Tujuan dari pelaksanaan Validasi Metode Analisa (VMA) adalah untuk menunjukkan bahwa

semua metode tetap yang digunakan sesuai dengan tujuan penggunaannya dan selalu
memberikan hasil yang dapat dipercaya.  Jadi, dalam Validasi metode analisa yang diuji atau
divalidasi adalah PROTAP (prosedur tetap) pengujian yang bersangkutan. Misalnya, “Validasi
Metode Analisa Penetapan Kadar Zat Aktif Paracemol dalam Tablet Biogesic® dengan Metode
Spektrofotometri UV/Vis”, maka yang divalidasi atau diuji validitasnya adalah Prosedur Tetap
“Penetapan Kadar Zat Aktif Paracemol dalam Tablet Biogesic® dengan Metode
Spektrofotometri UV/Vis”.

PROTAP tersebut bisa disusun oleh Bagian QC atau oleh Bagian R&D. Apabila PROTAP-nya
belum tersedia maka harus dibuat terlebih dahulu, baru divalidasi. PROTAP metode analisa
tersebut, bisa jadi disusun berdasarkan :

1. Diambil (di-adopsi) dari berbagai literatur resmi, misalnya Farmakope Indonesia (FI),
Unite State Pharmacopea (USP), British Pharmacopea (BP) dan lain-lain (kompendial)
2. Berasal dari pengembangan sendiri (Eksporasi)
3. Modifikasi dari prosedur pengujian yang telah ada (Modifikasi).

Ruang Lingkup

 Validasi Metode Analisa dilakukan untuk S metoda analisa yang digunakan untuk
pengawasan kegiatan produksi, termasuk metode analisis yang digunakan dalam
menetapkan residu zat aktif pada validasi prosedur pembersihan.
 Validasi metode analisa umumnya dilakukan terhadap 4 jenis, yaitu :
1. uji identifikasi;
2. uji kuantitatif kandungan impuritas (impurity);
3. uji batas impuritas; dan
4. uji kuantitatif zat aktif dalam sampel bahan aktif obat atau obat atau komponen
tertentu dalam obat.

Note : Metode analisis lain, seperti uji disolusi untuk obat atau penentuan ukuran partikel untuk
bahan aktif obat, hendaklah juga divalidasi

 Dilakukan dengan semua peralatan yang telah dikalibrasi dan diuji kesesuaian sistemnya
(alat dan sistem sudah dikualifikasi).
 Menggunakan bahan baku pembanding yang sudah dibakukan dan disimpan ditempat
yang sesuai.

Parameter Uji

Dalam bahasa yang sederhana, dalam VMA ini kita akan menguji cara-cara pemeriksaan atau
pengujian yang kita lakukan (misalnya identifikasi, penetapan kadar zat aktif, menguji
sisa/residu, dan sebagainya) agar kita yakin bahwa pengujian yang kita lakukan tersebut sudah
benar dan hasil pengujian yang dilakukan benar-benar terpercaya. Untuk melakukan pengujian
tersebut, kita menggunakan apa yang disebut dengan parameter uji. Parameter uji ini meliputi,
antara lain :

 akurasi (Accuracy);
 presisi (precision);
 ripitabilitas (repeatibilty);
 Presisi antara (intermediate precision);
 reprodusibilitas/keterulangan (reproducibility)
 spesivisitas (specify)/Selektifitas (selectivity);
 batas deteksi (limit of detection/LOD);
  batas kuantitasi (limit of quantitation/LOQ);
 linearitas (Linearity); dan
 rentang (range).

Penentuan Parameter uji yang dilakukan, sangat tergantung dari jenis Pengujian yang dilakukan
serta sumber dari prosedur pengujian tersebut. Lihat tabel berikut :

Pengertian Parameter Uji

Spesifitas/Selektifitas

 Merupakan kemampuan suatu metode analisa untuk membedakan senyawa yang diuji
dengan derivat/metabolitnya.
 Adanya perbedaan nyata antara resolusi antara dua puncak yang berdampingan dan
kemurnian tiap puncak dalam kromatogram.
  Untuk HPLC, Rs : 1,2 – 1,5.
 Untuk Spektrofotometer UV/Vis: jarak dua puncak berdampingan: resolution factor  
(Rf) > 2,5.
 Lakukan scanning (pemindaian) sampel yang diuji lihat kromatogram dari dua puncak
yang berdekatan (Rs) harus tidak kurang dari 1,5 atau terlihat adanya puncak yang
terpisah dari scanning dengan spektrofotometer UV/Vis.
 Pemisahan dua puncak yang berdekatan dalam kromatogram, resolusi (R) ditentukan
dengan persamaan :

Di mana t2 dan t1 adalah waktu retensi dua komponen, W1 dan W2 adalah lebar puncak.
Komponen pertama dan komponen kedua yang diukur dengan jalan ekstrapolasi sisi puncak
yang relatif lurus sampai garis dasar (base line).

Resolusi harus lebih besar dari 1,5.

Hasil Kromatogram Uji Selektifitas/Spesifitas yang memenuhi persyaratan

 
Hasil Kromatogram uji selektifitas yang tidak memenuhi persyaratan

Linearitas

 Merupakan kemampuan suatu metode analisa untuk menunjukkan hubungan secara

langsung atau proporsional antara respons detektor dengan perubahan konsentrasi analit
 Diuji secara statistik, yaitu Linear Regression (y = a + bx); dimana b adalah
kemiringan slope garis regresi dan a adalah perpotongan dengan sumbu y.

                                                ∑ (x – Xbar)(y- Ybar)

Koefisien korelasi (r) = ——————————–

√[ ∑ (x –Xbar)∑ (y- Ybar)]

x adalah pengukuran individual dalm N pengukuran x (bar) adalah nilai rata-rata pengukuran; y
adalah nilai individual sebenarnya dalam N nilai sebenarnya dan y (bar) adalah nilai rata-rata
sebenarnya.

 Pengujian dilakukan paling tidak dengan menggunakan 5 kadar yang berbeda, kemudian
dilihat apakah memberikan respons yang linear apa tidak, yang ditunjukkan dengan nilai
r ≥ 0,98.
Pegujian Linearitas

Akurasi (ketepatan)

 Merupakan kemampuan suatu metode analisa untuk memperoleh nilai yang sebenarnya
(ketepatan pengukuran).
 Terdapat 5 metode penentuan akurasi untuk penetapan kadar bahan aktif obat dalam
bahan baku dan produk obat, yaitu :
1. Menggunakan metode analisis untuk menetapkan kadar analit dalam bahan baku
berkhasiat yang diketahui kemurniannya (misalnya bahan baku pembanding sekunder).
2. Bahan baku berkhasiat atau cemaran dalam jumlah yang diketahui ditambahkan
kedalam plasebo. Metode analisis ini akan digunakan untuk penetapan kadar bahan baku
berkhasiat/cemaran dalam produk obat.
3. Bila plasebo tidak bisa diperoleh, verifikasi akurasi metode dapat dilakukan
dengan teknik standar adisi, yaitu dengan menambahkan sejumlah tertentu analit
kedalam produk obat yang telah diketahui kadarnya. Metode analisis ini digunakan untuk
penetapan kadar bahan baku berkhasiat/cemaran dalam produk obat
4. Menambahkan cemaran dalam jumlah tertentu ke dalam bahan baku
berkhasiat/produk obat. Metode analisis ini digunakan untuk penetapan kadar cemaran
dalam bahan baku berkhasiat dan produk obat
5. Membandingkan dua metode analisis untuk mengetahui ekivalensinya, yaitu
membandingkan hasil yang diperoleh dari metode analisis yang divalidasi terhadap hasil
yang diperoleh dari metode analisis yang valid (akurasi metode analisis yang valid ini
telah diketahui). Metode analisis ini digunakan untuk penetapan kadar bahan baku
berkhasiat dalam bahan baku berkhasiat, produk obat dan penetapan kadar cemaran.

 Akurasi dinyatakan sebagai prosentase (%) perolehan kembali (recovery).

 Akurasi dinilai dengan menggunakan sedikitnya 9 penentuan dengan sedikitnya 3 tingkat
konsentrasi dalam rentang pengujian metode analisis tersebut (misalnya 3 konsentrasi/3
replikasi untuk tiap prosedur analisis lengkap).
 Ketepatan metode analisa dihitung dari besarnya rata-rata (mean, x) kadar yang diperoleh
dari serangkaian pengukuran dibandingkan dengan kadar sebenarnya.
 

Hasil analisis

Recovery =   —————–       x 100%

Nilai sebenarnya

Syarat recovery : 98 – 102 %

Presisi (Ketelitian)

 Merupakan kemampuan suatu metode analisis untuk menunjukkan kedekatan dari suatu
seri pengukuran yang diperoleh dari sampel yang homogen.

 Terdapat 3 kategori pengujian presisi, yaitu :

1. Keterulangan (repeatability), dinilai dengan menggunakan minimum 9 penentuan
dalam rentang penggunaan metode analisis tersebut (misalnya 3 konsentrasi/3 replikasi).
2. Presisi Antara, yaitu perbedaan antar operator/analis dengan sumber reagensia
dan hari yang berbeda.
3. Reprodusibilitas, dengan menggunakan beberapa laboratorium untuk validasi
metode analisis, agar diketahui pengaruh lingkungan yang berbeda terhadap kinerja
metode analisis.

Macam-macam Presisi

 Presisi dinyatakan dalam bentuk RSD (relative standart deviation) atau SRB (sebaran
baku relatif) .
 Persyaratan RSD sebagai berikut :
Batas Deteksi (Limit of Detection/LOD)

 Merupakan jumlah analit terkecil yang masih bisa dideteksi namun tidak perlu dapat
terukur.
 Beberapa pendekatan yang dapat digunakan untuk menentukan batas deteksi tergantung
pada jenis metode analisis apakah metode analisis instrumental atau noninstrumental.
1. Berdasarkan evaluasi visual. Evaluasi visual dapat digunakan untuk metode
analisis noninstrumental,  tapi dapat juga digunakan untuk metode analisis instrumental.
Batas deteksi ditentukan dengan melakukan analisis terhadap sampel yang diketahui
konsentrasinya dan menetapkan kadar terendah yang dapat dideteksi dengan baik.
2. Berdasarkan rasio signal terhadap noise. Pendekatan ini hanya dapat diterapkan
pada metode analisis yang memberikan baseline noise. Penentuan signal to noise
dilakukan dengan membandingkan pengukuran signal sampel yang diketahui
mengandung analit dalam konsentrasi rendah dan blanko, kemudian dapat ditetapkan
konsentrasi minimum analit yang dapat dideteksi dengan baik. Rasio signal to noise
sama dengan 3 atau 2 : 1 umumnya dianggap dapat diterima untuk memperkirakan batas
deteksi.

 Simpangan respon dan kemiringan (“slope”) kurva kalibrasi :

Batas deteksi dapat dinyatakan sebagai :

LOD

Batas Kuantitasi (Limit of Quantitation/LOQ)

  Merupakan jumlah analit terkecil yang yang masih bisa diukur dengan akurat (tepat) dan
presisi (teliti)/reprodusible.
 Beberapa pendekatan yang dapat digunakan untuk penentuan batas kuantitasi
tergantung pada jenis metode analisis instrumental atau noninstrumental.
1. Berdasarkan evaluasi visual
Evaluasi visual dapat digunakan untuk metode analisis noninstrumental, tapi dapat juga
digunakan untuk metode analisis instrumental. Batas kuantitasi ditentukan dengan
melakukan analisis terhadap sampel yang diketahui konsentrasinya dan  menetapkan
kadar terendah analit yang dapat ditentukan secara kuantitatif dengan akurasi dan presisi
yang dapat diterima
2. Berdasarkan rasio signal terhadap noise :
Pendekatan ini hanya dapat digunakan pada metode analisis yang memberikan baseline
noise. Penentuan rasio signal terhadap noise dilakukan dengan membandingkan signal
yang diukur dari sampel yang mempunyai konsentrasi analit yang rendah dan blankonya,
kemudian ditentukan konsentrasi terendah analit yang dapat ditetapkan secara kuantitatif
dengan baik, umumnya pada rasio signal terhadap noise 10:1.
3. Simpangan baku dari respon dan kemiringan (slope) kurva kalibrasi :
Batas kuantitasi dapat dinyatakan sebagai :

LOQ

Ketegaran (robustness)

 Merupakan kapasitas suatu metode analisis untuk TIDAK terpengaruh oleh variasi-
variasi kecil dalam parameter metode analisa.
 Contoh variasi kecil dalam metode analisa secara HPLC, antara lain: pH fase gerak,
suhu, tekanan, stabilitas, jumlah pelarut organik yang dimodifikasi, konsentrasi buffer,
konsentrasi additive, flow rate, suhu kolom, dan lain-lain.

Kriteria Penerimaan

Metode Analisa dinyatakan memenuhi syarat (valid), jika :

 Seluruh parameter uji (Spesifitas/selektifitas, Linearitas, Akurasi, Presisi, LOD, LOQ

dan Robustness) memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan.
  Tidak ada perbedaan bermakna antar analis atau antar dosis yang diuji atau antar lab. (t
uji < t tabel).

Validasi Ulang

Validasi ulang mungkin diperlukan pada kondisi sebagai berikut:

 perubahan sintesis bahan aktif obat;

 perubahan komposisi produk jadi; dan
 perubahan prosedur analisis.

Tingkat validasi ulang yang diperlukan tergantung pada sifat perubahan. Perubahan tertentu lain
mungkin juga memerlukan validasi ulang.
 Prosedur Tetap Halaman 1 dari 13
VALIDASI METODE
Nama ANALISIS
Perusahaan Departemen Seksi No. 1
Pengawasan Mutu Validasi Tanggal
Dibuat oleh Diperiksa oleh Disetujui Mengganti
Tanggal Tanggal oleh No. -
Tanggal Tanggal -

1. TUJUAN
Untuk memberikan petunjuk pelaksanaan validasi terhadap metode analisis
agar metode tetap sesuai dengan tujuan penggunaannya dan selalu memberikan
hasil yang dapat dipercaya.

2. RUANG LINGKUP
• Prosedur ini berlaku untuk semua metode analisis kompendial dan
nonkompendial yang digunakan di Laboratorium Pengawasan Mutu di
Pabrik BUNGA FARMA
• Prosedur ini juga berlaku untuk metode analisis yang digunakan dalam
menetapkan residu zat aktif pada validasi prosedur pembersihan.
• Prosedur ini berlaku pula untuk validasi ulang metode analisis, misal dalam
kasus berikut ini:
- perubahan proses sintesis bahan berkhasiat,
- perubahan komposisi produk jadi, bila perlu dan
- perubahan prosedur analisis

3. TANGGUNG JAWAB
3.1 Manajer Pengawasan Mutu bertanggung jawab untuk:
• Menyiapkan dan mengkaji ulang secara periodis Protap ini.
• Melaksanakan pelatihan teknis laboratorium dan pelatihan lain yang
sesuai terhadap semua personil yang terkait dengan validasi dan
melakukan evaluasi hasil pelatihan sebelum validasi dilaksanakan.
• Memastikan bahwa semua metode analisis divalidasi sebelum
digunakan untuk pengujian rutin.
• Menyiapkan Protokol Validasi untuk tiap metode analisis dan menyusun
Laporan Validasi berdasarkan protokol tersebut
3.2 Manajer Pemastian Mutu bertanggung jawab untuk:
• Melakukan pengkajian dan menyetujui Protap ini serta Protokol
Validasi sebelum validasi dilakukan
 Prosedur Tetap Halaman 2 dari 13
VALIDASI METODE
Nama ANALISIS
Perusahaan Departemen Seksi No. 1
Pengawasan Mutu Validasi Tanggal
Dibuat oleh Diperiksa oleh Disetujui Mengganti
Tanggal Tanggal oleh No. -
Tanggal Tanggal -
• Melakukan pengkajian terhadap data dalam Laporan Validasi
dan menjamin
kelengkapan laporan sebelum menandatanganinya.
3.3 Supervisor Pengawasan Mutu bertanggung Jawab untuk:
• Membuat jadwal pelaksanaan validasi, mengawasi pelaksanaannya dan
memeriksa kebenaran dan kelengkapan catatan pengujian.
• Menjamin bahwa status kalibrasi semua peralatan dan instrumen yang
digunakan untuk validasi telah diperbaharui.
• Menjamin bahwa semua Protap yang berhubungan dengan validasi
metode analisis telah diperbaharui sesuai protokol validasi.
• Menjamin bahwa semua bahan yang digunakan untuk validasi termasuk
reagensia dan baku pembanding belum kadaluwarsa.
3.4 Analis di Bagian Pengawasan Mutu bertanggung Jawab untuk:
• Melaksanakan validasi metode analisis sesuai dengan Protokol Validasi.
• Mencatat semua hasil uji dalam format yang sesuai.
• Melaporkan pelaksanaan validasi kepada supervisor.

4. PROSEDUR
4.1 Protokol validasi harus mencakup :
• Tujuan
• Ruang Lingkup
• Prosedur langkah demi langkah
• Metode untuk evaluasi
• Kriteria keberterimaan
• Dokumentasi dan Laporan
• Rekomendasi
 Prosedur Tetap Halaman 3 dari 13
VALIDASI METODE
Nama ANALISIS
Perusahaan Departemen Seksi No. 1
Pengawasan Mutu Validasi Tanggal
10/11/2016
Dibuat oleh Diperiksa oleh Disetujui Mengganti
Tanggal Tanggal oleh Tanggal No. -
Tanggal -
4.2 Tentukan dan lakukan evaluasi parameter validasi sesuai dengan tipe
Pengujian
metode analisis yang akan divalidasi. Impuritas
Berikut Penetapan
ini adalah Kadar
persyaratan/
Parameter validasi
parameter validasi:Identifikasi Kuantitatif Batas
- Disolusi*
- Kandungan/potensi
Akurasi - + - +
Presisi
Ripitabilitas - + - +
Presisi Intermediat - + - + (1)
Spesifisitas (2) + + + +
Limit Deteksi - - (3) + -
Limit Kuantitasi - + - -
Linearitas - + - +
(-) Tidak
Rentang - + - +

dipersyaratkan (+)
Dipersyaratkan
(1) Dalam hal telah dilakukan test reprodusibiltas, maka presisi
intermediate tidak dipersyaratkan.
(2) Kekurangan spesifisitas dari salah satu prosedur analisis dapat
dikompensasikan dengan prosedur analisis yang lain yang dapat
menunjang
(3) Hanya diperlukan pada kasus tertentu
*) Hanya untuk mengetahui kadar zat terlarut
Penerapan parameter validasi metode analisis :
a. Non kompendial : Sesuai dengan tabel di atas
b. Kompendial yang dimodifikasi : Sesuai dengan tabel atau parameter
yang berkaitan dengan modifikasi
c. Kompendial : verifikasi, yaitu
 Metode Parameter Verifikasi
Kadar Akurasi
Presisi
Spesifisitas
Impuritas Akurasi
Presisi Prosedur Tetap Halaman 4 dari 13
Nama Perusahaan Spesifisitas
VALIDASI METODE
Limit Deteksi / Kuantitasi
Identifikasi Spesifisitas ANALISIS
Departemen Seksi No. 1
Pengawasan Mutu Validasi Tanggal
Dibuat oleh Diperiksa oleh Disetujui Mengganti
Tanggal Tanggal oleh No. -
Tanggal Tanggal -

d. Validasi prosedur pembersihan:

• Akurasi
• Presisi
o Ripitabilitas
o Presisi Intermediat
• Spesifisitas
• Limit Deteksi
• Limit Kuantitasi
• Linearitas
• Rentang
• Perolehan Kembali:
o Cara usap
o Cara bilas
o Ketangguhan

4.2.1 Spesifisitas
Spesifisitas merupakan ukuran seberapa spesifik metode analisis.
Spesifitas metode analisis diuji terhadap bahan aktif obat, bahan
pembantu (plasebo), pelarut, impuritas dan produk jadi
 Prosedur Tetap Halaman 5 dari 13
Nama Perusahaan
VALIDASI METODE
ANALISIS
Departemen Seksi No. 1
Pengawasan Mutu Validasi Tanggal
Dibuat oleh Diperiksa oleh Disetujui Mengganti
Tanggal Tanggal oleh No. -
Tanggal Tanggal -
Bila menggunakan metode KCKT:
Data yang disajikan • Resolusi antaraPersyaratan
puncak yang berdampingan terpisah secara nyata
atau sesuai persyaratan.
• Linear secara visual
• Kurva signal vs konsentrasi analit
• Koefisien korelasi ≥ 0,98
• Kromatogram seluruh hasil uji disajikan dalam bentuk 1 gambar
• Persamaan regresi -
(“overlaid”)
• Convidence interval -
4.2.2 Linearitas
• Residu jumlah kuadrat (“residual sum -
of squares”) Untuk mengetahui apakah kuantitas yang terukur proporsional
terhadap kadar senyawa uji dalam sampel
Linearitas diuji sesuai RENTANG yang ditetapkan
Pengujian dapat dilakukan minimal dengan 5 tingkat konsentrasi
• Bahan aktif obat :pengenceran larutan induk
• Produk jadi : penimbangan terpisah sesuai rentang

4.2.3 Rentang
Rentang minimum berikut ini berlaku untuk:
4.2.3.1 Penetapan kadar bahan aktif obat: lazimnya konsentrasi zat
ujiberkisar antara 80 hingga 120% kadar yang tertera pada label;
4.2.3.2 Keseragaman kandungan: meliputi konsentrasi zat uji sekurang-
kurangnya berkisar antara 70 hingga 130% pernyataan kadar
pada label, kecuali diperlukan rentang yang lebih lebar dapat
digunakan, tergantung pada sifat
bentuk sediaan (misalnya, inhaler dosis terukur);
 Prosedur Tetap Halaman 6 dari 13
Nama Perusahaan
VALIDASI METODE
ANALISIS
Departemen Seksi No. 1
Pengawasan Mutu Validasi Tanggal
Dibuat oleh Diperiksa oleh Disetujui Mengganti
Tanggal Tanggal oleh No. -
Tanggal Tanggal -
4.2.3.3Pengujian disolusi : lebih kurang 20% syarat spesifikasi
misalnya: syarat spesifikasi untuk sediaan yang pelepasannya
terkendali meliputi rentang dari 20%, setelah 1 jam, hingga 90%
sesudah 24 jam, maka rentang yang divalidasi menjadi 0 - 110%
pernyataan kadar pada label;
4.2.3.4Penentuan cemaran: rentang konsentrasi zat uji mulai dari batas
cemaran yang dilaporkan hingga 120% syarat spesifikasi; dan
4.2.3.5Bila validasi metode analisis penetapan kadar dan penetapan
cemaran dilakukan bersama-sama sekaligus dan hanya
menggunakan satu standar 100% saja, maka pengujian linearitas
harus meliputi rentang dari kadar cemaran yang dilaporkan
hingga 120% syarat kadar dalam spesifikasi.
4.2.3.6Konsentrasi kadar bahan aktif obat dengan “stability overage”
agar memperhatikan persyaratan pada saat pelulusan maupun
paska pemasaran.
4.2.4 Akurasi
Akurasi metode pengujian dinilai sesuai rentang pengujian dengan 5
cara penentuan metode analisis untuk penetapan kadar bahan aktif obat
dalam bahan awal dan produk jadi :
4.2.4.1 Menggunakan metode analisis untuk menetapkan kadar analit
dalam bahan aktif obat yang diketahui kemurniannya (misalnya
bahan awal pembanding sekunder).
4.2.4.2 Bahan aktif obat atau cemaran dalam jumlah yang diketahui
ditambahkan kedalam plasebo. Metode analisis ini akan
digunakan untuk penetapan kadar bahan aktif obat / cemaran
dalam produk obat.
4.2.4.3 Bila plasebo tidak bisa diperoleh, verifikasi akurasi metode
dapat dilakukan dengan teknik standar adisi, yaitu dengan
menambahkan sejumlah tertentu analit ke dalam produk obat
yang telah diketahui kadarnya. Metode analisis ini digunakan
untuk penetapan kadar bahan aktif / cemaran dalam produk obat.
 Prosedur Tetap Halaman 7 dari 13
Nama Perusahaan
VALIDASI METODE
ANALISIS
Departemen Seksi No. 1
Pengawasan Mutu Validasi Tanggal
Dibuat oleh Diperiksa oleh Disetujui Mengganti
Tanggal Tanggal oleh No. -
Tanggal Tanggal -
4.2.4.4Menambahkan cemaran dalam jumlah tertentu ke dalam bahan
aktif / produk obat. Metode analisis ini digunakan untuk
penetapan kadar cemaran dalam bahan aktif obat dan produk
obat.
4.2.4.5Membandingkan dua metode analisis untuk mengetahui
ekivalensinya, yaitu membandingkan hasil yang diperoleh dari
metode analisis yang divalidasi terhadap hasil yang diperoleh
dari metode analisis yang valid (akurasi metode analisis yang
valid ini telah diketahui). Metode analisis ini digunakan untuk
penetapan kadar bahan aktif obat dalam bahan aktif obat, produk
obat dan penetapan kadar cemaran.

Akurasi dinilai menggunakan minimal 9 (sembilan) penentuan dari 3

(tiga) tingkat konsentrasi yang berbeda dalam rentang pengujian metode
analisis tersebut dan masing- masing konsentrasi 3 (tiga) kali penetapan.
Data yang disajikan Persyaratan

• Perolehan kembali (“recovery”) • 98 – 102 %

• RSD (Simpangan Baku/Rata-rata x 100%) • ≤ 2%
• “Confidence interval” -

4.2.5 Presisi
Dikenal tiga tipe presisi :
4.2.5.1 Keberulangan
(“Repeatability”)
Keberulangan dinilai
terhadap :
• Keberulangan SISTEM
 minimum 6 penentuan pada konsentrasi 100% kadar analit
• Keberulangan METODE
 minimum 9 penentuan dalam rentang penggunaan metode
analisis tersebut (3 konsentrasi yang berbeda, masing-
masing 3 replikasi )
 Prosedur Tetap Halaman 8 dari 13
VALIDASI METODE
Nama ANALISIS
Perusahaan Departemen Seksi No. 1
Pengawasan Mutu Validasi Tanggal
Dibuat oleh Diperiksa oleh Disetujui Mengganti
Tanggal Tanggal oleh No. -
Tanggal Tanggal -
4.2.5.2 Presisi Antara
• Dapat menggunakan beberapa operator dengan alat dan hari
yangberbeda.
4.2.5.3 Reprodusibilitas
Menggunakan minimal 2 laboratorium untuk validasi metode
analisis, agar diketahui pengaruh lingkungan yang berbeda
terhadap kinerja metode analisis.
Data yang
disajikan :
• Rata-rata
• RSD adalah (Simpangan Baku/Rata-rata) x
100%, Persyaratan RSD adalah sebagai
berikut :
No Tipe Metode Analisis Persyaratan RSD
(misal)
1. Prosedur Penetapan Kadar bahan aktif obat tidak lebih dari 2%
2. Metode analisis untuk penetapan kadar
impuritas:
Batas impuritas : 1 - 10% tidak lebih dari 2%
0,01% tidak lebih dari
1 ppm 10% tidak lebih
dari 20%

 “Confidence Interval”

4.2.6 Batas Deteksi

Konsentrasi terendah senyawa uji yang terkandung dalam sampel yang
dapatdideteksi.Beberapa pendekatan yang dapat digunakan untuk menentukan
batas deteksitergantung pada jenis metode analisis apakah metode analisis
instrumentalatau noninstrumental.
4.2.6.1Berdasarkan evaluasi visual
Evaluasi visual dapat digunakan untuk metode analisis noninstrumental,tapi dapat
juga digunakan untuk metode analisisinstrumental. Batas deteksi ditentukan
dengan melakukan analisisterhadap sampel yang diketahui konsentrasinya dan
menetapkankadar terendah yang
dapat dideteksi dengan baik.
 Prosedur Tetap Halaman 9 dari 13
Nama Perusahaan
VALIDASI METODE
ANALISIS
Departemen Seksi No. 1
Pengawasan Mutu Validasi Tanggal
Dibuat oleh Diperiksa oleh Disetujui Mengganti
Tanggal Tanggal oleh No. -
Tanggal Tanggal -
4.2.6.2Berdasarkan rasio signal terhadap noise
Pendekatan ini hanya dapat diterapkan pada metode analisis yangmemberikan
baseline noise. Penentuan signal to noise dilakukandengan membandingkan
pengukuran signal sampel yang diketahuimengandung analit dalam konsentrasi
rendah dan blanko, kemudiandapat ditetapkan konsentrasi minimum analit yang
dapat dideteksidengan baik. Rasio signal to noise sama dengan 3 atau 2 :
1umumnya dianggap dapat diterima untuk memperkirakan batas deteksi.
4.2.6.3Simpangan respon dan kemiringan (“slope”) kurva
kalibrasi : Batas deteksi dapat dinyatakan sebagai :
3.3 s
DL = S
Keterangan rumus :
DL = Batas deteksi
σ = simpangan baku respon
S = kemiringan (slope) kurva kalibrasi.
• Slope dapat ditentukan dari kurva kalibrasi analit
• σ dapat ditentukan dengan :
Simpangan baku dari
blanko
• Mengukur beberapa respon dari larutan blanko dan hitung simpangan
baku dari respon
Kurva kalibrasi
• Kurva kalibrasi dibuat dengan contoh yang mempunyai rentang di sekitar
Batas Deteksi. Residu simpangan baku (residual standard deviation) atau
simpangan baku dari y-intercepts dari garis regresi adalah σ (simpangan
baku)
 Prosedur Tetap Halaman 10 dari
Nama Perusahaan 13
VALIDASI METODE
ANALISIS
Departemen Seksi No. 1
Pengawasan Mutu Validasi Tanggal
Dibuat oleh Diperiksa oleh Disetujui Mengganti
Tanggal Tanggal oleh No. -
Tanggal Tanggal -
4.2.7 Batas Kuantitasi
Konsentrasi terendah senyawa uji yang terkandung dalam sampel yang
dapatditetapkan secara kuantitatif dan reprodusibel.Beberapa pendekatan yang
dapat digunakan untuk penentuan batas kuantitasitergantung pada jenis metode
analisis instrumental atau noninstrumental.
4.2.7.1Berdasarkan evaluasi visual
Evaluasi visual dapat digunakan untuk metode analisis noninstrumental,tapi dapat
juga digunakan untuk metode analisisinstrumental. Batas kuantitasi ditentukan
dengan melakukananalisis terhadap sampel yang diketahui konsentrasinya
danmenetapkan kadar terendah analit yang dapat ditentukan secarakuantitatif
dengan akurasi dan presisi yang dapat diterima
4.2.7.2Berdasarkan rasio signal terhadap noise :
Pendekatan ini hanya dapat digunakan pada metode analisis yangmemberikan
baseline noise. Penentuan rasio signal terhadap noisedilakukan dengan
membandingkan signal yang diukur dari sampelyang mempunyai konsentrasi analit
yang rendah dan blankonya,kemudian ditentukan konsentrasi terendah analit yang
dapatditetapkan secara kuantitatif dengan baik, umumnya pada rasiosignal
terhadap noise 10:1.
4.2.7.3Simpangan baku dari respon dan kemiringan (slope) kurva
kalibrasi : Batas kuantitasi dapat dinyatakan sebagai :
s
LOQ = 10
S
Keterangan rumus :
LOQ = batas kuantitasi
σ = Simpangan baku respon
S = Kemiringan (slope) kurva kalibrasi
• Slope dapat ditentukan dari kurva kalibrasi analit
• σ dapat ditentukan dengan
 Prosedur Tetap Halaman 11 dari
Nama Perusahaan 13
VALIDASI METODE
ANALISIS
Departemen Seksi No. 1
Pengawasan Mutu Validasi Tanggal
Dibuat oleh Diperiksa oleh Disetujui Mengganti
Tanggal Tanggal oleh No. -
Tanggal Tanggal -
Simpangan baku dari blanko
• Mengukur beberapa respon dari larutan blanko danhitung simpangan
baku dari respon
Kurva kalibrasi
• Kurva kalibrasi dibuat dengan contoh yang mempunyai rentang di sekitar
Batas Deteksi. Residu simpangan baku (residual standard deviation) atau
simpangan baku dari y-intercepts darigaris regresi adalah σ (simpangan
baku)
4.2.8 Ketangguhan (“Robustness”)
Ketangguhan ditentukan pada saat tahap pengembangan dan tergantung
darikebutuhan.
Metode hendaklah handal terhadap variasi parameter
yangditetapkan Misal : stabilitas larutan analit
Contoh uji ketangguhan untuk metode analisis yang menggunakankromatografi cair
kinerja tinggi (KCKT), tetapkan:
• Pengaruh variasi pH dalam fasa gerak terhadap hasil analisis;
• Pengaruh variasi komposisi fasa gerak terhadap hasil analisis;
• Pengaruh perbedaan merk atau nomor lot dari kolom terhadap hasilanalisis; dan
• Pengaruh perbedaan suhu dan laju alir terhadap hasil analisis.

4.2.9 Uji Kesesuaian Sistem (UKS)

UKS merupakan bagian tak terpisahkan dari pengujian yang didasarkan pada
peralatan, instrumen, elektronik, pelaksanaan analisis dan sampelyang akan
diuji
o Dilakukan terhadap minimal 5 - 6 hasil analisis dilakukan terhadaplarutan
baku dan ditentukan:
• resolusi antara dua puncak yang berdekatan;
• ukuran faktor ikutan (“tailing factor”);
 Prosedur Tetap Halaman 12 dari
13
VALIDASI METODE
Nama ANALISIS
Perusahaan Departemen Seksi No. 1
Pengawasan Mutu Validasi Tanggal
Dibuat oleh Diperiksa oleh Disetujui Mengganti
Tanggal Tanggal oleh No. -
Tanggal Tanggal -
• relative standard deviation (RSD) dari hasil penyuntikan enam kali larutan
baku;
• angka lempeng teoritis;
• ukuran faktor kapasitas kolom; dan
• waktu retensi relatif.

4.3 Bila ada penyimpangan siapkan laporan termasuk justifikasi sesuai Protap
Penanganan Hasil Uji di Luar Spesifikasi No. ………
4.4 Dokumentasi dan Laporan Validasi
4.4.1 Buat laporan validasi untuk metode analisis yang divalidasi
denganmenggunakan Format Laporan Validasi
Catatan:
Dalam laporan ini tercakup tanggal mulai dan tanggal selesai validasi,
hasilpengamatan, masalah yang dijumpai, kelengkapan informasi
yangdikumpulkan, hasil uji dan analisis statistik, disposisi apakah hasil uji
memenuhikriteria keberterimaan atau tidak, lokasi uji dan data asli serta informasi
lainyang relevan dengan pelaksanaan validasi.
4.4.2 Buat kesimpulan tentang validitas metode analisis terhadap masing-masinghasil
uji dan replikasinya.
4.4.3 Serahkan Laporan Validasi kepada Manajer Pemastian Mutu untuk
memerolehpersetujuan akhir.
5. Lampiran
5.1 Format Protokol Validasi Metode Analisis*
5.2 Format Laporan Validasi
*Dalam Contoh ini, tidak dilengkapi
 Prosedur Tetap Halaman 13 dari
13
VALIDASI METODE
Nama Perusahaan ANALISIS
Departemen Seksi No. 1
Pengawasan Mutu Validasi Tanggal
Dibuat oleh Diperiksa oleh Disetujui Mengganti
Tanggal Tanggal oleh No. -
Tanggal Tanggal -

6. Dokumen Rujukan
Tidak Ada Dokumen Rujukan

7. Riwayat
1. Dokumen ini merupakan dokumen yang pertama (No. 1) yang berlaku
mulai tanggal 10/11/2016

8. Distribusi
Asli : Kepala Bagian Pemastian Mutu
Kopi : Kepala Bagian Pengawasan
Mutu
Halaman 1 dari 18

PROTOKOL VALIDASI METODE ANALISIS PENETAPAN KADAR

PROTOKOL VALIDASI METODE ANALISIS

PENETAPAN KADAR INJEKSI SEFOTAKSIM

Nama : INJEKSI SEFOTAKSIM No. Protokol : 001

No. Produk : 602088 Tanggal Berlaku : 10/10/2021

Disusun oleh : Yola Anandita Tanggal :10/10/2021

Diperiksa oleh : Nur Atikah Tanggal : 10/10/2021

Disetujui oleh : Ramlah Tanggal : 10/10/2021

 PROTOKOL VALIDASI METODE ANALISIS
Anugrah Pharm PENETAPAN KADAR INJEKSI SEFOTAKSIM

Nama Produk : Injeksi Sefotaksim 1gr

Bentuk Sediaan : Injeksi
Kekuatan Sediaan : 1gr/IM IV
No. Protokol : 001
Tanggal Berlaku : 10/10/2021
Halaman : 2 dari 18
1. Tujuan:
Untuk membuktikan bahwa metode analisis yang digunakan dapat menetapkan
kadar injeksi sefotaksim secara konsisten dan memberikan hasil yang akurat.

2. Ruang Lingkup:
Metode analisis yang divalidasi adalah metode analisis dengan alat KCKT untuk
penetapan kadar injeksi sefotaksim No. : 602088

3. Referensi: Petunjuk Operasional Penerapan Cara Pembuatan Obat yang Baik 2018

4. Tanggung Jawab:
a. Kepala Instalasi Pengawasan Mutu bertanggung jawab untuk:
1) Menetapkan protokol validasi untuk metode analisis penetapan kadar injeksi
sefotaksim dan menyusun laporan validasi berdasarkan protokol tersebut.
2) Melakukan pengkajian dan menyetujui protokol validasi penetapan kadar
injeksi sefotakim sebelum dilakukan validasi.
3) Melakukan pengkajian terhadap data dalam laporan validasi dan menjamin
kelengkapan laporan sebelum ditandatangani dan diserahkan kepada
atasannyauntuk dimintakan persetujuan akhir dan pengesahan.
Melaksanakan pelatihanteknis laboratorium dan pelatihan lain yang sesuai
terhadap semua personil yangterkait dengan validasi ini dan melakukan
evaluasi hasil pelatihan sebelumvalidasi dilaksanakan.
b. Kepala Seksi Kimia-Fisika Instalasi Pengawasan Mutu bertanggung jawab untuk:
1) Membuat jadwal pelaksanaan validasi ini, mengawasi pelaksanaannya dan
memeriksa kebenaran dan kelengkapan catatan pengujian.
2) Menjamin bahwa status kalibrasi semua peralata dan instrumen yang
digunakan untuk validasi telah diperbaharui.
3) Menjamin bahwa semua protap yang berhubungan dengan validasi metode
analisis penetapan injeksi sefotaksim telah diperbaharui sesuai protokol
validasi.
4) Menyusun laporan validasi berdasar hasil dan data yang diperoleh.
 Halaman 3 dari 18
ANUGRAH PHARM
PROTOKOL VALIDASI METODE ANALISIS
PENETAPAN KADAR INJEKSI SEFOTAKSIM

c. Analis di Instalasi Pengawasan Mutu bertanggung jawab untuk :

1) Melaksanakan validasi metode analisis sesuai dengan protokol validasi.
2) Mencatat semua hasil uji dalam format yang tepat.
3) Melaporkan pelaksanaan validasi kepada supervisor.

5. Parameter Pengujian
Parameter pengujian yang dipakai untuk validasi adalah:
a. Uji Kesesuaian Sistem
b. Selektifitas
c. Spesifisitas
d. Akurasi
e. Presisi
f. Linearitas dan Rentang
g. Uji Batas Deteksi dan Batas kuantitasi (LOD dan LOQ)
h. Uji Kekuatan (Robustness)

6. Prosedur Pelaksanaan
a. Verifikasi
1) Lakukan verifikasi dokumen yang terkait dengan validasi.
2) Lakukan verifikasi status kualifikasi dan kalibrasi dari semua peralatan
yangdipakai.
3) Lakukan verifikasi pelatihan karyawan yang terkait dengan pelaksanaan
validasi.
b. Pembuatan larutan
1) Pelarut
Campuran dari aquades dan metanol (3:1)
2) Fase Gerak:
Fase gerak dibuat dengan komposisi campuran aquades dan metanol
(3:1),Campurkan 125 mL metanol dengan 375 mL aquades. Sebelum
digunakan, fase gerak disaring melalui membran filter 0,5 μm dengan
menggunakan vakum (Ditjen POM,1995).
3) Larutan Standar Sefotaksim
Ditimbang seksama ± 10,0 mg sefotaksim working standard (WS),
masukanke dalam labu ukur 100,0 mL, dilarutkan dengan fase gerak
campuran aquades metanol (3:1) sebanyak 20,0 mL, kemudian volumenya
dicukupkan dengan fase gerak hingga garis batas, hingga dihasilkan larutan
dengan konsentrasi 0,1mg/mL
 Halaman 4 dari 18
ANUGRAH PHARM

PROTOKOL VALIDASI METODE ANALISIS

PENETAPAN KADAR INJEKSI SEFOTAKSIM

Kemudian larutan tersebut dipipet 10,0 mL, dimasukkan ke dalam labu ukur
100,0mL dan ditambahkan pelarut sampai garis batas hingga dihasilkan
larutan dengan konsentrasi 0,01 mg/mL (U.S. Pharmacopeia 30, 2007).
4) Larutan Sampel
Ditimbang dan diserbukkan tidak kurang dari 20 tablet. Kemudian ditimbang
seksama setara sejumlah 100,0 mg serbuk sampel lalu dimasukkan kedalam
labu ukur 200,0 mL, lalu ditambahkan 100,0 mL fase gerak campuran
aquades-metanol (3:1), disonicate selama 5 menit kemudian volumenya
dicukupkan dengan fase gerak hingga garis batas. Kemudian larutan tersebut
dipipet 5,0 mL, dimasukkan ke dalam labu ukur 250 mL dan ditambahkan
pelarut sampai garis batas hingga dihasilkan larutan dengan konsentrasi 0,01
mg per mL, berdasarkan yang tertera pada etiket. Kemudian saring larutan
dengan menggunakan vakum dan membrane filter 0,5 μm dan ambil bagian
supernatan yang bersih (U.S. Pharmacopeia 30, 2007).
5) Larutan Plasebo
Timbang seksama sejumlah 100,0 mg serbuk eksipien lalu dimasukkan
kedalam labu ukur 100,0 mL, dilarutkan dengan fase gerak campuran
aquades-metanol (3:1) sebanyak 20,0 mL, disonicate selama 5 menit
kemudian volumenya dicukupkan dengan fase gerak hingga garis batas.
c. Uji Kesesuaian Sistem
1) Pengukuran Uji Kesesuaian Sistem
a) Dialirkan fase gerak melewati kolom selama tidak kurang dari 30 menit.
b) Disuntikkan 10,0 μl larutan standar sebanyak enam kali pada KCKT
dengan:

Fase diam : kolom L1 (oktadesil silana) 3,9 mm x

30 cm Fase gerak : aquades - metanol (3:1)
Laju alir : 1,5 ml/menit
Temperatur : Temperatur kolom dijaga pada
40ºC Detektor : UV
 Halaman 5 dari 18

ANUGRAH PHARM
PROTOKOL VALIDASI METODE ANALISIS
PENETAPAN KADAR INJEKSI SEFOTAKSIM

Panjang gelombang : 243 nm

c) Waktu retensi dicatat, kemudian dihitung faktor kapasitas (k’), faktor
ikutan(T), jumlah lempeng teoritis (N), efisiensi kolom (HETP), dan resolusi
(R).

2) Perhitungan
a) Faktor kapasitas (k’) = tR–tM
tM

dengan :

tR = waktu retensi zat

tM = waktu retensi zat inert

W 0,05
b) Faktor ikutan (T) = √
2f
dengan: W0,05 = jarak tepi muka sampai tepi belakang

puncak f = jarak dari maksimum puncak sampai tepi muka

puncak

c) Jumlah lempeng teoritis (N)

N = 16 (tR) 2
W

dengan:
N = jumlah lempeng teoritis
tR = waktu retensi
W = luas puncak

d) Efisiensi kolom (HETP)

HETP =L

dengan:

HETP = (Height Equivalent to A Theoretical

Plate) panjang lempeng teoritis
L (Length) = panjang kolom
N = jumlah plat teoritis
 Halaman 6 dari 18

ANUGRAH PHARM
PROTOKOL VALIDASI METODE ANALISIS
PENETAPAN KADAR INJEKSI SEFOTAKSIM

e) Resolusi (R) = 2 (tR2–tR1)

w1+w2
dengan : R =
resolusi tR =
waktu retensi W =
luas puncak

3) Syarat
a. Resolusi (R) parasetamol terkait senyawa A (cemaran) tidak kurang dari 2,0.
b. Jumlah lempeng teoritis (N) tidak dari 5000.
c. Faktor ikutan (T) adalah kurang dari atau sama dengan 2.
d. Faktor kapasitas (k’) adalah lebih dari 2.

Hasil yang diperoleh sebagai berikut :

Hasil Pengamatan Persyaratan
No Nama Sampel
k’ T N HETP R k’ T N R

2 2 5000 2,0

Kesimpulan:

d. Pembuatan Kurva Kalibrasi

1) Pembuatan kurva kalibrasi larutan standar
a) Timbang seksama ± 20,0 mg standar parasetamol,
b) Masukkan ke dalam labu ukur 200,0 mL,
c) Larutkan dengan fase gerak campuran air - metanol (3:1) sebanyak 20,0
mL,
d) kemudian volumenya dicukupkan dengan fase gerak hingga garis batas,
hingga dihasilkan larutan dengan konsentrasi 0,1 mg/mL.
 Halaman 7 dari 18
ANUGRAH PHARM PROTOKOL VALIDASI METODE ANALISIS
PENETAPAN KADAR INJEKSI SEFOTAKSIM
e) Pipet 40,0 mL dari larutan standar dan masukkan ke dalam labu ukur
100,0 mL.Tambahkan fase gerak sedikit demi sedikit hingga batas labu
ukur, homogenkan(konsentrasi 0,04 mg/mL).
f) Pipet 30,0 mL dari larutan standar dan masukkan ke dalam labu ukur
100,0 mL.Tambahkan fase gerak sedikit demi sedikit hingga batas labu
ukur, homogenkan(konsentrasi 0,03 μg/mL).
g) g) Pipet 20,0 mL dari larutan standar dan masukkan ke dalam labu ukur
100,0 mL.
h) Tambahkan fase gerak sedikit demi sedikit hingga batas labu ukur,
homogenkan(konsentrasi 0,02 mg/mL).
i) Pipet 10,0 mL dari larutan standar dan masukkan ke dalam labu ukur
100,0 mL.Tambahkan fase gerak sedikit demi sedikit hingga batas labu
ukur, homogenkan(konsentrasi 0,01 mg/mL).
j) Pipet 9,0 mL dari larutan standar dan masukkan ke dalam labu ukur 100
mL.Tambahkan fase gerak sedikit demi sedikit hingga batas labu ukur,
homogenkan(konsentrasi 0,009 mg/mL).
k) Pipet 8,0 mL dari larutan standar dan masukkan ke dalam labu ukur 10
mL.Tambahkan fase gerak sedikit demi sedikit hingga batas labu ukur,
homogenkan(konsentrasi 0,008 mg/mL).
l) Pipet 7,0 mL dari larutan standar dan masukkan ke dalam labu ukur 10
mL.Tambahkan fase gerak sedikit demi sedikit hingga batas labu ukur,
homogenkan(konsentrasi 0,007 mg/mL).

2) Pengukuran kurva kalibrasi Seotaksim

a) Disuntikkan 10 μl larutan standar dengan konsentrasi 0,04; 0,03; 0,02;
0,01;0,009; 0,008; dan 0,007 mg/mL secara duplo dan bergantian pada
KCKTdengan:
Fase diam : kolom L1 (oktadesil silana) 3,9 mm x
30 cm Fase gerak :aquades - metanol (3:1)
Laju alir : 1,5 ml/menit
 Halaman 8 dari 18
ANUGRAH PHARM
PROTOKOL VALIDASI METODE ANALISIS
PENETAPAN KADAR INJEKSI SEFOTAKSIM
Temperatur : Temperatur kolom dijaga pada 40ºC
Detektor : UV
Panjang gelombang : 243 nm
b) Dari data yang diperoleh, dilakukan perhitungan untuk mendapatkan
persamaan garis regresi, koefisien regresi (r), serta limit deteksi (LOD) dan
limit kuantitasi(LOQ).
3) Perhitungan
a) i. Persamaan regresi linear: y = a
+ bx dengan:
x = konsentrasi
y = luas puncak
a = perpotongan garis lurus dengan sumbu y
b = kemiringan garis
r = koefisien korelasi

ii. Kriteria penerimaan: koefisien korelasi (r) ≥ 0,999

b) Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi (LOD dan LOQ)
i. Perhitungan:
3) Digunakan data linearitas (konsentrasi (x) dan luas puncak (y)) dan
persamaan regresi linear yang diperoleh dari lima larutan standar pada
uji linearitas.
4) Dihitung batas deteksi dan kuantitasi dengan rumus :
k x Sy / x
Q= b
dengan : Q = LOD (batas deteksi) atau LOQ (batas
kuantitasi) k = 3 untuk LOD atau 10 untuk
LOQ
Sy/x = standar deviasi fungsi

[ Z (x– )2 ]
= √ n–
2

b = slope pada persamaan regresi linier y = a + bx

Halaman 9 dari 18
ANUGRAH PHARM
PROTOKOL VALIDASI METODE ANALISIS
PENETAPAN KADAR INJEKSI SEFOTAKSIM
e. Uji Selektivitas
1) Pengukuran Selektivitas
a ) Disuntikkan larutan sampel dan larutan plasebo sefotaksim sebanyak 10,0
μl secara bergantian pada KCKT dengan :
Fase diam : kolom L1 (oktadesil silana) 3,9 mm x 30 cm
Fase gerak : aquades - metanol (3:1)
Laju alir : 1,5 ml/menit
Temperatur : Temperatur kolom dijaga pada 40ºC
Detektor : UV
Panjang gelombang : 243 nm

b) Amati puncak pada kromatogram.

2) Syarat
Hasil kromatogram larutan sampel dan larutan plasebo sefotaksim selektivitas
tidak boleh mengandung gangguan di sekitar waktu retensi zat aktif Hasil
kromatogram yang diperoleh sebagai berikut
f. Uji Stres
1) Pengukuran Stres
a) Siapkan larutan standar sefotaksim dan larutan sampel.
b) Ambil masing-masing 5,0 mL larutan standar sefotaksim dan
larutan sampel kemudian masing-masing larutan tersebut simpan di
oven pada suhu 60ºCselama 24 jam.
Ambil masing-masing 5,0 mL larutan standar sefotaksim dan larutan
Sampel tambahkan 5,0 mL HCl 0,1N larutan tersebut disimpan selama 24
jam.
 Halaman 10 dari 18
ANUGRAH PHARM PROTOKOL VALIDASI METODE ANALISIS
PENETAPAN KADAR INJEKSI SEFOTAKSIM
c) Ambil masing-masing 5,0 mL larutan standar sefotaksim dan larutan
sampel tambahkan 5,0 mL NaOH 0,1N larutan tersebut disimpan selama
24 jam.
d) Ambil masing-masing 5,0 mL larutan standar sefotaksim dan larutan
sampel tambahkan 5,0 mL H2O2 3% larutan tersebut disimpan selama
24 jam.
e) Kemudian masing-masing larutan standar sefotaksim dan larutan sampel
disuntikkan sebanyak 10,0 μl secara bergantian pada KCKT pada
kondisi analisis terpilih.
f) Setelah itu, hasil kromatogram dari masing-masing larutan standar
sefotaksim dan larutan sampel dibandingkan sebelum penyimpanan
selama 24 jam dengan sesudah penyimpanan selama 24 jam baik dari
pengaruh lingkungan asam, basa maupun oksidasi.
2) Kondisi KCKT
1. Disuntikkan larutan standar sefotaksim dan larutan sampel
sebanyak 10,0μl secara bergantian pada KCKT dengan:
Fase diam : kolom L1 (oktadesil silana) 3,9 mm x 30 cm
Fase gerak : aquades - metanol (3:1)
Laju alir : 1,5 ml/menit
Temperatur : Temperatur kolom dijaga pada 40ºC
Detektor : UV
Panjang gelombang : 243 nm

2. Amati puncak pada kromatogram.

3) Syarat
Dari hasil kromatogram dilihat waktu retensinya. Jika terdapat puncak baru
yang muncul namun dengan waktu retensi berbeda, kemungkinan hasil itu
menunjukkan hasil degradasi dari analit, maka dapat disimpulkan bahwa
metode yang digunakan selektif terhadap hasil degradasi analit.
a) Hasil kromatogram yang diperoleh sebagai berikut :
ANUGRAH Halaman 11 dari 18
PHARM
PROTOKOL VALIDASI METODE ANALISIS
PENETAPAN KADAR INJEKSI SEFOTAKSIM

g. Uji Akurasi
1) Pembuatan Larutan
a) Larutan Uji
Ditimbang dan diserbukkan tidak kurang dari 20 tablet. Kemudian ditimbang
seksama setara sejumlah 100,0 mg serbuk simulasi lalu dimasukkan kedalam
labu ukur 200,0 mL, lalu ditambahkan 100,0 mL fase gerak campuran aquades-
metanol (3:1), disonicate selama 5 menit kemudian volumenya dicukupkan
dengan fase gerak hingga garis batas, hingga dihasilkan larutan dengan
konsentrasi 0,5 mg/mL. (U.S. Pharmacopeia 30, 2007).
b) Larutan Sampel
– Larutan sampel 80%
Pipet 5,0 mL dari larutan uji, dimasukkan ke dalam labu ukur 250 mL dan
ditambahkan pelarut sampai garis batas hingga dihasilkan larutan dengan
konsentrasi 0,4 mg/mL, berdasarkan yang tertera pada etiket. Kemudian
saring larutan dengan menggunakan vakum dan membran filter 0,5 µm dan
ambil bagian supernatan yang bersih (U.S. Pharmacopeia 30, 2007).
– Larutan sampel 100%
Pipet 5,0 mL dari larutan uji, dimasukkan ke dalam labu ukur 250 mL dan
ditambahkan pelarut sampai garis batas hingga dihasilkan larutan dengan
konsentrasi 0,5 mg/mL, berdasarkan yang tertera pada etiket. Kemudian
saring larutan dengan menggunakan vakum dan membran filter 0,45 µm dan
ambil bagian supernatan yang bersih (U.S. Pharmacopeia 30, 2007).
– Larutan sampel 120% Pipet 5,0 mL dari larutan uji, dimasukkan ke dalam
labu ukur
250 mL dan ditambahkan pelarut sampai garis batas hingga dihasilkan
larutan dengan konsentrasi 0,6 mg/mL, berdasarkan yang tertera pada etiket.
Kemudian saring larutan dengan menggunakan vakum dan membran filter
0,45 µm dan ambil bagian supernatan yang bersih (U.S. Pharmacopeia 30,
2007).
 Halaman 12 dari 18
ANUGRAH
PROTOKOL VALIDASI METODE ANALISIS
PHARM
PENETAPAN KADAR INJEKSI SEFOTAKSIM

2) Pengukuran Akurasi
a) Disuntikkan larutan standar dan masing-masing larutan sampel sebanyak
10,0 µl secara bergantian pada KCKT dengan:
Fase diam : kolom L1 (oktadesil silana) 3,9 mm x
30 cm Fase gerak : aquades - metanol (3:1)
Laju alir : 1,5 ml/menit
Temperatur : Temperatur kolom dijaga pada 40ºC
No Konsentrasi Area Terdeteksi Persyaratan
DetektorHasil
: UV Rata-rata Persen % Perolehan
Panjang gelombang : 243 nm
Pengamatan Kembali
1 b) Akurasi dihitung berdasarkan nilai perolehan
80% 110 kembali
98-102%untuk tiap pengukuran
3) Syarat 111,26
Perolehan kembali (recovery) atau akurasinya berada pada rentang 98%-102%.
2 4)100%
Hasil yang diperoleh sebagai berikut 110
111,26

3 120% 110
ANUGRAH Halaman 13 dari 18
PHARM
PROTOKOL VALIDASI METODE ANALISIS
PENETAPAN KADAR INJEKSI SEFOTAKSIM

h. Presisi
1) Pengukuran Presisi
a) Keterulangan (repeatability)
1. Siapkan larutan standar sefotaksim, larutan sampel dan larutan plasebo.
2. Pengukuran presisi dilakukan dengan cara disuntikkan 10,0 µl larutan
standar, larutan sampel dan larutan plasebo secara bergantian pada
KCKT dengan: Fase diam : kolom L1 (oktadesil silana) 3,9 mm x 30
cm
Fase gerak : aquades - metanol
(3:1) Laju alir : 1,5 ml/menit
Temperatur : Temperatur kolom dijaga pada
40ºC Detektor : UV
Panjang gelombang : 243 nm
3. Lakukan duplo untuk tiap pengujian
4. Kriteria penerimaan : RSD ≤ 2
%. Hasil yang diperoleh sebagai
berikut :
No. Konsentrasi Area Terdeteksi Persyaratan
(%) Sampe Sampe SD RSD
l l
1 2
1 3,713 0,0367
2 3,897 0,0472
3 3,602 0,0223
4 3,713 0,0354
5 3,897 0,0367
6 3,602 0,0367 RSD ≤ 2,0 %
7 3,713 0,0472
8 3,897 0,0223
9 3,602 0,0354
10
Kesimpulan :
 Halaman 14 dari 18
ANUGRAH
No. Lar SampelPHARM PROTOKOL VALIDASI
Area Terdeteksi METODE ANALISIS
Persyaratan
Analis 1 Analis 2 Rata-Rata
PENETAPANRSD
KADAR INJEKSI SEFOTAKSIM
1
2 2) Presisi Antara:
3
4 a) Lakukan pengujian diatas oleh 2 analisa yang berbeda dan/ atau
5
menggunakan alat yang berbeda.
6 RSD ≤ 2,0 %
7 b) RSD maksimal dari 2 pengujian ≤
8
9 2 %. Hasil yang diperoleh sebagai berikut :
10
Kesimpulan :

i. Linearitas dan Rentang

1) Larutan Sampel
Ditimbang dan diserbukkan tidak kurang dari 20 tablet. Kemudian
ditimbang seksama setara sejumlah 100,0 mg serbuk sampel lalu dimasukkan
kedalam labu ukur 200,0 mL, lalu ditambahkan 100,0 mL fase gerak
campuran air-metanol (3:1), disonicate selama 5 menit kemudian volumenya
dicukupkan dengan fase gerak hingga garis batas. Kemudian larutan tersebut
dipipet 5,0 mL, dimasukkan ke dalam labu ukur 250 mL dan ditambahkan
pelarut sampai garis batas hingga dihasilkan larutan dengan konsentrasi 0,01
mg per mL, berdasarkan yang tertera pada etiket. Kemudian saring larutan
dengan menggunakan vakum dan membran filter 0,5 µm dan ambil bagian
supernatan yang bersih (U.S. Pharmacopeia 30, 2007).
 Halaman 15 dari 18
ANUGRAH
PROTOKOL VALIDASI METODE ANALISIS
PHARM
PENETAPAN KADAR INJEKSI SEFOTAKSIM

2) Buat larutan sampel untuk pengujian Linearitas:

a) Larutan sampel konsentrasi 0,007 mg/ml
Dipipet 0,7 ml larutan sampel ke dalam labu ukur 10 ml dan ditambahkan
dengan fase gerak hingga garis batas (70% konsentrasi target).
b) Larutan sampel konsentrasi 0,008 mg/ml
Dipipet 0,8 ml larutan sampel ke dalam labu ukur 10 ml dan ditambahkan
dengan fase gerak hingga garis batas (80% konsentrasi target).
c) Larutan sampel konsentrasi 0,009 mg/ml
Dipipet 0,9 ml larutan sampel ke dalam labu ukur 10 ml dan ditambahkan
dengan fase gerak hingga garis batas (90% konsentrasi target).
d) Larutan sampel konsentrasi 0,01 mg/ml
Dipipet 1,0 ml larutan sampel ke dalam labu ukur 10 ml dan
ditambahkan dengan fase gerak hingga garis batas (100% konsentrasi
target).
e) Larutan sampel konsentrasi 0,011 mg/ml
Dipipet 1,1 ml larutan sampel ke dalam labu ukur 10 ml dan ditambahkan
dengan fase gerak hingga garis batas (110% konsentrasi target).
f) Larutan sampel konsentrasi 0,012 mg/ml
Dipipet 1,2 ml larutan sampel ke dalam labu ukur 10 ml dan ditambahkan
dengan fase gerak hingga garis batas (120% konsentrasi target).
g) Larutan sampel konsentrasi 0,013 mg/ml
Dipipet 1,3 ml larutan sampel ke dalam labu ukur 10 ml dan ditambahkan
dengan fase gerak hingga garis batas (130% konsentrasi target).
3) Semua larutan disaring dengan membran filter 0,5 µm.
4) Pengukuran Linearitas dan Rentang Sefotaksim
a) Disuntikkan 10,0 µl larutan sampel dengan konsentrasi 0,007; 0,008;
0,009; 0,01; 0,011; 0,012; dan 0,013 mg/mL secara duplo dan bergantian
pada KCKT dengan: Fase diam : kolom L1 (oktadesil silana) 3,9 mm x 30
cm
 Halaman 16 dari 18
ANUGRAH
PROTOKOL VALIDASI METODE ANALISIS
PHARM
PENETAPAN KADAR INJEKSI SEFOTAKSIM

Fase gerak : aquades - metanol

(3:1) Laju alir : 1,5 ml/menit
Temperatur : Temperatur kolom dijaga pada
40ºC Detektor : UV
Panjang gelombang : 243 nm
b)Dihitung koefisien korelasi, kemiringan garis dan perpotongan
garis lurus dengan sumbu y sebagai analisis regresi linearnya serta
dicatat hasilnya
5) Perhitungan
a) Persamaan regresi linear: y = a
+ bx dengan: x = konsentrasi
y = luas puncak
a = perpotongan garis lurus dengan
sumbu y b = kemiringan garis
r = koefisien korelasi
b) Kriteria penerimaan: koefisien korelasi (r) ≥
0,9990 Hasil yang diperoleh sebagai berikut :

j. Uji Kekuatan (Robustness)

1) Prosedur Sefotaksim
a) Divariasikan kondisi analisis fase gerak pada metode
kromatografi cair kinerja tinggi, yaitu:
a. Komposisi fase gerak diubah menjadi aquades - metanol (2:1)
b. Laju alir diubah menjadi 1,4 ml/menit
c. Suhu kolom diubah menjadi 38ºC
 Halaman 17 dari 18
ANUGRAH
PROTOKOL VALIDASI METODE ANALISIS
PHARM
PENETAPAN KADAR INJEKSI SEFOTAKSIM

2) Disuntikkan 10,0µl larutan standar dan larutan sampel dari lima replikasi
secara bergantian pada KCKT dengan fase diam, panjang gelombang dan
detektor yang sama.
No. 3) Dihitung standar deviasi
Keterangan relatif
Validasi dan diamati
kondisi Hasilfaktor ikutannya.
Pengamatan
1 Fase 4) Perhitungan
gerak ( air : metanol) 2:1
2 Laju alira.fase gerakdeviasi relatif
Standar 1,4
(mL/menit)
RSD = SD X 100%
3 Suhu kolom oC 38
5) :Syarat
Kriteria penerimaan RSD ≤ 2,0 %
a)TStandar
≤ 2,0 deviasi relatif tidak lebih dari 2,0 %.
b) Tailing factor (T) kurang dari atau sama dengan 2
 Halaman 18 dari 18
ANUGRAH
PROTOKOL VALIDASI METODE ANALISIS
PHARM
PENETAPAN KADAR INJEKSI SEFOTAKSIM

a. Kesimpulan
No. Parameter Hasil Persyaratan Kesimpulan
1 Uji kesesuaian Faktor kapasitas (k’) ≥
sistem 2 Faktor ikutan (T) ≤ 2
Jumlah lempeng teoritis
N ≥ 5000
Resolusi ≥ 2,0
2 Akurasi Perolehan kembali 98-
102%
3 Presisi RSD ≤ 2,0 %
4 Linieritas dan Kriteria Penerimaan= r ≤
Rentang 0,999
Disusun oleh: 5 Diperiksa oleh:
Kekuatan Disetujui
RSD ≤oleh:
2,0%
(Robustness) Faktor ikutan T ≤ 2

Metode analisa penetapan kadar tablet sefotaksim dianggap valid apabila seluruh
parameter pengujian pada metode analisa telah dilaksanakan dan hasilnya
memenuhi spesifikasi meliputi spesifitas, akurasi, persisi antara, linieritas dan
rentang yang telah ditetapkan. Hasil pengujian yang melampaui persyaratan yang
Tanggal: Tanggal
telah ditetapkan, perlu dilakukan kaji Tanggal:
ulang dan diperbaiki untuk direvalidasi
sebelum prosedur tetap validasi penetapan kadar tablet parasetamol tersebut
dinyatakan layak untuk digunakan.
 DAFTAR PUSTAKA

BPOM, 2018. Pedoman Cara Pembuatan Obat yang Baik (CPOB). Jakarta: Badan Pengawas
Obat dan Makanan.