Nama : reza verindah

Nim: 19133530001

 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP); merupakan metode yang

digunakan untuk membedakan organisme dilihat dari analisis model derifat dari
perbedaan DNA satu dengan lain.
 Cara kerjanya : Metode PCR-RFLP digunakan primer ITS1 (5’
TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3’) dan ITS4 (5’
TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’).Sampel dengan volume 25 μL
mengandung 10-μl10×buffer reaksi, 100μmol/LdATP,dCTP,dGTP,dandTTP,
14,5-μL enzim kappa26, 20 μM setiapprimer;dan7-μl DNAtemplate, MgCl2
0,5-μL, DMSO 1-μL. Kemudian dilakukan amplifikasi PCR. Setiap campuran
reaksi dipanaskan pada suhu 94ºC selama 5 menit. Amplifikasi PCR dilakukan
dengan 39 siklus dengankondisi berikut: 95ºCselama5 menit; 94ºC selama 1
menit; 52,8 ºC selama 30 detik; 72ºCselama 1menitdan72ºCselama 7menit.
Kemudian dipisahkan dengan Elektroforesis gel menggunakan 2% gel
agarose kemudian dideteksi dengan menggunakan sinar UV. Kemudian, 5
μL hasil ekstraksi ditambahkan 1,5 μL x 10 buffer, 0,5 μL (5U) dari enzim
restriksi MvaI, ditambahkan nuclease free water9 μL, kemudian diinkubasi pada
suhu 37oC selama 60 menit, dilanjutkan pada proses elektroforesis gel agarosa
2% selama 90 menit dengan voltase 80V.
 Hasil akhir yang didapatkan adalah Hasil penelitian menunjukkan bahwa semua
sampel teridentifikasi yakni M. canis 26,1%, Trichophyton rubrum 13,1%,T.
mentagrophytes 21,6%, T. tonsurans 8,7%, T. verrucosum 4,2% dan spesies
unclassified 26,1%

 Kemudian untuk metode Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)

digunakan untuk mendeteksi adanya polimorfisme dalam tingkat DNA yang
dikembangan dari teknik PCR menggunakan beberapa primer dengan sequens acak
untuk keperluan amplifikasi lokus acak dari genom.
 Cara kerjanya: PCR dibuat dengan volume 20 μL yang mengandung 50 ng DNA
dari setiap aksesi, 10 pmoles primer DNA (0,4 μM), 10 nM setiap dNTP, 1 U Taq
polimerase (Promega) dan 2,5 μL Taq polimerase 10x bufer Promega (500 mM
KCL, 15 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl pH 9,0). Primer dekamer dari Operon
Technologies (Alameda, CA) digunakan dalam percobaan ini. Campuran reaksi
PCR contoh dalam tabung eppendorf selanjutnya dilapisi dengan 1 tetes minyak
mineral. Reaksi amplifikasi DNA dilakukan menggunakan Thermolyne II Thermal
Cycler, dengan kondisi PCR sebagai berikut: satu siklus 3 menit pada suhu 94 °C,
 dan diikuti dengan 45 siklus selama 1 menit pada suhu 94 °C (denaturasi), 1 menit
pada suhu 37 °C (annealing), 2 menit pada suhu 72 °C (ekstensi). Seluruh produk
amplifikasi DNA dilengkapi dengan ekstensi selama 1 menit pada suhu 72 °C.
Setelah amplifikasi, produknya kemudian dielektroforesis pada konsentrasi agarose
1,5%, konsentrasi ethidium 0,005% (pada buffer) dan 0,00625% (pada agar).
Kemudian dilarutan 1x TBE buffer dan dialirkan pada tegangan listrik 121 Volt
selama 3-4 jam. Hasil elektroforesis difoto menggunakan BIO-RAD Gel Doc™
EQ.
 Hasil penelitian menunjukkan ada satu primer yang tidak menghasilkan pita DNA,
yaitu OPF-01. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh tidak ada sekuen
komplementer pada DNA genom atau hanya ada satu untai yang mengandung
sekuen komplementer dengan primer tersebut

Daftar pustaka:
file:///C:/Users/Laptop/Downloads/Polymerase-Chain-Reaction-PCR.pdf
https://jurnal.poltekkes-kemenkes-bengkulu.ac.id/index.php/jmk/article/view/615/311
https://media.neliti.com/media/publications/141492-none-9533f7ea.pdf