Nama : Olyani Halawa

NIM : 4182220009
Kelas : PSB A 2018
Matakuliah : Biologi Molekular
Tugas Rekayasa Ide

Judul Jurnal : OPTIMASI SUHU ANNEALING PROSES PCR AMPLIFIKASI GEN

shv BAKTERI Escherichia coli PASIEN ULKUS DIABETIK

Metode Penelitian :

1. Ekstraksi DNA E. coli

Pelet bakteri E. coli yang digunakan untuk tahapan ekstraksi DNA didapat dengan 1 ml
kultur cair yang di sentrifugasi. Pelet bakteri E. coli kemudian diekstraksi melalui tiga tahap.
Tahapan pertama adalah proses pelisisan dengan menggunakan buffer R1, buffer R2 dan
proteinase K. Pelet ditambahkan buffer R1 dan proteinase K kemudian diinkubasi selama 20
menit pada suhu 37°C, selanjutnya disentrifugasi dan dibuang supernatan. Pelet kemudian
diresuspensi dengan buffer R2 dan proteinase K kemudian diinkubasi 65°C 20 menit (digojog
tiap 5 menit). Tahapan kedua yaitu pemisahan DNA dengan menggunakan buffer BG dan etanol
absolut. Buffer BG ditambahkan dan diinkubasi 65°C selama 10 menit, kemudian ditambahkan
etanol absolut. Sampel ekstraksi kemudian dipindahkan ke dalam kolom dan disentrifugasi
kemudian dibuang supernatan. Tahapan ketiga yaitu pemurnian DNA dengan wash buffer dan
disentrifugasi selama 1 menit 10.000 rpm kemudian supernatan dibuang (duplo). DNA bakteri
kemudian dielusi kebagian bawah kolom dengan penambahan elution buffer dan disentrifugasi
10.000 rpm selama 1 menit. Hasil ekstraksi DNA bakteri E. coli kemudian disimpan di suhu
-20°C.

2. Amplifikasi Gen shv

 Amplifikasi gen shv dengan Primer forward 5' GGTTATGCGTTATATTCGCC 3’ dan
primer yang digunakan 5’ TTAGCGTTGCCAGTGCTC 3’ reverse shv. Amplifikasi PCR
menggunakan reagen PCR kit, tahapan dilakukan dengan mencampurkan PCR MasterMix,
primer forward, primer reverse, DNA tamplate dan RNAse-Free Water sebanyak 25 µl untuk
setiap PCR tube. Tahapan PCR yang dilakukan dengan suhu annealing masingmasing 50°C,
54°C, 56°C, 57°C, 60°C dan 62°C.

3. Elektroforesis

Analisis hasil amplifikasi gen shv dengan PCR dilakukan dengan metode elektroforesis
agarosa. Buffer TAE 1x digunakan sebagai fase gerak, gel agarosa sebagai fasa diam. Campuran
agarosa ditambahkan gel red 3 µl dibiarkan sampai hangat. Agarosa kemudian dituang ke dalam
tray elektroforesis dan dipasangi sisir kemudian didiamkan sampai agarosa mengeras. Sisir
dilepas setelah agarosa keras dan tray diputar sisinya, kemudian dituangkan buffer TAE sampai
tanda batas. Sampel elektroforesis berupa hasil PCR 5 μl ditambahkan loading dye 1 μl,
kemudian dimasukan ke dalam sumuran gel agarosa elektroforesis. DNA ladder KAPA dan
Norgen masing-masing 1 μl dimasukan ke dalam sumuran agarosa, ditambahkan kontrol negatif
berupa miliq water 5 μl dan loading dye 1 μl. Elektroforesis dijalankan dengan voltase 95 Volt
dan 50 mA selama 1 jam, hasil elektroforesis kemudian diamati dengan lampu UV.

4. Isolasi DNA Genomik

Isolasi DNA Genomik dilakukan sesuai dengan metode Wizard Genomic DNA
(Promega). Sampel kultur bakteri diambil 1 ose ditambah 1 ml aquades steril dalam tabung
mikrosentrifuga 1,5 ml, dibiarkan semalam. Sampel disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm
selama 2 menit, supernatant dibuang ke dalam tabung, ditambahkan 600 μl larutan lisis nuclei,
dikocok dengan pipet agar sel - sel tersuspensi. Sampel diinkubasi pada suhu 80oC selama 5
menit supaya sel menjadi lisis. Kemudian tabung dibolak - balik supaya tercampur. Sampel
diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit, didinginkan pada suhu kamar ke dalam sampel
ditambahkan 200 μl larutan protein presipitat, divortex pada kecepatan tinggi selama 20 detik
untuk mencampur protein presipitat dengan lisat sel. Sampel diinkubasi selama 5
menit,disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 3 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung
mikrosentrifuga. Kemudian pada sampel ditambahkan 600 μl isopropanol, dicampur dengan
membolak - balik tabung. Sampel disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 2 menit, supernatant
dibuang dan tabung dikeringkan dengan membalikkan di atas kertas tissue. Selanjutnya pada
sampel ditambahkan 600 μl etanol 70% dan dikocok dengan membolak - balikkan tabung
beberapa kali untuk mencuci DNA. Sampel disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 2 menit, isi
tabung dituang dan dikeringkan di atas kertas tissue, dibiarkan 10 - 15 menit (keringanginkan),
ditambahkan 100μl larutan DNA rehidrasi ke dalam tabung, diinkubasi pada suhu 4 oC semalam.
DNA disimpan pada suhu 2 - 8oC.

5. Amplifikasi DNA dengan PCR

Hasil isolasi DNA dianalisis menggunakan primer rfbE dengan posisi sekuens gen pada
strand 5’ 7441 - 7680 3’, ukuran produk PCR adalah 239 bp (Morin et al. 2004). Komposisi PCR
adalah 2 μL DNA template, 25 μL PCR master mix (Thermo Scientific), 2 μL primer F, 2 μL
primer R, 19 μL ddH2O dengan volume reaksi 50 μL. Setelah itu, dilakukan amplifikasi dengan
menggunakan Thermocyclersebanyak 30 siklus setiap siklus terdiri dari pradenaturasi pada suhu
95ºC selama 5 menit, denaturasi pada suhu 94ºC selama 1 menit,annealing pada suhu 56ºC
selama 1 menit, ekstensi pada suhu 72ºC selama 1 menit 30 detik dan ekstensi akhir pada suhu
72ºC selama 10 menit.