PCR Konvensional Untuk Diagnosis Molekuler Strongyloidiasis Manusia

Oleh: RB SITTA1, FM MALTA1,2, JR PINHO1,2, PP KEPALA1.3, RCB GRYSCHEK4 dan FM PAULA4

PENDAHULUAN

Strongyloidiasis adalah infeksi usus manusia yang mempengaruhi antara 30 dan 100 juta orang
di seluruh dunia. Infeksi kronis di daerah endemik dapat tetap asimtomatik selama beberapa dekade
melalui siklus autoinfeksi larva filariform L3. Diagnosis infeksi kronis ini terkadang rumit, membutuhkan
metode diagnostik yang lebih sensitif, terutama pada infeksi tingkat rendah dan pasien dengan
gangguan sistem imun.

Diagnosis strongyloidiasis dicurigai ketika tanda-tanda dan gejala klinis sugestif diamati,
terutama eosinofilia. Saat ini, diagnosis definitif biasanya dicapai dengan deteksi larva feses
menggunakan metode parasitologi, menggunakan teknik konsentrasi atau kultur tinja pada media
cawan agar. Metode ini melelahkan dan memakan waktu, membutuhkan keahlian dan pengumpulan
tinja berulang dan pemeriksaan selama beberapa hari berturut-turut. Sebaliknya, beberapa tes
imunologi, menunjukkan sensitivitas dan spesifisitas variabel, telah dipelajari untuk diagnosis infeksi
Strongyloides stercoralis. Namun, penggunaan metode ini memiliki keterbatasan tertentu karena
antibodi reaktif silang dari infeksi cacing lain atau hasil positif serologis dari infeksi sebelumnya.
strongyloids infeksi.

Deteksi DNA menjadi semakin sering digunakan dalam diagnosis infeksi parasit, metode ini
memiliki sensitivitas potensial untuk mengatasi masalah yang dihadapi dalam mendiagnosis
strongyloidiasis manusia. Teknik berbasis polymerase chain reaction (PCR) telah dikembangkan dan
digunakan untuk mendeteksi parasit usus yang berbeda dalam sampel tinja. Baru-baru ini, deteksi DNA
parasit dalam sampel tinja menggunakan real time PCR telah terbukti menjadi metode yang sensitif dan
spesifik untuk diagnosis infeksi S. stercoralis.

METODE

Dalam penelitian ini, uji PCR konvensional diterapkan untuk mendeteksi DNA S. stercoralis dalam sampel
tinja dan kinerjanya dievaluasi dalam sampel dari pasien dengan strongyloidiasis.

TAHAPAN

1. SAMPEL
Sampel tinja dari 103 pasien Rumah Sakit das Clínicas, Fakultas Kedokteran, Universitas São
Paulo (HC-FMUSP) dikumpulkan dan diperiksa, kemudian di kultur lempeng agar. Setelah
dilakukan uji parasitologi, sampel tinja diawetkan dalam etanol 70% pada suhu 4 °C. Sampel
tersebut antara lain:
1) 33 sampel feses positif S. stercoralis dengan metode parasitologis;
2) 30 sampel tinja positif untuk infeksi parasit lain yang terdeteksi dengan metode rutin
 3) 40 sampel tinja, dikumpulkan dari pasien sehat (berdasarkan pengamatan klinis), yang
kopronegatif dan negatif dengan metode parasitologi, dan riwayat pasien yang ditunjukkan
dalam bukti kontak dengan S. stercoralis infeksi atau pengobatan sebelumnya untuk
strongyloidiasis.

2. EKSTRAKSI DNA
 Sekitar 500 mg sampel tinja yang diawetkan dalam etanol 70% dikocok kuat-kuat,
disentrifugasi dan pelet dicuci dua kali dengan saline buffer fosfat (0,01 mol L) pH 7,2.
 DNA diekstraksi dari pelet menggunakan QIAamp. komersial® Feses DNA MiniKit (Qiagen,
Hilden, Jerman), dengan sedikit modifikasi, dan ditambahkan buffer lisis yang mengandung
proteinase K, lalu inkubasi semalaman pada 56°C.
 DNA dielusi dengan buffer elusi 100 L dan diukur menggunakan NanoDrop ND-1000
Spektrofotometer UV-VIS v.3.2.1 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, AS).
3. PCR KONVENSIONAL
 Menggunakan dua set primer yang terletak pada gen RNA ribosom 18S yang diperoleh di
GenBank digunakan untuk amplifikasi DNA Strongyloides stercoralis. Set primer ini diperoleh
dari Strongyloides stercoralis (aksesi AF279916) dan Strongyloides venezuelensis (aksesi
AJ417026)

 PCR dilakukan dalam master cycler dan p gradien S thermocycler (Eppendorf, Hamburg,
Jerman).
 Reaksi dilakukan dalam volume akhir 25 L yang mengandung 10 mM dNTP, 20 pmol setiap
primer, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl pH 8,4, 0·5 U Platinum Taq DNA polimerase (Invitrogen,
Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) dan 100 ng DNA yang diekstraksi.
 Langkah denaturasi awal pada 95 °C selama 5 menit, diikuti oleh 40 siklus 95 °C selama 30
detik (denaturasi), 55 °C (anil primer spesifik spesies) atau 60 °C (anil primer spesifik genus)
selama 30 detik dan 72 °C selama 30 detik (perpanjangan), diikuti dengan langkah ekstensi
terakhir pada 72 °C selama 5 menit.
 Produk PCR dimuat pada gel agarosa 2% yang mengandung etidium kemudian di
elektroforesis dalam buffer 1x TAE. Pita DNA yang diwarnai divisualisasikan menggunakan
sinar ultraviolet.

4. KONTROL
 Kontrol positif: Larva filariformis Strongyloides stercoralis dikumpulkan dari pelat agar-agar
positif kemudian dilakukan pencucian menggunakan etanol 70%. DNA yang diekstraksi
darinya digunakan sebagai kontrol positif selama uji molekuler.
 Kontrol Negatif : Menggunakan campuran PCR tanpa templat DNA yang dimasukkan dalam
setiap proses amplifikasi.
HASIL
Tabel 1. Perbandingan hasil yang diperoleh dengan metode PCR parasitologi dan konvensional untuk deteksi
Strongyloides stercoralis dalam sampel tinja

 Dari 103 sampe yang diperiksa dengan metode parasitologi didapatkan : 33 sampel feses positif
Strongyloides stercoralis, 40 sampel negatif dan 30 sampel infeksi parasit lainnya.

 Hasil PCR pada sampel feses Strongyloides stercoralis menggunakan primer spesifik spesies dan
genus masing-masing positif pada 28 sampel (84,8%) dan 26 sampel (78,8%).

 Di antara 40 sampel tinja yang negatif dengan metode parasitologi, amplifikasi DNA
Strongyloides stercoralis terdeteksi pada 7 sampel (17,5%) menggunakan primer spesifik spesies
dan 2 sampel (5,0%) menggunakan primer spesifik genus.

 Dalam 30 sampel tinja positif untuk infeksi parasit lain, amplifikasi DNA Strongyloides stercoralis
terdeteksi pada 4 sampel (13,3%) menggunakan primer spesifik spesies, dan pada 9 sampel
(30,0%) dengan primer spesifik genus, termasuk sampel yang terinfeksi S.mansoni (n = 2), cacing
tambang (n = dua), A. lumbricoides (n = 1), H. nana (n = 1), G. lamblia (n = 1) dan sampel yang
terinfeksi poli (n = 2).
Gambar 1. Produk PCR pada gel agarosa 2.0%.

(A) Amplifikasi gen 18S dengan pasangan primer spesifik spesies (101 bp).
Lane M, penanda ukuran DNA (tangga 100 bp; Fermentas);
jalur 1, kontrol negatif,
jalur 2, S. stercoralis DNA larva;
jalur 3-5, sampel tinja pasien yang terinfeksi S. stercoralis;
jalur 6-8, sampel tinja dengan infeksi parasit lain;
jalur 9-11, sampel tinja negatif
(B) Amplifikasi gen 18S dengan pasangan primer spesifik genus (392 bp).
Lane M, penanda ukuran DNA (tangga 100 bp; Invitrogen);
jalur 1-5, sampel tinja pasien yang terinfeksi S. stercoralis;
jalur 6, sampel tinja dengan infeksi parasit lainnya;
jalur 7, sampel tinja negatif;
jalur 8, kontrol negatif;
jalur 9, DNA larva S. stercoralis.

DISKUSI

 PCR telah terbukti menjadi metode yang sangat sensitif dan spesifik dibandingkan dengan
pemeriksaan mikroskopis dan metode berbasis antigen. Dalam penelitian ini, sensitivitas yang
serupa dengan metode parasitologi untuk mendeteksi infeksi S. stercoralis dicapai
menggunakan PCR konvensional.
  Pada sebagian besar kasus strongyloidiasis tanpa komplikasi, jumlah cacing usus sangat rendah
dan jumlah larva sedikit. Dengan demikian pengembangan tes diagnostik yang sangat sensitif
untuk mendeteksi kasus ringan strongyloidiasis sangat penting untuk mencegah infeksi yang
berpotensi fatal.

 Amplifikasi DNA dalam sampel tinja yang negatif dengan metode parasitologi mungkin
disebabkan oleh kegagalan sensitivitas metode ini. Hal ini disebabkan oleh ekskresi larva
intermiten karena infeksi kronis atau dengan adanya larva mati, sedangkan teknik PCR tidak
bergantung pada kelangsungan hidup parasit untuk mendeteksi Strongyloides Stercoralis.

 Ketika menentukan metode yang lebih sensitif dalam diagnosis strongyloidiasis, pilihan
pasangan primer sangat penting. Dalam penelitian ini, sensitivitas PCR dikaitkan dengan
spesifisitas yang lebih rendah, ditandai dengan adanya amplifikasi DNA pada sampel yang positif
untuk infeksi parasit lainnya. Kehadiran pita-pita ini dapat terjadi karena primer spesifik genus
mengamplifikasi berbagai daerah berbeda dari gen RNA ribosom 18S, alih-alih wilayah spesifik
nematoda yang diharapkan dan dapat disebabkan oleh kompetisi DNA untuk amplifikasi PCR
dalam sampel campuran.

KESIMPULAN

Studi ini menunjukkan bahwa PCR konvensional yang menggunakan pasangan primer spesifik spesies
menyediakan metode molekuler yang spesifik dan sensitif untuk diagnosis S. stercoralis dalam sampel
tinja manusia. Studi lebih lanjut diperlukan untuk menentukan efek dari beberapa sampel tinja pada
tingkat deteksi infeksi S. stercoralis dengan metode berbasis PCR. Selain itu, PCR konvensional untuk
mendeteksi S. stercoralis dapat diterapkan dalam kaitannya dengan pemeriksaan sampel tinja di studi
epidemiologi untuk meningkatkan diagnosis strongyloidiasis, terutama pada individu dengan sistem
imun yang berisiko terhadap penyakit fatal.

REFERENSI