Yayang Fidia

1905101050020
Peningkatan Fitoremediasi TNT dan Tanah yang Terkontaminasi Kobalt dengan
Pabrik Transformasi AfSSB
Jian-jie Gao, Ri-he Peng , Bo Zhu, Yong-sheng Tian , Jing Xu , Bo Wang, Xiao-yan Fu, Hong-juan Han ,
Li-juan Wang , Fu-jian Zhang , Wen-hui Zhang , Yong-dong Deng , Yu- Wang , Zhen-Jun Li , Quan-Hong
Yao

ABSTRAK
Kontaminan 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) dan kobalt (Co) telah menimbulkan masalah
lingkungan yang parah di banyak negara-negara. Fitoremediasi merupakan teknologi ramah
lingkungan untuk remediasi kontaminan tersebut. Namun, toksisitas TNT dan kobalt membatasi
kemanjuran aplikasi fitoremediasi. Saat ini penelitian menunjukkan bahwa mengekspresikan gen
protein pengikat DNA untai tunggal Acidithiobacillus ferrooxidans (AfSSB) dapat meningkatkan
toleransi Arabidopsis dan fescue tinggi terhadap TNT dan kobalt. Dibandingkan dengan tanaman
kontrol, AfSSB mengubah Arabidopsis dan fescue tinggi menunjukkan peningkatan fitoremediasi TNT
dan kobalt tanah yang terkontaminasi secara terpisah dan tanah yang terkontaminasi bersama.
Analisis komet mengungkapkan bahwa AfSSB berubah Arabidopsis mengalami penurunan kerusakan
DNA dibandingkan tanaman kontrol di bawah paparan TNT atau kobalt. Selain itu, analisis proteomik
mengungkapkan bahwa AfSSB meningkatkan toleransi TNT dan kobalt dengan memperkuat sistem
pemulung reaktif su peroksida (ROS) dan sistem detoksifikasi. Hasil yang disajikan di sini berfungsi
sebagai dukungan teoretis yang kuat untuk potensi fitoremediasi polutan organik dan logam yang
dimediasi oleh untai tunggal gen protein pengikat DNA.

1. Pendahuluan
Karena kegiatan industri dan antropogenik, senyawa organik dan polutan logam berat
menjadi masalah lingkungan yang signifikan (Boyd, 2010; Edo et al., 2017; Giovanella et al., 2020;
Valls dan De Lorenzo, 2002). Misalnya, di pertambangan kobalt dan kegiatan pengolahan bijih,
senyawa organik 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) dan logam berat kobalt (Co) dilepaskan ke lingkungan
dan telah mencemari lingkungan di wilayah yang luas (Lange dkk., 2016; Lewis et al., 2004; Wang
dkk., 2016). TNT adalah salah satu yang paling bahan peledak yang biasa digunakan oleh militer dan
industri pertambangan.
Beberapa garis bukti menunjukkan bahwa TNT bersifat teratogenik, sitotoksik dan mungkin
menyebabkan mutasi sel (Habineza et al., 2017). Ini telah terdaftar sebagai kemungkinan karsinogen
manusia oleh Badan Perlindungan Lingkungan AS (EPA) (Letzel et al., 2003). Kobalt adalah komponen
penting dari baterai lithium-ion untuk kendaraan listrik. Dalam beberapa tahun terakhir,
pertumbuhan eksponensial dalam permintaan baterai lithium-ion mengharuskan meningkatkan
pasokan kobalt (Gourley et al., 2020; Li dan Lu, 2020). Memiliki telah ditunjukkan bahwa logam
kobalt bersifat genotoksik, terutama disebabkan oleh kerusakan DNA oksidatif oleh spesies oksigen
reaktif (Guo et al., 2017).
Badan Internasional untuk Penelitian Kanker (IARC) telah mendaftarkan logam kobalt
sebagai kemungkinan karsinogenik bagi manusia (Grup 2B)(Sauni et al.,2017).Karena TNT dan kobalt
menyebabkan ancaman berat bagi kesehatan manusia, itu adalah mendesak untuk membersihkan
polutan lingkungan ini (Banza et al., 2019). Metode konvensional untuk menghilangkan polutan dari
yang terkontaminasi tanah adalah kimia dan fisik. Namun, sebagian besar metode ini adalah relatif
mahal dan dapat menghasilkan produk samping yang beracun. Emediasi fitor adalah alat yang ramah
lingkungan, hemat biaya, dan dapat diterima untuk membersihkan polutan dari air tanah dan tanah
yang terkontaminasi (Ortakci et al., 2019; Souza et al., 2018). Banyak sarjana telah mencoba
stabilitas genomik atau berinteraksi dengan banyak protein pemeliharaan genom (Ashton et al.,
2013; Mar´echal dan Zou, 2015). Sebuah studi sebelumnya menunjukkan bahwa SSB
mempertahankan integritas genom di semua organisme (Wudkk., 2016).
Karya ini bertujuan untuk menguji kelayakan peningkatan mediasi fitor TNT dan kobalt
dengan mengekspresikan tanaman rekayasa genetika SSB. Acidithiobacillus ferrooxidans
(sebelumnya Thiobacillus ferrooxidans) adalah bakteri chemolithoautotrophic mampu mereduksi
logam sulfida dan tumbuh pada konsentrasi tinggi dari beberapa logam (Claudio et al., 2013). Studi
sebelumnya menunjukkan bahwa Acidithiobacillus ferrooxidans memiliki resistensi terhadap banyak
polutan lingkungan (Park et al., 2007) dan dapat digunakan untuk memulihkan situs yang
terkontaminasi (Blazek et al., 2018; Sur, 2017). Untuk alasan ini, protein pengikat DNA untai tunggal
dari Acid ithiobacillus ferrooxidans (AfSSB) (WP_011814970) dipilih untuk menguji asumsi ini dalam
penelitian ini. Menggunakan metode fitoremediasi untuk menghilangkan polutan organik dan logam
dari air tanah dan tanah (Arslan et al., 2017; Ashraf et al.,2019; Rai dkk., 2020).
Penelitian sebelumnya telah menetapkan bahwa mekanisme yang berbeda adalah terlibat
dalam fitoremediasi polutan organik dan logam. Secara umum fitoremediasi kontaminan organik
mengacu pada penyerapan dan transformasi, sedangkan fitoremediasi logam berat mengacu pada
akumulasi. Misalnya, polutan sianida organik dan naftalena dapat dibiotransformasi oleh sitokrom c
oksidase dan sitokrom P450 monooksigenase (CYPs), masing-masing (Chica et al., 2005;Kebeish dkk.,
2017).
Beberapa penelitian menunjukkan fitoremediasi dari logam berat (Cd dan Zn) melalui
ekstraksi translokasi, akumulasi, distribusi (He et al., 2020). Dalam beberapa tahun terakhir,
penelitian tentang mekanisme yang terlibat dalam fitoremediasi TNT dan kobalt memiliki membuat
beberapa kemajuan. Fitoremediasi TNT mengikuti reduktif klasik jalur transformasi untuk
membentuk hidroksil amino-DNTs (HADNT), kemudian amino-DNT (ADNT) (Rylott dan Bruce, 2019).
Fitoremediasi kobalt mengikuti jalur akumulasi logam berat klasik (Islam et al.,2018).
Sementara itu, fitoremediasi pencemaran organik dan logam yang efektif membutuhkan
toleransi tanaman terhadap toksisitas kontaminan tersebut. Sekarang mapan dari berbagai
penelitian bahwa toksisitas TNT dan kobalt disebabkan oleh kerusakan DNA (Faisal et al., 2016;
Hengstler et al., 2003;Homma-Takeda dkk., 2002). Sangat menggoda untuk mengasumsikan bahwa
pereduksi DNA kerusakan dapat meningkatkan toleransi terhadap polutan dan meningkatkan
efisiensi emediasi fitor. Untuk memverifikasi hipotesis ini, gen yang terlibat dalam mengurangi
kerusakan DNA harus dipilih dan diubah menjadi tanaman.
Protein pengikat DNA untai tunggal (SSBs) mengandung dua bagian: replikasi protein A (RPA)
pada eukariota dan DNA untai tunggal protein pengikat (SSB) pada bakteri. RPA dan SSB sangat
dilestarikan sepanjang evolusi dan homolog (Ishibashi et al., 2006). Banyak penelitian telah
menunjukkan bahwa SSB memainkan peran penting dalam kerusakan DNA perbaikan (Chen et al.,
2016; Dubiel et al., 2020). Dalam hal DNA kerusakan, replikasi DNA terganggu, menyebabkan garpu
terhenti (Petermann dan Helleday, 2010). SSB memulai pos pemeriksaan kerusakan DNA
pensinyalan melalui eksekusi dan aktivasi pos pemeriksaan (Sancar et al., 2004) dan kemudian
direkrut ke situs-situs ini untuk menstabilkan garpu yang macet.
Selain perbaikan langsung, SSB juga secara tidak langsung memperbaiki kerusakan DNA
dengan berinteraksi dengan protein yang terlibat dalam menstabilkan garpu replikasi (Lidkk., 2015).
Selain perbaikan kerusakan DNA, SSB dapat langsung mempertahankan 2. Bahan-bahan dan
metode-metode

2.1 Bahan dan Metode

2.1. Generasi dan seleksi tanaman yang ditransformasikan AfSSB
Acidithiobacillus ferrooxidans, Arabidopsis thaliana (ekotipe) Columbia) dan tanaman fescue
tinggi disimpan dari laboratorium kami. NS gen protein pengikat DNA untai tunggal dari
Acidithiobacillus ferroox idans (AfSSB, GenBank ID: 3130156) disintesis menurut preferensi kodon
tanaman menggunakan metode two-step DNA synthesis (PTDS) berbasis PCR (Xiong et al., 2006).
Gen sintetik adalah disubklon ke dalam konstruksi akhir hasil vektor pCAMBIA1301 pCAM
BIA1301/AfSSB. Untuk transformasi Arabidopsis thaliana, pCAM BIA1301/AfSSB dimasukkan ke
dalam Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Clontech, Palo Alto, CA) dengan elektroporasi dan
kemudian dipindahkan ke Arabidopsis thaliana melalui metode celup bunga (Clough dan Bent,
1998). Benih T1 disaring untuk resistensi higromisin pada
Pelat agar Murashige dan Skoog (MS) yang mengandung higromisin 30 mg/L. Untuk
transformasi fescue tinggi, pCAMBIA1301/AfSSB diperkenalkan menjadi Agrobacterium tumefaciens
strain EHA105. Bijinya dibedah secara aseptik dan dikultur pada media MS padat pada suhu 24 C
dalam kondisi gelap selama 10 hari. Kalus kompak dipisahkan dengan pisau bedah dan dikultur
bersama dengan strain Agrobacterium yang dihasilkan selama 3 hari pada 22 C dalam gelap selama 3
hari dan kemudian dipindahkan ke media MS selektif (mengandung 2,4-D 5 mg/L+ 6-BA mg/L+ 30
mg/L higromisin). Setelah tiga putaran seleksi, embrio granular dipindahkan ke MS . diferensiasi
sedang (mengandung 2 mg/L 6-BA, 2,5 mg/L KT). Kemudian, bibit dipindahkan ke media perakaran
(1/2 MS+0,5 mg/L NAA).

2.2. Analisis PCR

RT-PCR dilakukan untuk mengkonfirmasi transkripsi AfSSB. Total RNA diekstraksi dari bibit
menggunakan RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Jerman) dan dimurnikan menggunakan RNase-
Free DNase Set (Qiagen). cDNA disintesis dari RNA total menggunakan Reverse
Reagen Transkripsi (Takara, Shiga, Jepang) mengikuti instruksi pabrik. Primer berikut
dirancang dari AfSSB cDNA untuk amplifikasi PCR cDNA AfSSB dari garis transgenik: AfSSBZ (5′ -GCA
GCA GCA CAA GTC TAT CAG -3′) dan AfSSBF (5′-TGCACC CAT CAA ACC CTT CTG -3′). Sepasang primer
oligonukleotida(AtAc2Z1:5′-GCACCCTGTTCTTCTTACCGAG-3′;AtAc2F1AGTAAGGTCACGTCCAGCAAGG-
3′ khusus untuk gen aktin Arabidopsis AtAc2 (Nomor Aksesi GenBank NM112764) dan primer
(TfAc1Z1:5′-GCTGTGCTTTCCCTCTATGCCAGTG-3′; TfAc1F1: 5′-CGGTATGGCTGACACCATCACCAG-3′)
khusus untuk gen aktin fescue tinggi TfAc1 (GenBank AY194227.1) digunakan sebagai pengendalian
internal positif untuk analisis PCR.

2.3. Tes toleransi TNT dan kobalt

Banyak penelitian telah menunjukkan bahwa panjang akar mencerminkan toleransi tanaman
ke bahan kimia. Pada penelitian ini panjang akar tanaman diukur setelah Paparan TNT atau CoCl2
untuk menentukan toleransinya terhadap TNT dan kobalt. Benih jenis liar (WT) dan AfSSB mengubah
Arabidopsis, benih WT dan AfSSB yang mengubah fescue tinggi disterilkan di permukaan, dan
berkecambah pada media MS 2 hari dan kemudian dipindahkan dengan hati-hati ke MS pelat yang
mengandung TNT (0 、 3 、 5 dan 10 mg/kg). Arabidopsis diinkubasi pada fotoperiode siang dan
malam 16/8 jam pada suhu 22 C dan fescue tinggi tumbuh pada suhu 28◦C. Setelah tujuh hari,
panjang akar Arabidopsis dan tinggi feses diukur.
Untuk uji toleransi kobalt, benih WT dan AfSSB berubah Arabidopsis, benih WT dan AfSSB
mengubah fescue tinggi adalah permukaan disterilkan, dan berkecambah pada media MS 2 hari dan
kemudian dipindahkan dengan hati-hati ke pelat MS yang mengandung CoCl2 (13, 26 dan 52mg/kg).
Arabidopsis diinkubasi pada periode foto siang dan malam 16/8 jam pada suhu 22 C dan fescue
tinggi ditumbuhkan pada suhu 28 C. Panjang akar adalah diukur setelah 7 hari.

2.4. Fitoremediasi tanah yang terkontaminasi TNT dan kobalt

Untuk menentukan apakah tanaman yang ditransformasi AfSSB meningkatkan TNT dan
fitoremediasi kobalt tanah yang terkontaminasi, TNT dan kobalt tingkat penghapusan Arabidopsis
dan fescue tinggi diukur. Bibit Arabidopsis seragam berumur tiga minggu (20 bibit di setiap pot) atau
fescue tinggi (3 bibit di setiap pot) ditransplantasikan ke 1 kg tanah yang dibubuhi TNT (0, 3, 5 dan 10
mg/kg) atau kobalt (0, 13, 26 dan 52mg/kg) masing-masing. Sampel tanah diambil pada interval yang
berbeda (0, 5, 10, dan 15 hari) untuk ekstraksi TNT dan kobalt dengan dua ulangan masing-masing.
26 sampel tanah budidaya Arabidopsis dan 26 fescue tinggal sampel tanah budidaya dikumpulkan
untuk mengekstraksi sisa TNT. 26 Sampel tanah budidaya Arabidopsis dan 26 tanah budidaya fescue
tinggi sampel dikumpulkan untuk mengekstraksi sisa kobalt. Untuk menentukan apakah tanaman
yang ditransformasi AfSSB meningkatkan phy toremediasi TNT dan tanah yang terkontaminasi
kobalt.
Usia tiga minggu bibit Arabidopsis yang kuat (15 bibit di setiap pot) atau fescue tinggi (3
bibit di setiap pot) ditransplantasikan ke tanah, yang dibubuhi dengan TNT (5 mg/kg) dan kobalt ( 26
mg/kg) secara bersamaan. Tanah sampel dikumpulkan pada interval yang berbeda (0, 5, 10, dan 15
hari) untuk mengekstraksi TNT dan kobalt dengan masing-masing dua ulangan. 26 Arabidopsis
sampel tanah budidaya dan 26 sampel tanah budidaya fescue tinggi dikumpulkan untuk
mengekstraksi sisa TNT. 26 Arabidopsis-tanah budidaya sampel dan 26 sampel tanah budidaya
fescue tinggi dikumpulkan untuk mengekstraksi sisa kobalt.
Residu TNT dalam tanah dianalisis Agilent 2000 HPLC menggunakan a kolom C18 pada
panjang gelombang serapan 260 nm. Fase gerak terdiri dari 60:40 metanol: air pada laju alir 0,7
ml/menit, 20 l alikuot dari setiap sampel disuntikkan ke kolom. Waktu retensi Standar TNT
digunakan untuk mengidentifikasi sisa TNT di pabrik. NS konsentrasi kobalt diukur menggunakan
spektrofotometer (Orion™ AquaMate™ 7000, Thermo Fisher Scientific) seperti yang dijelaskan oleh
Carvalho dkk. (Carvalho et al., 1996).

2.5. Pengukuran TNT, metabolit TNT, dan kobalt pada tanaman

Setelah pertumbuhan tanaman 20 hari, tanaman dipanen, dicuci di air suling, dan kemudian
disuspensikan dalam 1 ml metanol: air (60:40). Residu TNT, sisa metabolit TNT (ADNTs)[ terdiri dari
2- amino-4,6-dinitrotoluena (2ADNT) dan 4-amino-2,6-dinitrotoluena (4ADNT)] pada tanaman
Arabidopsis dianalisis dengan HPLC sebagai berikut: fase gerak A, asetonitril; fase gerak B, air
ditambah 0,1% (v/v) asam format. Gradien berjalan sebagai berikut: 0 menit, 5% A dan 95% B; 5
menit, 5% A dan 95% B; 25 menit, 40% A dan 60% B; 30 menit, 100% A dan 0% B;
dan 35 menit, 5% A dan 95% (v/v) B (Gunning et al., 2014). Penyimpanan waktu standar TNT, 2ADNT
dan 4ADNT digunakan untuk mengidentifikasi sisa TNT, 2ADNT, dan 4ADNT di pabrik. Residu kobalt
di tanaman diukur menggunakan spektrofotometer seperti dijelaskan di atas.
2.6. Analisis proteomik
Untuk memahami mekanisme AfSSB meningkatkan TNT dan kobalt fitoremediasi, analisis
proteomik oleh Tandem Mass Tag (TMT) alat dilakukan. Sampai sekarang, proteome referensi dari
fescue tinggi telah belum divalidasi. Jika fescue tinggi diurutkan dengan proteom referensi tanggal
yang tidak valid, data proteom menjadi tidak dapat diandalkan. Sebagai tanaman model yang paling
banyak dipelajari, proteome referensi Arabidopsis thaliana memiliki lama disahkan. Dalam penelitian
ini, Arabidopsis dipilih untuk menganalisis bagaimana AfSSB meningkatkan fitoremediasi TNT dan
kobalt. WT dan AfSSB yang berusia tiga minggu mengubah Arabidopsis adalah pengobatan dengan
10 mg/kg TNT atau 52 mg/kg kobalt selama 24 jam. Seluruh tanaman ekstraksi protein dan analisis
proteomik dilakukan oleh PTM Biolabs, Inc, Hangzhou, Cina. Protein yang diekspresikan secara
berbeda (DEP) dianotasi berdasarkan istilah Gene Ontology (GO) dan protein fungsi domain
(Klopfenstein et al., 2018). Nilai P terkoreksi < 0,05 dianggap sebagai perbedaan yang signifikan
secara statistik. yang terukur protein dibagi menjadi empat kategori: Q1 (0 <Rasio <1/1,5), Q2
(1/1.5 < Rasio < 1/1.2), Q3 (1,2 < Rasio < 1,5) dan Q4 (Rasio > 1,5).

2.7. uji komet

WT dan AfSSB mengubah Arabidopsis (3 minggu) dirawat dengan 10 mg/kg TNT atau 52 mg/kg CoCl2
selama 24 jam, dan uji komet dilakukan dilakukan dengan menggunakan metode seperti yang
dijelaskan sebelumnya oleh Ryu et al.(2018). Kerusakan DNA dihitung dengan frekuensi DNA ekor
(%).2.8. Analisis statistic Hasil antar perlakuan dianalisis dengan analisis satu arah varians (ANOVA).
Signifikansi statistik dievaluasi dengan uji-F pada tingkat 5% (tingkat kepercayaan 95%). Analisis
ANOVA dilakukan menggunakan software SPSS versi 16.0.

3. Hasil
3.1. Penciptaan AfSSB mengubah A. thaliana dan fescue tinggi
AfSSB disintesis menggunakan sintesis DNA dua langkah berbasis PCR (PTDS) strategi
(Informasi urutan lihat Catatan S1). Transformasi yang dimediasi bakteri agro digunakan untuk
memperkenalkan gen protein pengikat DNA untai tunggal asam ithiobacillus ferrooxidans
(AfSSB) menjadi Arabidopsis dan fescue tinggi. Dua bulan setelah infeksi bakteri Agro, generasi T1
AfSSB mengubah Arabidopsis diperoleh. Tidak ada perbedaan signifikan yang diamati pada morfologi
WT dan AfSSB mengubah Arabidopsis. Tiga bulan setelah Agrobacterium infeksi, diperoleh bibit
kultur jaringan fescue tinggi. Tidak ada perbedaan signifikan yang diamati pada morfologi WT dan
AfSSB berubah fescue tinggi.
Untuk mengkonfirmasi keberadaan gen AfSSB di Arabidopsis transgenic dan tanaman fescue
tinggi, analisis RT-PCR dilakukan. Analisis RT-PCR menunjukkan bahwa produk DNA 303 bp terdeteksi
di Arabidopsis yang resisten terhadap higromisin (AfSSB1-AfSSB4) dan fescue tinggi (TF1-TF2) tetapi
tidak dalam tipe liar (WT) Arabidopsis dan fescue tinggi (Gbr. S1). Hasil ini menunjukkan bahwa
AfSSB berhasil diekspresikan dalam Arabidopsis dan tall fescue. RT-PCR juga menunjukkan bahwa
AfSSB1, AfSSB3 dan AfSSB4 memiliki tingkat ekspresi yang sama, sedangkan tingkat ekspresi AfSSB2
secara signifikan lebih tinggi dari garis lainnya. RT-PCR juga menunjukkan bahwa TF1, TF2 dan TF3
memiliki ekspresi yang lebih tinggi daripada garis TF4 (Gbr. S1). Dua Garis Arabidopsis (AfSSB1 dan
AfSSB2) dan dua garis fescue tinggi (TF1 dan TF2) dipilih untuk analisis lebih lanjut.

3.2. Uji toleransi untuk menegaskan respons AfSSB yang diubah

Arabidopsis dan fescue tinggi ke TNT dan kobalt. Uji toleransi TNT dan kobalt di Arabidopsis dan
fescue tinggi.
ditunjukkan pada Gambar. 1. Dalam media TNT dan bebas kobalt, panjang akar penyemaian AfSSB
tidak berbeda nyata dengan penyemaian WT bibit. Namun, semua bibit hasil transformasi AfSSB
ditampilkan lebih lama panjang akar dalam media yang mengandung TNT dan kobalt dibandingkan
dengan bibit WT (Gbr. 1a, b, e, f). Dalam medium yang mengandung 10 mg/kg TNT, panjang akar di
AfSSB1, AfSSB2 dan WT Arabidopsis adalah 0,50, 0,43 dan 0,18 cm masing-masing sedangkan
panjang akar fescue tinggi TF1, TF2 dan WT adalah
0,43, 0,37 dan 0,13 cm masing-masing (Gbr. 1c, g). Dalam medium mengandung 52 mg/kg kobalt,
panjang akar AfSSB1, AfSSB2 dan WT Arabidopsis berturut-turut adalah 0,37, 0,40 dan 0,13 cm
sedangkan panjang akar Tinggi fescue TF1, TF2 dan WT masing-masing adalah 0,47, 0,57 dan 0,13 cm
(Gbr. 1d, h). Hasil ini menunjukkan bahwa ekspresi AfSSB . yang heterogen meningkatkan toleransi
TNT di Arabidopsis dan fescue tinggi.

3.3. Ekspresi heterogen AfSSB meningkatkan fitoremediasi

Tanah yang terkontaminasi TNT dan kobalt Gambar. 2 menunjukkan fitoremediasi TNT dan
kobalt secara terpisah tanah yang terkontaminasi oleh Arabidopsis dan fescue tinggi. Seperti
ditunjukkan pada Gambar. 2a,c, efisiensi penghilangan TNT dari AfSSB Arabidopsis dan fescue tinggi
adalah secara signifikan lebih tinggi dari WT Arabidopsis dan fescue tinggi, masing-masing. nSelama
percobaan 15 hari, konsentrasi TNT adalah dikurangi menjadi 0,39, 0,42, dan 1,23 mg/kg masing-
masing di tanah yang dibudidayakan dengan garis AfSSB1, AfSSB1, dan WT Arabidopsis saat
direduksi menjadi 0,01, 0,02, dan 0,97 mg/kg pada tanah yang dibudidayakan dengan tinggi TF1, TF2
dan WT garis fescue (Gbr. 2a, c).
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2b, d, efisiensi penghilangan kobalt dari bidopsis
AfSSB Ara dan fescue tinggi secara signifikan lebih tinggi daripada WT Arabidopsis dan fescue tinggi,
masing-masing. Sepanjang percobaan 15 hari, konsentrasi kobalt berkurang menjadi 18,22, 16,80,
dan 24,31 mg/kg masing-masing di tanah yang dibudidayakan dengan AfSSB1, AfSSB1, dan WT
Arabidopsis garis, sementara itu dikurangi menjadi 16,27, 15,43, dan 19,70 mg/kg di tanah
dibudidayakan dengan garis fescue tinggi TF1, TF2 dan WT (Gbr. 2b, d). Ini hasil menunjukkan bahwa
ekspresi AfSSB di Arabidopsis dan tall fescue meningkatkan fitoremediasi TNT dan kobalt secara
terpisah tanah yang terkontaminasi.

Gambar 5. Tes kerusakan DNA AfSSB dan WT Arabidopsis yang diobati dengan TNT atau
kobalt selama 24 jam. (A) Gambar komet khas dari WT, dan HT1 Arabidopsis diperlakukan dengan 10
mg/kg TNT atau 52 mg/kg kobalt selama 24 jam, menunjukkan kerusakan DNA. Komet diwarnai
dengan etidium bromida. (B) % kuantifikasi DNA ekor dari genotipe. Tanda bintang menunjukkan
perbedaan yang signifikan secara statistik dari WT, ***P＜0,001.

Gambar 6. Analisis proteom di WT dan AfSSB mengubah Arabidopsis setelah aplikasi TNT
dan kobalt. (A) Analisis pengayaan domain protein dari DEP di Arabidopsis setelah paparan TNT. (B)
Analisis pengayaan domain protein DEP di Arabidopsis setelah paparan kobalt.

3.4. Ekspresi heterogen AfSSB meningkatkan fitoremediasi

TNT dan tanah yang terkontaminasi kobalt Gambar 3 menunjukkan fitoremediasi tanah yang
terkontaminasi TNT dan kobalt oleh Arabidopsis dan fescue tinggi. Sepanjang 15-hari percobaan,
konsentrasi TNT diturunkan menjadi 0,63, 0,66, dan 1,65 mg/kg masing-masing di tanah yang
dibudidayakan dengan AfSSB1, AfSSB 2, dan garis WT Arabidopsis, sementara itu dikurangi menjadi
0,18,0,17 dan 1,51 mg/kg di tanah yang dibudidayakan dengan garis fescue tinggi TF1, TF2 dan WT
(Gbr. 3a, c). Konsentrasi kobalt dikurangi menjadi 20,20, 20,32, dan 24,61 mg/kg masing-masing di
tanah yang dibudidayakan dengan AfSSB1, AfSSB2, dan garis WT Arabidopsis, sementara itu
dikurangi menjadi 17.20, 15.80, dan 19,63 mg/kg di tanah yang dibudidayakan dengan garis fescue
tinggi TF1, TF2 dan WT (Gbr. 3b, d). Hasil ini menunjukkan bahwa ekspresi AfSSB di Arabidopsis dan
fescue tinggi meningkatkan fitoremediasi TNT dan tanah yang terkontaminasi kobalt.

3.5. Metabolisme TNT dan kobalt di Arabidopsis

Untuk memahami mekanisme bagaimana AfSSB meningkatkan mediasi fitor TNT dan kobalt.
Metabolisme TNT dan kobalt dalam dopsis Arab dipilih untuk dipelajari. Seperti yang ditunjukkan
pada Gambar. 4a, TNT konsentrasi dalam bibit AfSSB1, AfSSB2, dan WT Arabidopsis adalah 0,19,
0,24, dan 0,73 g/g. Pada saat yang sama, konsentrasi ADNT dalam Garis AfSSB1, AfSSB2, dan WT
adalah 3,17, 3,00, dan 2,01 g/g (Gbr. 4a) Garis AfSSB secara signifikan mengakumulasi lebih sedikit
TNT dan lebih banyak ADNT daripada Tanaman WT pada akhir percobaan 15 hari. Hasil ini
menyarankan bahwa mengekspresikan AfSSB dalam Arabidopsis meningkatkan biotransformasi TNT.
Selain itu, secara signifikan lebih banyak kobalt terakumulasi di AfSSB mengubah Arabidopsis
daripada Arabidopsis WT pada akhir abad ke-20 percobaan hari. Akumulasi kobalt dalam bibit
AfSSB1, AfSSB2, dan WT Arabidopsis masing-masing adalah 0,68, 0,68, dan 0,39 g/g (Gbr. 4b).
Fenomena ini menunjukkan bahwa mengekspresikan AfSSB dalam dopsis Arab meningkatkan
bioakumulasi kobalt.

3.6. Kerusakan DNA ditentukan oleh uji komet

Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5, uji komet telah menunjukkan bahwa frekuensi
kerusakan DNA berbeda secara signifikan antara WT dan AfSSB Arabidopsis setelah paparan TNT
atau kobalt (Gbr. 5a). Sebagian besar WT menunjukkan fenomena tailing, sedangkan ekor komet di
jalur AfSSB lebih sedikit daripada di WT. Selain itu, persentase DNA ekor dalam sel WT secara
signifikan lebih tinggi dari pada garis AfSSB (Gbr. 5b). Sementara pendahuluan, temuan ini
menunjukkan bahwa tanaman bantuan AfSSB mengurangi kerusakan DNA yang disebabkan oleh TNT
dan kobalt.

3.7. Analisis mekanisme peningkatan AfSSB dalam fitoremediasi TNT

Setelah paparan TNT, 321 diatur ke atas (≥ 1,2 kali lipat, nilai p 0,05) dan 336 protein yang
diekspresikan secara berbeda (DEP) yang diatur ke bawah (≤ 0,83 kali lipat, nilai p 0,05) diidentifikasi.
Untuk domain protein analisis, Q3 (1,2 <Rasio <1,5) DEP yang diatur ke atas sangat diperkaya dalam
Glutathione S-transferases Phi, C-terminal, secretory peroksidase, hem peroksidase. Sementara itu,
DEP yang diatur Q4: (rasio > 1,5) sangat diperkaya dalam protein terkait pathogenesis 1-like (PR-
protein), chitin-binding (tipe 1)(Gbr. 6a). Telah ada melaporkan bahwa toksisitas TNT diinduksi oleh
reaktif superoksida (ROS) (Choudhury et al., 2017; Johnston et al., 2015a, 2015b). ROS enzim
pemulung dalam tanaman mengandung superoksida dismutase (SOD) (Ighodaro dan Akinloye,
2018), peroksidase (POD) (Almagro et al., 2009), glutathione S-transferases (GSTs) (Noctor et al.,
2018), sekretori peroksidase (K´NS an-Toth et al., 2019) dan spesifik phosphatidylinositol fosfolipase
C (PI-PLC) (Abd-el-haliem et al., 2016). Dalam studi ini,
DEP yang mengkode SOD, POD, dan GST diregulasi ke atas di pabrik transformasi AfSSB
setelah paparan TNT (Gbr. 6a). Perubahan iniprotein menunjukkan bahwa AfSSB meningkatkan
pemulungan ROS setelah paparan TNT. Hasil ini menunjukkan bahwa AfSSB meningkatkan resistensi
terhadap TNT toksisitas dengan meningkatkan pemulungan ROS. Pengkodean DEP CYP450 (CYP),
Glutathione S-transferases (GSTs), dan kitinase diregulasi ke atas pada jalur AfSSB (Gbr. 6a). Banyak
studi menunjukkan bahwa Sitokrom P450 (Doty, 2008), glutathione S-trans ferases (Lee et al., 2019),
dan kitinase (Rawat et al., 2017) adalah terlibat dalam metabolisme degradasi xenobiotik pada
tanaman (Doty, 2008). Dia tampaknya mungkin bahwa AfSSB meningkatkan ketahanan toksisitas
TNT dengan meningkatkan detoksifikasi dan sistem pertahanan setelah paparan TNT.

3.8. Analisis mekanisme peningkatan AfSSB dalam fitoremediasi kobalt

Setelah paparan kobalt, 583 up-regulated (≥ 1,2 kali lipat, nilai p 0,05) dan 514 DEP yang
diatur ke bawah (≤ 0,83 kali lipat, nilai p 0,05) adalah diidentifikasi. Untuk analisis domain protein,
DEP yang diatur ke atas adalah sangat diperkaya dalam peroksidase sekretori dan
phosphatidylinositol spesifik phospholipase C (PI-PLC), phytocyanin, pektat lyase, hemperoksidase,
dan peroksidase sekretori (Gbr. 6b). Telah dilaporkan bahwa racun yang disebabkan kobalt diinduksi
oleh superoksida reaktif (Prasad et al.,1999; Schützendübel dan Polle, 2002). Dalam penelitian ini,
DEPs mengkode sistem antioksidan seperti hem peroksidase, secretory peroksidase, dan fosfolipase
C spesifik fosfatidilinositol (PI-PLC) diatur ke atas di pabrik yang diubah AfSSB setelah paparan kobalt
(Gbr. 6b). Perubahan protein ini menunjukkan bahwa AfSSB meningkatkan Pemulungan ROS di
bawah paparan kobalt. Hasil ini menunjukkan bahwa AfSSB meningkatkan ketahanan terhadap
toksisitas kobalt dengan meningkatkan ROS mengais.
Analisis domain protein juga menunjukkan bahwa pectate lyase, Jacalin Like lectins, dan
phytocyanin diregulasi di AfSSB Arabidopsis (Gbr. 6b). Diketahui bahwa pektat liase (Konno et al.,
2010)， Lektin seperti Jacalin (Esch dan Schaffrath, 2017), dan phytocyanin (Ezaki et al., 2005) dapat
membatasi penyerapan logam dan mengurangi logam berat toksisitas. Up-regulasi pektat liase,
lektin seperti Jacalin, dan phytocyanin menunjukkan bahwa AfSSB meningkatkan ketahanan
terhadap toksisitas kobalt dengan meningkatkan detoksifikasi dan sistem pertahanan.

4. Diskusi
Fitoremediasi kontaminan organik dan logam berat merupakan metode yang ramah
lingkungan dan berbiaya rendah (Zhu et al., 2019). Sebagai disebutkan dalam tinjauan literatur,
fitoremediasi yang efektif membutuhkan toleransi tanaman terhadap kontaminan (Robidoux et al.,
2003). Pada saat ini studi, satu temuan menarik adalah bahwa AfSSB meningkatkan toleransi
terhadap TNT dan kobalt di Arabidopsis dan fescue tinggi (Gbr. 1). penting lainnya temuannya adalah
bahwa AfSSB mengubah Arabidopsis dan fescue tinggi meningkatkan fitoremediasi TNT dan kobalt
yang terkontaminasi secara terpisah tanah daripada tanaman WT (Gbr. 2a-e). Untuk pengetahuan
terbaik kami, ini adalah yang pertama laporan yang meningkatkan fitoremediasi TNT dan kobalt
secara terpisah tanah yang terkontaminasi dengan mengekspresikan AfSSB pada tanaman.
Temuan paling penting dalam penelitian ini adalah bahwa AfSSB berubah Arabidopsis dan
fescue tinggi meningkatkan fitoremediasi TNT dan tanah ko-terkontaminasi kobalt (Gbr. 3a-d).
Banyak penelitian telah melaporkan bahwa remediasi kontaminan organik dan tanah yang
terkontaminasi logam berat lebih rumit dan sulit daripada remediasi tunggal kontaminasi karena
cara penyerapan dan transformasi polutan berbeda (Ye et al., 2017). Interaksi antara organic dan
polutan logam berat di dalam tanah membuat proses remediasi lebih rumit (Zhang et al., 2013).
Selanjutnya, persaingan di antara polutan organik dan logam berat ada di situs pengikatan adsorben
dan enzim (Ye et al., 2017). Sepengetahuan kami, pekerjaan ini adalah laporan pertama yang
meningkatkan fitoremediasi TNT dan kobalt tanah yang terkontaminasi bersama dengan
mengekspresikan AfSSB pada tanaman. Kami berharap AfSSBtanaman yang diubah dapat digunakan
dalam percobaan lapangan segera.
Untuk lebih menjelaskan mekanisme bagaimana AfSSB meningkatkan fitoremediasi TNT dan
kobalt, transportasi dan akumulasi polusi ini dianalisis dalam Arabidopsis. Penelitian sebelumnya
telah meetapkan bahwa fitoremediasi kontaminan organik membutuhkan tanaman untuk menyerap
dan biotransformasi kontaminan ini (Odoh et al. 2019). Meskipun TNT sulit terdegradasi dalam
kondisi alami, namun dapatbiotransformasi dan detoksikasi di Arabidopsis: (1) TNT direduksi
menjadi hidroksil-amino (HADNTs) dan kemudian amino-dinitrotoluena (ADNTs) melalui
nitroreduktase endogen (Vila et al., 2007). (2) HADNT dan ADNT terkonjugasi menjadi molekul
hidrofilik dan menghasilkan glikosilasi konjugat (Odoh et al., 2019; Rylott dan Bruce, 2019). Dalam
penelitian ini, kurangTNT dan lebih banyak metabolit TNT (ADNTs) terakumulasi di AfSSB Arabidopsis
daripada di WT (Gbr. 4b, c). Penjelasan yang mungkin mungkin adalah mengekspresikan AfSSB
meningkatkan fitoremediasi TNT dengan meningkatkan
Biotransformasi TNT di Arabidopsis. Pekerjaan baru-baru ini telah menetapkan bahwafitoremediasi
logam berat melibatkan biosorpsi awal logam berat logam ke dalam tanaman diikuti dengan
bioakumulasi (Ashraf et al., 2019). Fitoremediasi yang efektif dari tanah yang terkontaminasi logam
juga membutuhkan: tanaman untuk mengakumulasi logam konsentrasi tinggi (DalCorso et al.,2019).
Dalam penelitian ini, tanaman yang diubah AfSSB terakumulasi lebih kobalt daripada WT (Gbr. 3e).
Hasil ini menunjukkan bahwa mengekspresikan AfSSB meningkatkan fitoremediasi kobalt dengan
meningkatkan kobalt bioakumulasi Telah ditetapkan dengan baik dari berbagai penelitian bahwa
TNT dan kobalt toksisitas disebabkan oleh kerusakan DNA (Hengstler et al., 2003; Homma-Takeda
dkk., 2002; Johnston dkk., 2015a, 2015b).
Terkini
bukti juga menunjukkan bahwa SSB memainkan peran penting dalam mengaktifkan DNA respons
kerusakan (Byrne dan Oakley, 2019). Uji komet menunjukkan bahwa kerusakan DNA yang
disebabkan oleh TNT dan kobalt sedikit di AfSSB Arabidopsis dibandingkan dengan WT (Gbr. 5).
Penjelasan yang mungkin untuk ini hasilnya mungkin AfSSB meningkatkan toleransi terhadap TNT
dan kobalt dengan mengurangi kerusakan DNA. Sampai saat ini, banyak penelitian telah
menunjukkan bahwa beberapa semut pencemar organik dan stres logam berat menyebabkan
peningkatan reaktif yang berlebihan spesies oksigen (ROS) (Emamverdian et al., 2015; Johnston et
al., 2015a, 2015b). ROS dapat mengoksidasi protein, lipid, pigmen, asam nukleat dan menyebabkan
fitotoksisitas. Sebagai tanggapan, tanaman memiliki pertahanan yang canggih jaringan untuk
mengais ROS. Pemulung ROS terdiri dari superoksida dis mutase (SOD), katalase (CAT), peroksidase
(POD) dan glutathione. reduktase (GR), hem peroksidase (Ameen et al., 2019). Banyak diterbitkan
penelitian juga menyarankan bahwa CYP450 (CYP), glutathione S-transferases (GSTs), pectate lyase,
lektin seperti Jacalin, dan phytocyanin memainkan peran penting peran dalam detoksifikasi polutan
(Kushwaha et al., 2016). NS sistem antioksidan dan sistem detoksifikasi dapat meningkatkan
toleransi terhadap polutan di pabrik (Sallah-Ud-Din et al., 2017). Dalam penelitian ini, analisis
proteomik menunjukkan bahwa DEP mengkode sistem antioksidan dan sistem detoksifikasi diatur
dalam AfSSB yang mengubah dopsis Arab setelah paparan TNT dan kobalt (Gbr. 6a,b). Hasil ini
mungkin dijelaskan oleh fakta bahwa sistem dan pertahanan pemulung ROS

Gambar 7. Skema representasi mekanisme AfSSB memberikan kemampuan resistensi terhadap

toksisitas TNT (A) atau kobalt (B) di Arabidopsis. DEP yang diidentifikasi digunakan untuk
membangun representasi skema. sistem memainkan peran penting dalam meningkatkan
fitoremediasi TNT dan kobalt di AfSSB mengubah Arabidopsis. Secara bersama-sama, kami
mengusulkan model skema untuk menggambarkan jaringan regulasi oleh AfSSB (Gbr. 7). Konsep-
konsep yang disediakan dalam penelitian ini membangun dasar yang kuat untuk studi lebih lanjut
tentang aplikasi AfSSB dalam phy toremediasi kontaminan. Kombinasi AfSSB dalam multistep
reaksi kaskade dengan jalur biodegradasi menawarkan alternative rute untuk bioremediasi
kontaminan target di masa depan.

5. Kesimpulan
Singkatnya, penelitian ini menunjukkan bahwa ekspresi AfSSB dapat meningkatkan toleransi
Arabidopsis dan fescue tinggi terhadap TNT dan kobalt. Selain itu, AfSSB mengubah Arabidopsis dan
fescue tinggi menunjukkan peningkatan fitoremediasi TNT dan kobalt secara terpisah tanah yang
terkontaminasi dan tanah yang terkontaminasi bersama daripada WT. Saat ini temuan akan
bermanfaat bagi pencerahan bahwa tanaman transgenic mengekspresikan AfSSB berpotensi dapat
mengobati TNT dan terkontaminasi kobalt lingkungan. Pekerjaan di masa depan akan menentukan
apakah organik dan polutan logam seperti 2,4-DNT, kadmium dapat dihilangkan oleh tanaman yang
ditransformasi AfSSB.

Pernyataan Kepentingan Bersaing

Para penulis menyatakan bahwa mereka tidak mengetahui persaingan keuangan minat atau
hubungan pribadi yang tampaknya dapat mempengaruhi pekerjaan yang dilaporkan dalam makalah
ini. Ucapan Terima Kasih Penelitian ini didukung oleh Key Project Fund dari Shanghai Komite
Pertanian Kota, Cina (chuangzi 2018.1-5); Yayasan Ilmu Pengetahuan Alam Nasional Tiongkok,
Tiongkok (41907097, 31071486, 31200212, 31200075, 31200076, 18ZR1413100); "Pan-Gao" rencana
Akademi Ilmu Pertanian Shanghai, Cina (PG212),Pemimpin Riset Teknologi Akademik Shanghai,
Tiongkok (19XD1432300); Proyek Popularisasi Sains Shanghai, Tiongkok (18dz2300400); Yayasan
Ilmu Pengetahuan Alam Shanghai, Tiongkok (18ZR1413100); Organisme Pertanian Shanghai yang
Dimodifikasi Secara Genetik
Proyek keselamatan, Tiongkok (2019). Para penyandang dana tidak memiliki peran dalam
desain studi, pengumpulan data, dan analisis, keputusan untuk menerbitkan, atau persiapan naskah.

DAFTAR PUSTAKA
Abd-el-haliem, A.M., Vossen, J.H., Zeijl, A., Van, Dezhsetan, S., Testerink, C., Seidl, M.F.,
Beck, M., Strutt, J., Robatzek, S., Joosten, M.H.A.J., 2016. Biokimiakarakterisasi famili
phosphatidylinositol-specific phospholipase C (PI PLC) tomat dan perannya dalam kekebalan
tanaman. Biokim. Biofis. Acta (BBA) - Mol. Sel
Biol. Lipid 1861, 1365-1378. https://doi.org/10.1016/j.bbalip.2016.01.017. Gambar 7. Skema
representasi mekanisme AfSSB memberikan kemampuan resistensi terhadap toksisitas TNT
(A) atau kobalt (B) di Arabidopsis. DEP yang diidentifikasi digunakan untuk
membangun representasi skema.J.-j. Gao dkk. Ekotoksikologi dan Keamanan Lingkungan 220
(2001) 11240710
Almagro, L., Gomez Ros, L.V., Belchi-Navarro, S., Bru, R., Ros Barcelo, A., Pedreno, M.A., 2009.
Peroksidase kelas III dalam reaksi pertahanan tanaman. J. Eks. Bot. 60, 377–390.
https://doi.org/10.1093/jxb/ern277.
Ameen, N., Amjad, M., Murtaza, B., Abbas, G., Shahid, M., Imran, M., Naeem, M.A.,
Niazi, N.K., 2019. Perilaku biogeokimia nikel di bawah tekanan abiotik yang berbeda:
mekanisme toksisitas dan detoksifikasi pada tanaman. Mengepung. Sci. polusi. Res. 26,
10496–10514. https://doi.org/10.1007/s11356-019-04540-4.
Arslan, M., Imran, A., Khan, Q.M., Afzal, M., 2017. Kemitraan tanaman-bakteri untuk
remediasi polutan organik persisten. Mengepung. Sci. polusi. Res. 24, 4322–4336.
https://doi.org/10.1007/s11356-015-4935-3.
Ashraf, Sana, Ali, Q., Zahir, Z.A., Ashraf, Sobia, Asghar, H.N., 2019. Fitoremediasi:cara yang ramah
lingkungan untuk reklamasi tanah tercemar logam berat. ekotoksikol. Mengepung. Saf.
174,714–727. https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2019.02.068.
Ashton, N.W., Bolderson, E., Cubeddu, L., O'Byrne, K.J., Richard, D.J., 2013. Manusia
protein pengikat DNA untai tunggal sangat penting untuk mempertahankan
stabilitas. BMC Mol. Biol. 14, 1–20. https://doi.org/10.1186/1471-2199-14-9.
Banza, C., Nkulu, L., Casas, L., Haufroid, V., Putter, T. De, 2019. Pendana PMC Eropa
Kelompok Keberlanjutan pertambangan rakyat kobalt di DR Kongo 1, 495–504. https://
doi.org/10.1038/s41893-018-0139-4.Keberlanjutan.
Blazek, V., Zavada, J., Kucerova, R., Nadkanska, H., 2018. Penerapan
Acidithiobacillus ferrooxidans untuk memulihkan logam dari debu limbah elektronik.
Fisikokimia. Masalah Buruh tambang. Proses. 54, 249–257. https://doi.org/10.5277/
ppmp1807.
Boyd, R.S., 2010. Polutan logam berat dan ekologi kimia: menjelajahi perbatasan baru.
J. Kimia. Ekol. 36, 46–58. https://doi.org/10.1007/s10886-009-9730-5.
Byrne, B.M., Oakley, G.G., 2019. Protein replikasi A, pencahar yang menyimpan DNA
reguler: pentingnya fosforilasi RPA dalam menjaga stabilitas genom.
mani. Pengembang Sel. Biol. 86, 112-120. https://doi.org/10.1016/j.semcdb.2018.04.005.
Carvalho, M.S., Fraga, I.C.S., Neto, KCM, Silva Filho, E.Q., 1996. Selektif
penentuan kobalt menggunakan busa poliuretan dan 2-(2-benzothiazolylazo)-2-p kresol
sebagai reagen spektrofotometri. Talanta 43, 1675–1680. https://doi.org/
10.1016/0039-9140(96)01931-5.
Chen, R., Subramanyam, S., Elcock, A.H., Spies, M., Wold, M.S., 2016. Pengikatan dinamis
replikasi protein a diperlukan untuk perbaikan DNA. Asam Nukleat Res. 44,
5758–5772. https://doi.org/10.1093/nar/gkw339.
Chica, R.A., Doucet, N., Pelletier, J.N., 2005. Pendekatan semi-rasional untuk rekayasa
aktivitas enzim: menggabungkan manfaat dari evolusi terarah dan desain rasional.
Curr. pendapat. Bioteknologi. 16, 378–384. https://doi.org/10.1016/j.
copbio.2005.06.004.
Choudhury, F.K., Rivero, R.M., Blumwald, E., Mittler, R., 2017. Spesies oksigen reaktif,
stres abiotik dan kombinasi stres. Tanaman J. 90, 856–867. https://doi.org/
10.1111/tpj.13299.
Claudio, A. Navarro, von B, D., C.A.J, 2013. Strategi ketahanan logam berat dari
bakteri asidofilik dan mereka. Biol. Res. 46, 363–371.