LEMBAR KERJA 5

Topik : Uji Sterilitas (Interpretasi dan Analisis Hasil)

Nama : Felix Martinus Setyono

NRP : 110119028
KELAS :A

Uji Sterilitas Menurut Farmakope Indonesia VI dan USP

1. Sebutkan jenis media yang direkomendasikan untuk uji sterilitas sesuai dengan
Farmakope Indonesia VI dan USP dan peruntukannya!
• Media Cair Tioglikolat terutama digunakan untuk pertumbuhan bakteri anaerob,
termasuk juga untuk mendeteksi bakteri aerob. Untuk mengkondisikan media dalam
keadaan anaerob ditambahkan antioksidan
• Media “Soybean-Casein Digest Medium” digunakan untuk pertumbuhan kapang dan
bakteri aerob.
(FI VI hal 1832)

2. Berdasarkan jenis media yang diuraikan pada nomor 1, sebutkan komponen

penyusun media, jumlah, dan fungsinya (susun dalam bentuk tabel)!
• Media cair Tioglikolat
KOMPONEN JUMLAH FUNGSI
L-Sistin P 0,5 g Antioksidan
Natrium klorida P 2,5 g Bahan pengisotonis → supaya
media tidak hipotonis
Dekstrosa monohidrat/anhidrat P 5,5 atau 5,0 g Nutrien
Agar P 0,75 g Nutrien atau pembentuk media
Yeast extract (larut dalam air) 5,0 g Nutrien
Pancreatic digest of casein 15,0 g Nutrien
Natrium tioglikolat P atau 0,5 g Antioksidan
Asam tioglikolat P 0,3 mL Antioksidan
Larutan natrium resazurin P (1 1,0 mL Indikator bebas
dalam 1000) dibuat segar
Air murni 1000 mL Pelarut
pH setelah sterilisasi 7,1 ± 0,2
• Media “Soybean-Casein Digest Medium”
KOMPONEN JUMLAH FUNGSI
Pancreatic digest of casein 17,0 g Nutrien
Papaic digest of soybean meal 3,0 g Nutrien (spesifik khusus jamur)
Natrium klorida P 5,0 g Bahan pengisotonis
Kalium fosfat dibasa P 2,5 g Dapar
Dekstrosa monohidrat/anhidrat P 2,5 atau 2,3 g Nutrien
Air murni 1000 mL Pelarut
 pH setelah sterilisasi 7,3 ± 0,2
(FI VI hal 1833)

3. Bagaimanakah proses penyiapan media untuk melakukan uji sterilitas dengan

metode inokulasi langsung bagi produk penisilin dan sefalosporin?
• Masukkan secara aseptik pada setiap wadah media sejumlah β-laktamase untuk
menginaktifkan sejumlah antibiotik dalam zat uji.
• Tetapkan jumlah β-laktamase yang diperlukan untuk menginaktifkan antibiotik
menggunakan sediaan β-laktamase yang sebelumnya sudah diuji inaktivasi daya
hambat dari penisilin atau sefalosporin. (Catatan: Media yang telah mengandung β-
laktamase dapat juga digunakan untuk pengujian dengan metode penyaringan
membran).
• Sebagai alternatif (lakukan uji di daerah yang benar-benar terpisah dari tempat uji
sterilitas), tetapkan jumlah β-laktamase yang diperlukan di dalam media seperti tertera
pada Uji kesesuaian metode menggunakan Staphylococcus aureus kurang dari 100
koloni (lihat Tabel I = soal no 4) sebagai bakteri tantang.
• Amati pertumbuhan mikroba yang khas sebagai konfirmasi bahwa kadar β-laktamase
sudah tepat.
(FI VI hal 1833)
Untuk menghindari negatif palsu, sebenarnya ada bakteri tapi sudah dihancurkan oleh
antibiotiknya sehingga hasil negatif padahal harusnya positif

4. Uraikanlah galur mikroba uji yang sesuai untuk uji fertilitas masing-masing media!
Bakteri aerob
Staphylococcus aureus ATCC 6538; CIP 4.83; NCTC 10788;
NCIMB 9518; NBRC 13276
Bacillus subtilis ATCC 6633; CIP 52.62; NCIMB 8054;
NBRC 3134
1
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027; NCIMB 8626; IP 82.118;
NBRC 13275
Bakteri anaerob
Clostridium sporogenes2 ATCC 19404; CIP 79.3; NCTC 532 atau
ATCC 11437; NBRC 14293
Kapang
Candida albicans ATCC 10231; IP 48.72; NCPF 3179;
NBRC 1594
Aspergillus brasiliensis (Aspergillus ATCC 16404; IP 1431.83 MI 149007;
niger) NBRC 9455
1. Alternatif untuk Pseudomonas aeruginosa adalah Kocuria rhizophila (Micrococcus
luteus) ATCC 9341.
2. Alternatif untuk Clostridium sporogenes, jika diinginkan mikroba yang bukan
pembentuk spora adalah Bacteroides vulgatus ATCC 8482.
 Prosedur uji fertilitas:
• Inokulasikan sejumlah Media Cair Tioglikolat dengan sejumlah mikroba berikut
(tidak lebih dari 100 koloni), menggunakan sejumlah media terpisah untuk setiap
spesies mikroba: Clostridium sporogenes, Pseudomonas aeruginosa, dan
Staphylococcus aureus.
• Inokulasikan sejumlah Media Tioglikolat Alternatif dengan sejumlah Clostridium
sporogenes (tidak lebih dari 100 koloni). Inokulasikan sejumlah "Soybean Casein
Digest Medium" dengan sejumlah mikroba berikut (tidak lebih dari 100 koloni)
menggunakan sejumlah media terpisah untuk setiap spesies mikroba: Aspergillus
brasiliensis, Bacillus subtilis dan Candida albicans. Inkubasi tidak lebih dari 3 hari
untuk bakteri dan tidak lebih dari 5 hari untuk kapang. Teknik pemeliharaan lot benih
kultur (sistem lot benih) untuk mikroba viabel yang diinokulasikan tidak lebih dari 5
pasase yang diturunkan dari lot benih master ash. Media dapat digunakan jika terlihat
pertumbuhan mikroba dengan jelas.
(FI VI hal 1833-1834)

5. Bagaimanakah prosedur pengamatan dan interpretasi hasil uji sterilitas menurut

Farmakope Indonesia VI dan USP 40!
• FI VI hal 1838-1839
Pengamatan dan Penafsiran Hasil Uji
- Pada interval waktu tertentu dan akhir periode inkubasi, amati secara visual
adanya pertumbuhan mikroba dalam media.
- Jika bahan uji menimbulkan kekeruhan pada media sehingga tidak dapat
ditetapkan secara visual ada atau tidaknya pertumbuhan mikroba, 14 hari sejak
mulai inkubasi, pindahkan sejumlah media (tiap tabung tidak kurang dari 1 ml)
ke dalam media segar yang sama, kemudian inkubasi bersama-sama tabung awal
selama tidak kurang dari 4 hari.
- Jika tidak terjadi pertumbuhan mikroba, maka bahan uji memenuhi syarat
sterilitas. Jika terbukti terjadi pertumbuhan mikroba, maka bahan uji tidak
memenuhi syarat sterilitas, kecuali dapat ditunjukkan bahwa uji tidak absah
disebabkan oleh hal yang tidak berhubungan dengan bahan uji. Uji dikatakan
tidak absah jika satu atau lebih kondisi dibawah ini dipenuhi:
1. Data pemantauan mikrobiologi terhadap fasilitas uji sterilitas menunjukkan
ketidaksesuaian.
2. Pengkajian prosedur uji yang digunakan selama pengujian menunjukkan
ketidaksesuaian.
3. Pertumbuhan mikroba ditemukan pada kontrol negatif.
4. Setelah dilakukan identifikasi mikroba yang diisólasi dari hasil uji,
pertumbuhan mikroba (beberapa mikroba) dapat dianggap berasal dan
kesalahan pada bahan uji, atau teknik pengujian yang digunakan pada prosedur
uji sterilitas.
- Jika pengujian dinyatakan tidak absah, lakukan uji ulang dengan jumlah bahan
yang sama dengan uji awal. Jika tidak terbukti terjadi pertumbuhan mikroba pada
 uji ulang, maka contoh memenuhi syarat uji sterilitas. Jika ditemukan
pertumbuhan mikroba pada uji ulang, maka contoh tidak memenuhi syarat uji
sterilitas.

The Test for Sterility of Medicinal Products

1. Berdasarkan artikel tersebut, uraikanlah keterbatasan pelaksanaan uji

sterilitas!
Tidak hanya ada batasan dengan hasil uji sterilitas, tetapi juga ada batasan dalam
melakukan uji itu sendiri. Risiko mendapatkan hasil positif palsu selama pengujian
harus dikelola seketat mengelola pemrosesan aseptik pada sebuah batch.
Ada sejumlah area risiko potensial yang dapat menyebabkan hasil positif palsu:
• Zona uji sterilitas yang dikompromikan oleh teknisi, mungkin karena tindakan
berulang dan ergonomis yang buruk.
• Pembentukan lingkungan aseptik yang buruk sebelum melakukan pengujian,
biasanya karena kurangnya proses kontaminasi biologis.
• Lebih mengandalkan pada teknologi penghalang untuk menyingkirkan
kontaminasi mikroba dapat berarti bahwa teknik aseptik yang baik tidak
dilakukan.
• Intervensi pemantauan lingkungan dapat membahayakan zona pengujian aseptik
jika bukan bagian dari desain sistem.

2. Apakah keunggulan metode filtrasi membrane dalam uji sterilitas suatu produk
dibandingkan metode inokulasi langsung?
• Semua produk volume kecil dapat difiltrasi atau setidaknya separuh isi produk
volume besar dapat difiltrasi melalui fiter membrane, sehingga volume sampel
yang diuji jauh lebih besar dibanding metode inokulasi langsung.
• Sesuai untuk semua produk berair, beralkohol, berminyak, dan pelarut yang dapat
melewati filter steril 0,45 μm.
• Setiap mikroorganisme yang ada dapat dipisahkan dari zat yang berpotensi
menghambat dalam produk melalui filtrasi atau dapat dihilangkan dengan
membilas membran.
• Bisa untuk sediaan yang mengandung antibiotik

3. Apakah alasan EP dan USP memperpanjang lama inkubasi dari 7 hari menjadi
14 hari? Jelaskan!
 Hal ini karena diperkirakan bahwa 30% dari kegagalan uji sterilitas terjadi antara 7
dan 14 hari karena waktu yang dibutuhkan untuk mikroorganisme mati secara halus
atau stres untuk tumbuh. Mikroorganisme yang diisolasi dari uji sterilitas lebih
cenderung mengalami stres karena perpindahan dari lingkungannya ke lingkungan
yang lebih tidak bersahabat (produk) dan kemudian ke lingkungan kaya nutrisi yang
sama sekali berbeda (media kultur). Mikroorganisme ini juga cenderung jumlahnya
sedikit (hanya satu sel). Faktor-faktor ini berkontribusi pada fase lag yang relatif lama
pada awal siklus pertumbuhan sel mikroba dalam media kultur.

4. Bagaimanakah strategi yang dilakukan apabila suatu produk membentuk

suspensi/kekeruhan/flokulasi pada media saat dilakukan uji sterilitas dengan
metode inokulasi langsung?
Untuk produk yang berbentuk suspense dan menghasilkan flokulasi dan kekeruhan
atau endapan sehingga ada atau tidaknya pertumbuhan mikroba tidak dapat langsung
terlihat, diperlukan langkah subkultur. Untuk subkultur, sebagian media kultur yang
sesuai dipindahkan ke wadah dari jenis media yang sama dan diinkubasi untuk jangka
waktu selanjutnya. Item yang diinkubasi harus diberi label yang jelas dengan identitas
produk; media yang digunakan; suhu inkubasi dan tanggal pengujian. Selama inkubasi
uji sterilitas, artikel harus diperiksa secara teratur untuk pertumbuhan (ini sering setiap
hari atau dua hari sekali). Saat memeriksa item pada tes perawatan harus dilakukan
untuk mencegah agitasi yang tidak semestinya, terutama dari media tioglikolat. Jika
kondisi anaerob tidak dipertahankan, ini akan ditunjukkan oleh indikator resazurin.
Pada akhir masa inkubasi, artikel harus diperiksa, dengan memutar perlahan, untuk
mengetahui kekeruhan yang terlihat terhadap sumber cahaya buatan.

5. Mengapa proses monitoring lingkungan menjadi hal yang krusial dilakukan

dalam pelaksanaan uji sterilitas?
Proses monitoring lingkungan menjadi hal yang krusial dilakukan dalam pelaksanaan
uji sterilitas dimana uji sterilitas harus dilakukan di lingkungan yang tidak
menimbulkan kontaminasi dan mengarah pada potensi yang menyebabkan terjadinya
positif palsu. Lingkungan yang sesuai yaitu perangkat aliran udara searah yang
terdapat di dalam cleanroom atau isolator. Pemantauan lingkungan harus dilakukan
selama setiap sesi pengujian untuk menunjukkan lingkungannya berada dalam kondisi
tekendali.

6. Apakah tujuan melakukan validasi uji sterilitas?

Setiap jenis produk harus divalidasi untuk menunjukkan bahwa produk dengan media
kultur tidak memiliki aktivitas antimikroba (sebagai bakterostasis dan fungistasis).
Validasi juga dilakukan jika ada perubahan substansial pada produk yang telah
divalidasi sebelumnya atau pada media kultur.

7. Parameter apakah yang harus diinvestigasi bila terjadi kegagalan pada uji
sterilitas? Uraikanlah!
 • Spesifikasi organisme
• Rekam jejak hasil dan penyimpangan laboratorium
• Pemantauan lingkungan produksi
• Pemantauan personel
• Bioburden pra-sterilisasi produk
• Review catatan produksi
• Riwayat manufaktur

8. Apakah yang dimaksud dengan Rapid Microbiological Methods? Sebutkan tiga

prinsip dasar pengujian dengan Rapid Microbiological Methods!
Rapid Microbiological Methods adalah metode yang dapat mendeteksi mikroorganisme
dengan masa inkubasi yang lebih cepat daripada prosedur yang tertera pada Farmakope
yang membutuhkan waktu inkubasi lebih lama. 3 prinsip dari Rapid Microbiological
Methods adalah:
1. Berbasis pertumbuhan atau metabolik
2. Berbasis viabilitas
3. Berbasis teknologi yang menganalisis komponen sel seperti asam nukleat.

9. Bagaimanakah prinsip kerja metode berikut ini dalam uji sterilitas:

a. ATP-bioluminescence
Merupakan metode cepat yang paling baik dengan menggunakan enzim untuk
memecah ATP mikroba dari sel yang sedang tumbuh dan menghasilkan cahaya
tampak yang dapat diukur dengan detektor ATP bioluminescence. Metode ini
dianggap sensitif dan mampu memberikan hasil seperti prosedur monograf dalam
waktu kurang dari 7 hari Sistem Deteksi Cepat Celsis dan Sistem Deteksi dan
Pencacahan Mikrobiologi Cepat Milliflex. Namun metode ini dapat merusak
produk dan basis pertumbuhan (dengan media dan kondisi inkubasi tertentu,
meskipun waktu pertumbuhan berkurang secara signifikan).
b. Colorimetric growth detection
Metode ini didasarkan pada sistem deteksi warna sensitif yang dapat mendeteksi
karbondioksida yang dihasilkan oleh sel mikroba yang sedang tumbuh. Metode
ini dapat didaptkan hasilnya dalam 3 hari BacT / ALERT 3D Dual-T Sistem
Deteksi Microbila dari bioMerieux adalah contoh komersial. Metode ini juga
merusak produk dan basis pertumbuhan.
c. Autofluorescence detection
Metode ini belum dapat dikomersialkan untuk tujuan pengujian sterilitas
didasarkan pada kenyataan bahwa semua sel hidup menghasilkan sejumlah kecil
fluoresensi yang dapat diperkuat dari sel tumbuh yang ditempatkan pada
permukaan padat (seperti agar) dan dibuat dapat dideteksi dengan mata telanjang.
Dinyatakan bahwa hasil dapat diperoleh dalam waktu kurang dari 3 hari. Metode
ini juga dapat merusak produk dan basis pertumbuhan.
d. Cytometry systems
Perhitungan sitometri tidak bergantung pada pertumbuhan tetapi menggunakan
teknik pelabelan sel fluoresen. Biasanya, sel mikroba diberi label menggunakan
 pewarna fluoresen atau substrat non-fluoresen yang kemudian diubah menjadi sel
yang layak fluorescent. Deteksi dicapai dengan pemindaian laser baik dalam sel
aliran o pada fase padat seperti filter membran. Scan RDI adalah contoh komersial
yang dapat mendeteksi 1 CFU. Metode ini, meskipun destruktif tetapi tidak
merusak basis pertumbuhan dan cepat, memang tampaknya mengatasi dua
kelemahan utama dari metode monograf (yaitu spektrum / kekuatan deteksi dan
penundaan).

Performance Survey and Comparison Between Rapid Sterility Testing Method and
Pharmacopoeia Sterility Test

1. Apakah alasan pengembangan Rapid Sterility Testing Method?

• Deteksi mikroorganisme lebih cepat
• Periode inkubasi berkurang
• Biaya lebih rendah

2. Bagaimanakah prinsip deteksi mikroorganisme dengan BacT/Alert® 3D system?

Deteksi mikroba didasarkan pada deteksi kolorimetri CO2 yang dihasilkan dari
pertumbuhan mikroba dalam media kultur cair.

3. Parameter validasi apakah yang harus dievaluasi pada validasi pengujian

mikrobiologi secara kualitatif seperti uiji sterilitas? Uraikan!
• Spesifitas
Spesifitas dari metode alternatif didasarkan pada kemampuan untuk mendeteksi
berbagai mikroorganisme yang berpotensi ada dalam produk.
• Batas deteksi
Batas deteksi mengacu pada jumlah terkecil mikroorganisme yang dapat dideteksi
di bawah kondisi eksperimental yang telah ditetapkan.

4. Uraikanlah mikroorganisme apakah yang digunakan pada uji fertilitas untuk

masing-masing media sesuai artikel tersebut!
1. BacT / Alert® SA, BacT / Alert® FA, BacT / Alert® iAST, BacT / Alert® iLym,
dan media konvensional SCDM dievaluasi menggunakan strain:
• S. aureus
• P. aeruginosa
• B. subtilis
 • A. brasiliensis
• C. albicans.
2. BacT / Alert® SA, BacT / Alert® FA, BacT / Alert® iAST, BacT / Alert® iLym,
dan media konvensional FTM dievaluasi menggunakan strain:
• S. aureus
• P. aeruginosa
• B. subtilis.
3. BacT / Alert® SN, BacT / Alert® FN, BacT / Alert® iNST, dan media konvensional
FTM dievaluasi menggunakan strain:
• S. aureus
• P. aeruginosa
• B. subtilis
• A. brasiliensis
• C. sporogenes.
5. Bagaimanakah prosedur uji sterilitas menurut Farmakope yang dilakukan pada
penelitian tersebut?
• Sistem 3D BacT / Alert® dievaluasi dengan membandingkannya dengan metode
pengujian sterilitas filtrasi membran farmakope, mengenai deteksi mikroorganisme
yang digunakan untuk sengaja mencemari larutan natrium klorida 0,9% komersial
dan larutan metronidasol komersial, keduanya dalam kantong 100 mL.
• Unit dari setiap produk (P1 dan P2) terkontaminasi secara artifisial dengan suspensi
yang mengandung 2 CFU / 5 mL, dan jumlah unit yang sama juga terkontaminasi
dengan suspensi yang mengandung 0,25 CFU / 5 mL dari setiap strain
mikroorganisme yang digunakan untuk mengevaluasi media kultur BacT / Alert®.
• Setiap sampel disaring ke selulosa nitrat filter yang memiliki ukuran pori nominal
tidak lebih dari 0,45 μm dan diameter kira-kira 50 mm, dalam kondisi aseptik.
• Setelah penyaringan sampel, membran itu dicuci tiga kali dengan menyaring 100 mL
Cairan A melalui membran. Kemudian, membran dipotong secara aseptik menjadi
dua bagian yang sama, dan satu setengah dipindahkan ke media kultur konvensional
(FTM dan SCDM) yang diinkubasi di bawah kondisi yang direkomendasikan untuk
uji sterilitas: FTM pada 32,5 ± 2,5 ° C dan SCDM pada 22,5 ± 2,5 ° C, selama 14
hari.
• Kedua jenis media kultur dievaluasi setiap hari untuk mendeteksi adanya
pertumbuhan mikroba.
• Setelah inkubasi 18 jam, 10 mL aliquot dari SCDM tersebut ditransfer ke botol BacT
/ Alert® SA dan 10 mL aliquot dari FTM dipindahkan ke sebotol BacT / Alert® SN;
Media BacT / Alert® diinkubasi hanya pada suhu 32,5 ± 2,5 ° C 14 hari, dan
pembacaan otomatis dilakukan setiap 10 menit.
• Prosedur yang sama dilakukan untuk pasangan lain Media BacT / Alert®: setelah
inkubasi 18 jam, aliquot 10 mL dari SCDM dipindahkan ke sebotol BacT / Alert®
FA dan 10-mL alikuot dari FTM dipindahkan ke botol BacT / Alert® FN; dan 10-
mL alikuot dari SCDM dipindahkan ke botol BacT / Alert® iAST dan 10-mL alikuot
dari FTM dipindahkan ke sebotol BacT / Alert® iNST. Semua media BacT / Alert®
diinkubasi hanya pada suhu 32,5 ± 2,5 ° C selama 14 hari, dan pembacaan otomatis
dilakukan setiap 10 menit.
• Kontrol negatif yang terdiri dari penyaringan masing-masing matriks yang tidak
sengaja terkontaminasi disertakan dalam semua pengujian. Kontrol negatif kultur
media juga digunakan untuk memastikan sterilitas reagen ini. Kontrol positif dari
 inokulum digunakan untuk memastikannya viabilitas dan kemampuan untuk tumbuh
di media budaya.
• Semua termos berisi media kultur, baik untuk wadah konvensional dan metode BacT
/ Alert® 3D, yang memiliki pertumbuhan mikroba dilakukan pewarnaan Gram dan
disubkultur untuk mengidentifikasi mikroorganisme. Tes diulang lima kali, pada hari
yang berbeda, sampai total 10 ulangan untuk setiap produk di setiap konsentrasi
mikroba dari setiap mikroorganisme.

6. Apakah yang dimaksud dengan kontrol negatif dan kontrol positif? Uraikanlah
fungsinya dalam uji sterilitas!
• Kontrol negatif adalah suatu kelompok di mana keadaan atau kondisi percobaan
dibuat sedemikian rupa sehingga pasti menghasilkan hasil yang negatif. Kontrol
negatif kultur media digunakan untuk memastikan sterilitas reagen/media.
• Kontrol positif adalah suatu kelompok di mana keadaan atau kondisi percobaan
dibuat sedemikian rupa sehingga pasti menghasilkan hasil yang positif. Kontrol
positif dari inokulum digunakan untuk memastikannya viabilitas dan kemampuan
media untuk menumbuhkan bakteri.

7. Bagaimanakah perbandingan antara Rapid sterility testing dan Pharmacopeia

sterility test dalam mendeteksi pertumbuhan mikroorganisme?
Rapid sterility mendeteksi pertumbuhan mikroba lebih cepat daripada metode
farmakope terutama sistem 3D BacT/Alert®, menggunakan suhu 32,5˚C untuk
mendeteksi semua mikroorganisme dievaluasi
Pharmacopeia sterility test Mendeteksi pertumbuhan mikroba lebih lambat dan
membutuhkan dua suhu inkubasi