antara ukuran partikel (d = 0,9) dari formulasi

14
nanopartikel lipid yang berbeda pada setiap titik waktu. Ukuran partikel rata-rata
(d = 0,5) dari formulasi LN lebih rendah dibandingkan dengan formulasi lainnya.
Meskipun ada perbedaan statistik, ukuran partikel di semua formulasi di bawah
300 nm. Selain itu, ketika formulasi individual dibandingkan, tidak ada perbedaan
yang signifikan antara ukuran partikel rata-rata (ANOVA dua arah, 95% CI)
hingga 90 hari.

3.4 Efisiensi enkapsulasi obat dan stabilitas kimia

ada kecenderungan SLN untuk mengusir molekul obat yang dienkapsulasi
dengan waktu, karena kristalisasi ulang lipid. Karena obat tersebut ada di antara
rantai asam lemak, pembentukan kekuatan kristal yang sempurna molekul obat
keluar dari matriks lipid yang menghasilkan lebih sedikit pemuatan obat. Dalam
penelitian saat ini, untuk menciptakan pemisahan antara rantai asam lemak asam
stearat, tiga eksipien berbedaDDAB, PEG2000DSPE dan asam oleat digunakan.
DDAB dan PEG2000DSPE memiliki stearat kelompok asam dalam molekulnya.
Hipotesisnya adalah bahwa penggabungan DDAB dan PEG2000DSPE pada
nanopartikel asam stearat harus meningkatkan kapasitas pemuatan dengan
meningkatkan kesenjangan antara rantai asam lemak (Gambar 3.4. A dan B),
sehingga membuat asam stearat kurang kristalin. Asam oleat (asam cis-9
octadecenoic) adalah asam lemak monounsaturated dari asam stearat. Seperti
ditunjukkan pada Gambar 4C, 'kink' yang ada dalam struktur asam oleat juga
dapat menciptakan pemisahan dalam rantai asam lemak asam stearat, bila
dicampur
bersama.
Nilai DEE dari formulasi yang dievaluasi (menggunakan metode solubilisasi
langsung) untuk menentukan stabilitas fisik formulasi dengan CLB (Gambar 5).
DEE dari semua formulasi kecuali LN menurun secara signifikan dari waktu ke
waktu (p <0,05). SLN, PEGSLN dan NLC menunjukkan penurunan ~50% pada
enkapsulasi CLB
dalam 7 hari Ini menunjukkan bahwa CLB dikeluarkan dari inti asam stearat
pada kristalisasi ulang, dan kemudian dihidrolisis di lingkungan berair luar.
Perlu dicatat bahwa metode ultrafiltrasi menunjukkan> 97% DEE, bahkan

15
setelah 90 hari dalam semua formulasi, yang tidak dapat diterima. Rumus yang
digunakan untuk perhitungan DEE Setelah ultrafiltrasi menggunakan jumlah
obat yang ada dalam fasa berair (Wobtained) dalam pembilang. Karena CLB
tidak stabil dalam media berair, W diperoleh selalu kurang signifikan dari pada
W awal, menghasilkan DEE yang lebih tinggi. Oleh karena itu, solubilisasi
langsung digunakan untuk memperkirakan DEE.
Untuk PEG-SLN dan NLC, DEE tidak memperbaiki penambahan
PEG2000DSPE dan asam oleat. Ini menyiratkan bahwa baik tidak ada
pemisahan (atau yang tidak mencukupi) rantai asam lemak asam stearat dengan
penambahan PEG2000DSPE dan asam oleat, sehingga yang terakhir tetap
terpisah dari nanopartikel asam stearat dalam larutan surfaktan berair.
Tidak ada penurunan yang signifikan (p> 0,05) dalam DEE (99,13 ± 1,88%)
untuk LN sampai 15 hari. Untuk komposisi yang sama dari LN, pengangkatan
DDAB menghasilkan penurunan DEE yang signifikan (49,5 ± 2,67%) setelah 15
hari. Oleh karena itu, tampak bahwa Kehadiran DDAB berpengaruh signifikan
terhadap stabilisasi CLB.
Pada metode pelarutan langsung, didasarkan pada fakta bahwa CLB adalah
molekul labil dan sangat rentan terhadap hidrolisis dalam medium berair.
Akibatnya, CLB yang dikeluarkan dari lipid padat dan hadir pada permukaan
partikel dihidrolisis oleh media berair sekitarnya tanpa adanya DDAB. PH
formulasi LN adalah 3,6 ± 0,2. Selain itu, formulasi LN juga mengandung 1%
(w / v) Tween 60 dalam fasa berair yang merupakan surfaktan pembentuk
micelle. Seperti metodologi yang digunakan untuk menghitung DEE tidak
membedakan antara obat yang dienkapsulasi (oleh lipid) dan obat yang tidak
dienkapsulasi tapi tidak terdegradasi dalam aqueousmedium (karena lowpH,
micellization dan kompleksasinya dengan DDAB), perlu untuk
mempertimbangkan pengaruh faktor-faktor ini terhadap laju hidrolisis CLB saat
berada dalam medium berair.
Studi ini menunjukkan bahwa laju hidrolisis CLB bergantung pada adanya
gugus aril amino netral (I), Hidrolisis berlangsung melalui pembentukan ion
aziridinium (II), yang telah dilaporkan sebagai tahap pembatas laju hidrolisis,
pKa (konstanta disosiasi) CLB adalah 2,3 dan pada kisaran pH 8-3,5 laju

16
hidrolisis tidak bergantung pada pH. Namun, di bawah pH 3,5, laju turun karena
pembentukan kelompok amina terprotonasi (III) yang menghambat hidrolisis.
Selain itu, laju hidrolisis juga dilaporkan mengalami penurunan dengan
penurunan suhu dan pembentukan micelle. formulasi LN yang disiapkan tanpa
DDAB menunjukkan penurunan DEE yang menunjukkan bahwa kenaikan DEE
pada penambahan DDAB dapat disebabkan oleh pembentukan stearat
asam-CLB-DDAB complex sedemikian sehingga gugus aril amino (hadir pada
pH 3.6) terlindungi darihidrolisis. Ini juga mengesampingkan kemungkinan
bahwa stabilisasi CLB di LN terutama disebabkan oleh suhu rendah, pH dan
micellization.
DDAB adalah lipase kationik sintetis yang melarutkan air di atas 40 ◦C dan
membentuk fragmen velium / bilayer bilayer setelah sonication. Karakterisasi
'pembentukan bilayer' dari DDAB telah digunakan untuk melarutkan
Amphotericin B dan Miconazole, obat-obatan yang larut dalam air. Menjadi
lipid kationik, konsentrasinya lebih dari 0,006% (w / v; ~100? M) DDAB telah
terbukti mengerahkan efek sitotoksik pada sel mamalia normal. Oleh karena itu
dalam penelitian ini , konsentrasi DDAB dipertahankan pada 0,0006% (w / v;
~10? M). Studi stabilitas LN vs. SLN menunjukkan bahwa penambahan DDAB
meningkatkan DEE secara signifikan. Ini menunjukkan bahwa asam stearat-CLB
nanopartikel sebenarnya ditutupi dengan rantai samping hidrofobik DDAB,
dengan kuartener amonium pada permukaan luar. Kehadiran DDAB pada
permukaan nanopartikel lipid yang mengandung CLB meningkatkan potensi
zeta LN menjadi -7,04 ± 3,5 mV. Pada penelitian sebelumnya, 1% (w / v; ~
15.8mM) DDAB (fragmen bilayer yang dihasilkan dengan sonication tip)
digunakan untuk melarutkan 50mg Amphotericin B.

17
 Gambar 3.4. Struktur hipotetis nanopartikel lipid berbeda dengan asam stearat
sebagai lipida inti (A) LN, (B) PEG-SLN dan (C) NLC
3.5 Farmakokinetik dan distribusi jaringan
Hasil validasi menunjukkan bahwa HPLCmethod linier berkisar 0,1-20 g / ml
(R2> 0,99) dengan batas kuantifikasi pada 0,1 g / ml (ketepatan 6,3% RSD).
Nilai pemulihan relatif CLB dalam plasma dan jaringan (hati, ginjal, paru-paru,
jantung dan tumor) masing-masing 102,39% dan 84,2-97,7%, yang berada
dalam batas yang dapat diterima untuk sampel biologis. Profil farmakokinetik
plasma 10 mg / kg CLB-Sol dan LN yang mengandung CLB ditunjukkan pada
Gambar 3.5.
Parameter farmakokinetik yang diperoleh dari perangkat lunak Winnonlin
disajikan pada Tabel 2. Seperti ditunjukkan pada Gambar 7 dan Tabel 1, kinetika
clearance plasma sebanding untuk kedua CLB-Sol dan LN. Juga, nilai AUC
untuk LN lebih rendah dari pada CLB-Sol. Ini menunjukkan bahwa LN cepat

18
 dibersihkan dari plasma. Hal ini sesuai dengan temuan sebelumnya, dimana
liposom yang dibuat dari DDAB menunjukkan pembersihan plasma yang cepat
dibandingkan dengan doksorubisin bebas.

Gambar 3.5. Kurva konsentrasi waktu konsentrasi plasma untuk larutan

klorambucil (CLB-Sol) dan nanokomposit lipid berkepanjangan klorambucil
(LN) (10) setelah 10 mg

Tabel 1. Parameter farmakokinetik setelah i.v. pemberian CLB-Sol dan LN pada

dosis 10 mg

Kehadiran DDAB di LN memberi muatan elektrostatik ke permukaan partikel

(karena adanya kelompok amonium kuartener). Biaya elektrostatik ini
memainkan peran penting dalam interaksi dengan protein plasma dan jaringan,
dan telah disarankan untuk dieksploitasi untuk penargetan vaskular.

19
 BAB IV
KESIMPULAN

Asam stearat-CLB-DDAB nanocomplexes (LN) menunjukkan peningkatan

stabilitas (dan enkapsulasi) pada formulasi lainnya. Alasan stabilisasi nampaknya
adalah kompleksasi CLB dengan DDAB. Kompleksitas ini spesifik untuk
beberapa obat (seperti Amfoterisin B, Miconazole dan CLB) dan umumnya tidak
berlaku untuk semua obat. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa pelarutan
obat-obatan terlarut rendah seperti Amphotericin B dan Miconazole memerlukan
jumlah DDAB yang tinggi. Sebagai perbandingan, DDAB-CLB-stearic acid LN
membutuhkan kuantitas DDAB secara signifikan. Hal ini mungkin disebabkan
oleh fakta bahwa sejumlah CLB sudah ada dalam matriks nanopartikel asam
stearat dan oleh karena itu jumlah CLB yang memerlukan
stabilisasi kurang. Efisiensi enkapsulasi obat yang rendah untuk SLN, PEG-SLN
dan NLC menandakan kelemahan nanopartikel lipid berdasarkan lipida padat.
Adsorpsi (dan kompleksasinya).
DDAB pada asam stearat-CLB nanopartikel juga mengubah farmakokinetik
dan biodistribusi CLB, seperti yang ditunjukkan oleh pembersihan plasma yang
cepat, toksisitas jaringan rendah dan akumulasi tumor yang lebih besar
LN dibandingkan dengan solusi CLB.

20
 DAFTAR PUSTAKA

Sharma, dkk. 2009. Formulation and Pharmacokinetics of Lipid Nanoparticles of

a Chemically Sensitive Nitrogen Mustard Derivate : Chlorambucil. New
Zealand : The University of Auckland.

21