NAMA : HATIMAH NURHANIDA

NIM : P07134220016

PRODI : SARJANA TERAPAN TLM

MATKUL : BAKTERIOLOGI II

RESUME JURNAL

Judul Artikel :

Enumeration and Survivability Assessment of Three Major Vibrios in Frozen

Sushi using Multiplex MPN-PCR Assay

Penulis :

M. A. Motalib Hossain

Nama Jurnal :

Bonny SQ, et al. Food Nutr J 5: 228.

Tahun, halaman :

Volume 5; Issue 03

Tujuan Penelitian :

Sushi adalah salah satu masakan Jepang yang populer dan banyak dikonsumsi di
Malaysia. Vibrio vulnificus, Vibrio cholerae dan Vibrio parahaemolyticus adalah
patogen yang ditularkan melalui ikan yang paling merusak bagi manusia.
Meskipun kemunculan beberapa bakteri patogen lain telah diuji dalam sushi,
keberadaan dan pola bertahan hidup dariV. vulnificus, V. cholerae dan V.
parahaemolyticus pada sushi Ready-to-Eat (RTE) di Malaysia belum diteliti
secara menyeluruh. Oleh karena itu, kemungkinan ancaman terhadap keamanan
pangan yang terkait dengan konsumsi sushi yang terkontaminasi masih kurang
terdeteksi. Kami mengatasi kesenjangan penelitian ini dengan menghitung V.
vulnificus, V. cholerae dan V. parahaemolyticus dalam sushi RTE menggunakan
sistem multipleks berbiaya rendah Most probability number-PCR (MPN-PCR).
Hitungan MPN-PCR dipelajari dan pola viabilitas bakteri target di bawah tiga
kondisi penyimpanan yang berbeda disajikan. Sebanyak 70 sampel sushi
dianalisis dan 16 (22,86%), 8 (11,43%) dan 4 (5,71%) sampel ditemukan positif
untukV. parahaemolyticus, V. vulnificus dan V. kolera, masing-masing

Sampel :

Berbagai jenis sushi beku Ready-To-Eat (RTE) (n=70) dibeli dari berbagai
supermarket di Selangor dan Kuala Lumpur, Malaysia antara pukul 11:00 dan
14:00 dalam 10 hari

Metode :

Sebanyak 66 sampel (16 dipasteurisasi, 25 tidak dipasteurisasi dan 25 susu

mentah) dikumpulkan dari berbagai lokasi di Lembah Kathmandu. Sampel
tersebut dilakukan penghitungan total plate count dan total coliform count dengan
metode pour plate. Selanjutnya dilakukan identifikasi terhadap keberadaan E. coli
dan S. aureus dengan tes biokimia.

Hasil Penelitian :

Penyuburan, Dalam penelitian ini, prosedur pengayaan dua langkah yang telah
dievaluasi lebih efisien daripada pengayaan satu langkah, diterapkan. Pada
langkah pertama, 10 g masing-masing sampel ditambahkan ke 90 ml Tryptic Soy
Broth (TSB; BactoTM, Prancis) yang dilengkapi dengan 3% natrium klorida
(NaCl; Merck, Jerman) dan campuran dihomogenisasi diikuti dengan pra-
pengayaan melalui inkubasi pada 37°C selama 6 jam sebelum analisis lebih lanjut
dilakukan. Pada langkah selanjutnya, pengenceran sampel yang telah diperkaya
dilakukan dari 10-1 ke 10-7 dalam Salt Polymyxin Broth (SPB; Nissui, Jepang)
diikuti dengan inkubasi tabung pada suhu 37 °C selama 14 sampai 16 jam. Setelah
pengayaan, uji PCR dilakukan dengan sampel encer yang ditemukan keruh dan
konsentrasinya (MPN g-1) mikroorganisme hidup yang ada dalam sampel ikan
mentah ditentukan dari perhitungan yang menggunakan Metode Mikrobiologis
berbantuan komputer & Manual Analisis Bakteriologis (BAM).

Ekstraksi DNA, pengurutan DNA Metode sel rebus diterapkan untuk ekstraksi
DNA dari semua tabung keruh. Di sini, beberapa modifikasi metode sel rebus
dibuat untuk menghilangkan efek penghambatan dalam analisis PCR berikutnya.
Secara singkat, 1 ml homogenat makanan bening diambil dalam tabung microfuge
1,5 ml kemudian disentrifugasi pada suhu 12.000 rpm selama 3 menit. Setelah
supernatan dibuang, pelet disuspensikan kembali dalam 100 L buffer 1X PBS pH:
7,4 dan dilakukan sentrifugasi lagi pada 12.000 rpm selama 2 menit. Langkah
pencucian dengan buffer 1X PBS ini diulang satu kali dan supernatan dibuang.
100 L air suling steril ditambahkan ke pelet, direbus selama 10 menit dan
didinginkan dalam es. Kemudian, suspensi sel disentrifugasi kembali pada 13.400
rpm selama 3 menit. Sekitar 80 L supernatan yang mengandung DNA kasar
dipindahkan ke tabung sentrifus mikro steril dan diawetkan pada suhu -20°C
untuk penggunaan di masa depan. Pemurnian produk PCR dilakukan dengan
menggunakan kit pemurnian PCR (First Base, Selangor, Malaysia) diikuti dengan
visualisasi sampel dalam gel agarosa 1,5% dengan menerapkan sekitar 1 l sampel
murni. Produk PCR yang dimurnikan diurutkan secara dua arah dalam
penganalisis genetik ABI PRISM 96-kapiler 3730xl (Applied Biosystems, USA)
menggunakan kit pengurutan siklus BigDye® Terminator v3.1. analisis MPN
Hitungan MPN (MPN g-1) dihitung berdasarkan Metode Mikrobiologi & Manual
Analisis Bakteriologis (BAM) untuk memantau terjadinya V. vulnificus, V.
cholerae, dan V. parahaemolyticus dalam sampel sushi beku. Hasil dan Diskusi
Produk sushi RTE yang disiapkan secara komersial yang tersedia di supermarket
Malaysia menjadi sasaran karena sushi mentah yang disiapkan di restoran atau di
rumah dikonsumsi dalam waktu persiapan yang singkat, tidak seperti sushi beku
RTE yang disiapkan secara komersial. Profil waktu dan suhu selama persiapan
dan penyimpanan sushi yang disiapkan secara industri sampai konsumsi sangat
penting sehubungan dengan umur simpan dan keamanan pangan.
PCR multipleks, Dalam penelitian ini, primer spesifik spesies digunakan dari
literatur yang diterbitkan sebelumnya. Urutan primer untuk
mengidentifikasigetaran spesies diberikan di bawah ini: Untuk V.vulnificus,
Maju: 5′-TTCCAACTTCAAACCGAACTATGAC-3′; Mundur: 5′-
ATTCCAGTCGATGCGAATACGTTG-3′, untukV. Kolera Maju: 5′-
CAGTAAAAGAAACGACCAAACTC-3′; Terbalik: 5′ -
TGCCAGTTTCGATGATGCCG-3′ dan untuk V.parahaemolyticus, Maju: 5′-
AGCAAGTTTCGATGATGCTG-3′; Mundur: 5′-
ACCAGCAACCAAAACTTTCGCT-3′. Primer untuk V. kolera dan V.
parahaemolyticus produk PCR 338 bp dan 409 bp yang diperkuat dari Sebuah gen
sedangkan untuk V. vulnificus amplikon 205 bp diperkuat dari Sebuah gen. Uji
PCR multipleks dilakukan dengan total volume reaksi 25 L yang terdiri dari 5 L
buffer PCR 5 L, 1,0 L 10 M masing-masing primer, 1,0 L campuran 10 mM
dNTP (deoxynucleoside triphosphate), 3,0 L 25 mM MgCl , 0,125 L dari Taq
polimerase (5U/µL), 2,0 L template DNA (50 ng/ L) dan 2,0 L template IAC dan
jumlah ddH O yang dibutuhkan. Kontrol negatif dilakukan dengan mengganti
DNA template dengan air deionisasi. Parameter siklus terdiri dari denaturasi awal
pada 94°C selama 4 menit diikuti oleh 35 siklus denaturasi pada 94 °C selama 1
menit, anil pada 60 °C selama 1 menit, ekstensi pada 72 °C selama 1 menit dan
ekstensi terakhir pada 72 °C selama 5 menit. Untuk pemisahan, produk PCR
dimuat dalam gel agarosa 2% yang diwarnai dengan pewarnaan DNA Florosafe
(First Base, Selangor, Malaysia) diikuti dengan elektroforesis pada 120 V selama
80 menit dalam buffer 1 × TBE (Tris borate-EDTA). Gel divisualisasikan
menggunakan sistem Dokumentasi Gel (AlphaImager HP, Alpha Innotech Corp.,
California, USA). Sebuah penanda ukuran molekul 50 bp (Promega, USA)
digunakan untuk menilai panjang fragmen. Semua percobaan dilakukan dalam
tiga jalur yang berbeda dan nilai rata-rata dipilih untuk hasilnya. Semua analisis
PCR diulang dua kali

Pengurutan DNA, Pemurnian produk PCR dilakukan dengan menggunakan kit

pemurnian PCR (First Base, Selangor, Malaysia) diikuti dengan visualisasi
sampel dalam gel agarosa 1,5% dengan menerapkan sekitar 1 l sampel murni.
Produk PCR yang dimurnikan diurutkan secara dua arah dalam penganalisis
genetik ABI PRISM 96-kapiler 3730xl (Applied Biosystems, USA) menggunakan
kit pengurutan siklus.

Analisis MPN, Hitungan MPN (MPN g-1) dihitung berdasarkan Metode

Mikrobiologi & Manual Analisis Bakteriologis (BAM) untuk memantau
terjadinya V. vulnificus, V. cholerae, dan V. parahaemolyticus dalam sampel
sushi beku.

Hasil :

Dari 70 sampel sushi, 16 (22,86%), 8 (11,43%) dan 4 (5,71%) sampel ditemukan

positif V.parahaemolyticus, V. vulnificus dan V. kolera, masing-masing, pada
titik penjualan. Setelah 4-5 jam penyimpanan pada suhu kamar (25-270C), 20
(28,57%), 9 (12,86%) dan 4 (5,71%) sampel ditemukan positif untuk V.
parahaemolyticus, V. vulnificus dan V. kolera, masing-masing. Selanjutnya,
setelah 7 hari pembekuan pada -200C, 7 (10%), 6 (8,57%) dan 3 (4,29%) sampel
ditemukan mengandung V. parahaemolyticus, V. vulnificus dan V. kolera,
masing-masing.

Kesimpulan :

Kontaminasi sushi dengan Vibrio spesies memiliki dampak langsung pada

kesehatan masyarakat dan terjadinya V. vulnificus, V. cholerae dan V.
parahaemolyticus di RTE Malaysia sushi mencerminkan bahwa mereka dapat
menjadi sumber penyakit bawaan makanan yang penting jika tidak disiapkan
dalam kondisi higienis dan disimpan dengan benar. Pendekatan terpadu dengan
menggabungkan teknik MPN dalam pengujian PCR multipleks sangat
menjanjikan dengan peningkatan efisiensi untuk deteksi kuantitatif beberapa
spesies dalam platform pengujian tunggal. Temuan ini menyoroti besarnya risiko
kesehatan masyarakat yang terkait denganV. vulnificus, V. cholerae dan V.
parahaemolyticus penyakit bawaan yang dikaitkan dengan asupan rutin ikan
mentah yang membawa bakteri ini. Selain itu, pola survivabilitas menunjukkan
bahwa pembekuan yang direkomendasikan tidak dapat mencegah pertumbuhan
bakteri sepenuhnya. Peningkatan beban mikroba darigetaran di sushi setelah 4-5
jam penyimpanan pada suhu kamar jelas menunjukkan kemungkinan risiko
kesehatan jika dikonsumsi dalam keadaan itu. Setidaknya 7 hari pembekuan pada
-200C dengan penyimpanan berikutnya di bawah 5 0C sampai penyajian dapat
mengontrol pertumbuhan bakteri. Oleh karena itu, membekukan dan menyimpan
makanan laut pada suhu -200C atau di bawahnya selama 7 hari, seperti yang
direkomendasikan untuk menghindari peningkatan jumlah mikroba, harus dijaga
dan dipantau secara ketat untuk memastikan bahwa sushi aman untuk dikonsumsi.