Konsekuensi Dari Teknik Pemuliaan Tanaman Berbasis M

Konsekuensi dari Teknik Pemuliaan Tanaman Berbasis Modifikasi Genetik Baru
Dibandingkan dengan Pemuliaan Tanaman Konvensional
Laporan ini menjelaskan konsekuensi dari teknik pemuliaan tanaman baru untuk
lingkungan dan keamanan pangan dan pakan. Teknik pemuliaan tanaman baru yang
dipertimbangkan dalam laporan ini memiliki kesamaan fitur yang semuanya menggunakan
langkah modifikasi genetik, di suatu tempat dalam produksi galur tanaman yang ditingkatkan.
Tujuan dari modifikasi genetik ini adalah untuk menguji tanaman untuk karakteristik tertentu,
untuk memfasilitasi pemuliaan, untuk menambahkan gen atau alel yang telah diisolasi dari
spesies yang sama atau untuk membuat perubahan kecil pada gen asli. Karena keterlibatan
langkah modifikasi genetik, semua teknik ini termasuk dalam European Directive 2001/18/EC.
Salah satu ciri umum dari teknik pemuliaan tanaman baru adalah bahwa semuanya mengarah
pada produk akhir (tanaman atau bagian tanaman) yang bebas dari gen yang asing bagi spesies
tersebut. Jadi, pada akhirnya hanya gen yang sudah menjadi bagian dari kumpulan gen spesies
yang akan hadir dalam genomnya. Ini berarti bahwa produk akhir dari teknik pemuliaan baru,
pada prinsipnya juga dapat dicapai dengan menggunakan teknik pemuliaan tanaman
konvensional, tetapi biasanya dalam jangka waktu yang lebih lama atau dengan lebih banyak
kesulitan.
Di Eropa, budidaya, perdagangan dan penggunaan makanan dan pakan dari setiap
tanaman yang dimodifikasi secara genetik tunduk pada peraturan Uni Eropa. Penilaian keamanan
tanaman rekayasa genetika adalah bagian dari prosedur penerimaan. Penilaian untuk keamanan
lingkungan, makanan dan pakan ini memakan waktu dan biaya (rata-rata €6,8 juta untuk
prosedur penilaian penuh (UE)). Meskipun teknik pemuliaan baru memiliki potensi besar untuk
perbaikan spesies tanaman secara cepat, penilaian keamanan yang diperlukan dapat menghambat
pengembangan tanaman baru tersebut. Hal ini terutama terjadi pada tanaman 'kecil' atau 'yatim
piatu' seperti banyak tanaman sayuran, buah-buahan dan tanaman hias.
Untuk dapat mempraktikkan teknik pemuliaan baru, ada permintaan besar untuk
modernisasi peraturan UE untuk organisme hasil rekayasa genetika. Laporan ini menjelaskan
pendekatan teknis-ilmiah untuk menilai kemungkinan konsekuensi dari teknik pemuliaan baru
bagi lingkungan dan kesehatan manusia & hewan, dan memberikan informasi yang penting
untuk pertimbangan adaptasi peraturan UE. Untuk pembahasan konsekuensi ini, teknik
pemuliaan baru dibandingkan dengan dasar. Baseline adalah acuan, misalnya tanaman sejenis,
tetapi dikembangbiakkan menurut teknik pemuliaan konvensional. Garis dasar mencakup situasi
'alami' dalam bandwidth penuhnya. Dalam kebanyakan situasi, dasar kasus khusus harus
ditentukan dan dalam diskusi tentang konsekuensi dari teknik pemuliaan baru yang berbeda,
saran diajukan untuk referensi yang dapat berfungsi sebagai dasar.
Dalam laporan ini, konsekuensi dari empat kelas yang berbeda dari teknik pemuliaan
tanaman baru dibahas. Untuk setiap kelas, pilihan teknik dibahas secara rinci karena potensi
penerapannya dalam waktu dekat. Selain masalah teknis khusus yang terkait dengan berbagai
kelas teknik yang dijelaskan di bawah ini, jelas bahwa tindakan pencegahan atau tindakan
umum, untuk membuktikan bahwa suatu produk bebas dari sekuens transgen, harus dilakukan
untuk tanaman atau produk tanaman yang merupakan hasil dari novel ini. teknik. Hal ini dapat
memerlukan melakukan tes PCR, analisis protein atau tes lain yang mampu membuktikan bahwa
sekuens transgen, Agrobacterium dan DNA kromosom Agrobacterium dan sekuens virus (dalam
hal teknik terkait VIGS) tidak ada, pada tanaman atau produk tanaman ketika tanaman atau
produk tanaman telah terkena Agrobacterium atau urutan virus.
Kelas pertama memerlukan teknik yang berbeda di mana modifikasi genetik digunakan
sebagai alat untuk memfasilitasi pemuliaan. Dalam teknik ini, galur tanaman yang dimodifikasi
secara genetik (sebagian) dibuat dan galur tanaman ini selanjutnya digunakan untuk membuat
turunan yang pada akhirnya benar-benar bebas dari materi genetik yang digunakan dalam
modifikasi genetik awal. Untuk kelas ini, empat teknik berbeda dijelaskan: agroinfiltrasi,
pembungkaman gen yang diinduksi virus (VIGS), pemuliaan terbalik dan pemuliaan dipercepat
setelah induksi pembungaan awal. Agroinfiltrasi adalah teknik menggunakan Agrobacterium
sebagai alat untuk mencapai ekspresi sementara dan lokal gen yang asing bagi spesies dalam
suatu tanaman. Teknik ini diterapkan untuk menguji reaksi tanaman target terhadap protein
transgenik, atau untuk analisis gen fungsional pada tanaman. Stek atau biji tanaman terpilih yang
Agrobacteriumbebasdapat digunakan untuk pengembangan tanaman lebih lanjut.
VIGS (Virus Induced Gene Silencing) adalah teknik yang digunakan untuk (sementara)
membungkam ekspresi gen endogen spesifik pada tanaman. VIGS terutama digunakan untuk
analisis fungsional gen. Vektor DNA VIGS biasanya dimasukkan ke dalam tanaman
menggunakan Agrobacterium atau virus tanaman tertentu. Pemuliaan terbalik adalah teknik
pemuliaan baru yang memanfaatkan modifikasi genetik untuk memfasilitasi pemuliaan hibrida
F1 dengan menekan rekombinasi meiosis. Pada tahap pemuliaan terakhir, gen yang digunakan
untuk modifikasi genetik dicoret, menghasilkan produk akhir yang bebas dari sekuens DNA
terkait modifikasi genetik. Pemuliaan dipercepat adalah teknik pemuliaan baru yang
memanfaatkan modifikasi genetik untuk mempercepat pemuliaan dengan induksi pembungaan
awal. Pada tahap pemuliaan terakhir, gen yang digunakan untuk modifikasi genetik dicoret,
menghasilkan produk akhir yang bebas dari sekuens DNA terkait modifikasi genetik.
Keempat teknik ini menghasilkan produk akhir yang benar-benar bebas dari DNA apa
pun yang terkait dengan modifikasi genetik. Setelah agroinfiltrasi dan VIGS, tanaman dipulihkan
dari jaringan tanaman yang dimodifikasi secara genetik sebagian, yang tidak dimodifikasi secara
genetik. Dalam pemuliaan terbalik dan pemuliaan dipercepat, urutan DNA asing secara genetik
dicoret. Tidak adanya sekuens DNA apa pun yang terkait dengan modifikasi genetik juga
menimbulkan kesulitan ekstrem jika bukan ketidakmampuan untuk menunjukkan produk akhir
dari kelas ini sebagai turunan dari nenek moyang yang dimodifikasi secara genetik. Untuk
keempat teknik di kelas pertama ini disimpulkan bahwa secara umum konsekuensi terhadap
lingkungan dan keamanan pangan dan pakan tidak berbeda dengan baseline. Sebagai baseline
dapat digunakan tanaman asli yang diuji dengan agroinfiltrasi atau VIGS. Dalam hal pemuliaan
terbalik dan pemuliaan dipercepat, tanaman yang diperoleh melalui pemuliaan konvensional
adalah referensi yang baik.
Tanaman dan produk dari kelas pertama ini tidak mengandung materi genetik apa pun
yang digunakan untuk modifikasi genetik awal. Oleh karena itu, tanaman dan produk yang
diperoleh melalui teknik pemuliaan tanaman baru kelas satu ini serupa dengan baseline, yaitu
tanaman yang dibiakkan secara tradisional, dan akibatnya bagi lingkungan dan keamanan pangan
dan pakan tidak berbeda dari tanaman yang dibiakkan secara tradisional. . Fakta bahwa tanaman
yang diperoleh setelah seleksi menggunakan agroinfiltrasi atau VIGS, atau dengan bantuan
pemuliaan terbalik atau pembungaan dipercepat sama amannya dengan tanaman yang dibiakkan
secara tradisional, membenarkan pengecualian tanaman ini dari peraturan Eropa untuk
organisme hasil rekayasa genetika. Bukti umum bahwa tanaman atau produk bebas
Agrobacterium, bebas virus dan bebas transgen harus disampaikan dengan menggunakan teknik
dan/atau metode standar yang diterima.
Kelas kedua mencakup tanaman yang diperoleh dengan menggabungkan tanaman yang
dimodifikasi secara genetik dan tanaman yang tidak dimodifikasi secara genetik dengan okulasi.
Dari tanaman chimeric ini hanya bagian yang tidak dimodifikasi secara genetik yang digunakan
untuk memanen makanan, pakan atau produk hias. Penyambungan yang paling jelas melibatkan
pencangkokan batang atas yang tidak dimodifikasi secara genetik pada batang bawah yang
dimodifikasi secara genetik. Dalam seperti itu cangkok, produk (seperti buah atau bunga)
diproduksi pada tanaman yang tidak dimodifikasi secara genetik yang ditanam pada batang
bawah yang dimodifikasi secara genetik. Gabungan tanaman rekayasa genetika-non rekayasa
genetika biasanya memiliki karakteristik budidaya yang lebih baik.
Produk akhir yang dipanen dari batang atas yang tidak dimodifikasi secara genetik benar-
benar bebas dari DNA apa pun yang terkait dengan modifikasi genetik batang bawah. Namun,
tergantung pada sifat modifikasi genetik batang bawah, modifikasi genetik terkait molekul RNA,
protein atau metabolit lain dapat ditransmisikan dari batang bawah ke batang atas. Karena setiap
modifikasi genetik akan memiliki efek spesifik pada produk akhir, tidak ada kesimpulan umum
yang dapat ditarik mengenai konsekuensi terhadap lingkungan dan keamanan pangan dan pakan.
Oleh karena itu untuk teknik ini diperlukan evaluasi kasus per kasus untuk membandingkan
konsekuensi dengan baseline. Sebagai dasar, batang atas yang sama dicangkokkan secara non-
genetik batang bawah yang dimodifikasi dapat menjadi referensi. Cangkok interspesifik mungkin
merupakan referensi dasar yang informatif untuk menampilkan bandwidth penuh dari
konsekuensi pencangkokan sebagai teknik itu sendiri.
Meskipun di kelas kedua ini, produk dari bagian tanaman cangkok yang tidak
dimodifikasi secara genetik tidak mengandung materi genetik apa pun yang digunakan untuk
modifikasi genetik awal, molekul RNA, protein, dan metabolit yang terkait dengan genetik
modifikasi mungkin ada. Oleh karena itu, tanaman dan produk yang diperoleh dalam kelas ini
mungkin berbeda dari baseline, dan tidak ada kesimpulan umum sehubungan dengan
konsekuensi terhadap lingkungan dan keamanan pangan dan pakan yang dapat dibuat. Bukti
umum bahwa tanaman atau produk bebas Agrobacterium, bebas virus dan bebas transgen harus
disampaikan dengan menggunakan teknik dan/atau metode standar yang diterima.
Kelas ketiga teknik pemuliaan tanaman baru menggunakan modifikasi genetik sebagai
alat langsung untuk memperkenalkan karakteristik baru, tetapi dalam plasma nutfah yang terjadi,
pada tanaman. Materi genetik yang digunakan untuk modifikasi berasal dari spesies yang sama
atau kompatibel secara seksual. Dua pendekatan yang berbeda, cisgenesis dan intragenesis
dibahas.
Cisgenesis adalah produksi tanaman yang dimodifikasi secara genetik menggunakan
DNA donor dari spesies itu sendiri atau dari spesies yang kompatibel secara silang. DNA yang
baru diperkenalkan adalah fragmen genom alami yang tidak berubah yang mengandung gen yang
diinginkan bersama dengan intronnya sendiri dan sekuens pengatur, seperti sekuens DNA
promotor gen dan terminator gen. DNA yang diperkenalkan pada prinsipnya bebas dari DNA
vektor, namun pengecualian adalah urutan perbatasan T-DNA yang mengapit urutan DNA
cisgenik. Urutan pendek ini pada dasarnya non-coding dan tidak mungkin memiliki efek
fenotipik.
Intragenesis adalah produksi tanaman yang dimodifikasi secara genetik menggunakan
DNA donor dari spesies itu sendiri atau dari spesies yang kompatibel secara silang. Perbedaan
dengan cisgenesis adalah bahwa intragenesis memungkinkan terciptanya kombinasi baru
fragmen DNA yang semuanya berasal dari spesies itu sendiri atau dari spesies yang kompatibel
secara silang. Dalam intragenesis juga vektor transformasi itu sendiri dapat terdiri dari fragmen
DNA fungsional dari genom spesies tanaman target. Baik cisgenesis dan intragenesis
menghasilkan produk akhir yang mengandung sekuens DNA yang dimodifikasi secara genetik.
Namun, kecuali untuk urutan perbatasan T-DNA pendek yang ditransfer bersama dengan cis-
atau intragen, DNA yang digunakan untuk modifikasi semuanya berasal dari spesies itu sendiri
atau dari spesies yang kompatibel secara silang. Meskipun integrasi cisgene kemungkinan besar
akan terjadi pada posisi yang berbeda dalam genom, ini biasanya tidak berarti bahwa ada
perbedaan yang melekat dalam hal tingkat dan waktu ekspresi. Jadi cisgenesis hampir selalu
mengarah pada fenotipe yang juga dapat dicapai dengan pemuliaan konvensional.
Karena dalam intragenesis kombinasi baru dari sekuens pengatur dan pengkodean dapat
dibuat, ekspresi intragen diharapkan tidak selalu sesuai dengan ekspresi gen asli yang sesuai
dalam posisi genom alami mereka. Tergantung pada sifat intragen, ini mungkin memiliki
konsekuensi yang berbeda bagi lingkungan dan keamanan pangan dan pakan, jika dibandingkan
dengan baseline. Jika intragenesis secara khusus ditujukan untuk membungkam satu gen
endogen, tanaman intragenik mungkin sebanding dengan tanaman dengan mutasi knock-out
yang diperoleh dengan pemuliaan mutasi. Tanaman seperti itu dapat digunakan sebagai dasar.
Secara umum, konsekuensi intragenesis yang ditujukan pada pembungkaman gen dari satu gen
akan serupa dengan konsekuensi pemuliaan mutasi.
Tumbuhan dari kelas ketiga ini mengandung sekuens DNA yang telah diperkenalkan
melalui langkah modifikasi genetik. Gen yang diintroduksi berasal dari spesies itu sendiri atau
dari spesies yang kompatibel secara silang. Dalam hal integrasi terbukti berada di luar gen dari
genom penerima dan gen yang diperkenalkan menunjukkan ekspresi yang sesuai dengan
baseline, tanaman cisgenik dan intragenik tersebut dianggap mirip dengan baseline, juga dalam
hal keamanan lingkungan dan makanan dan pakan. keamanan. Jika juga terbukti bahwa produk
akhir bebas dari agrobakteri dan sekuens yang asing bagi spesies, ini membenarkan pengecualian
tanaman cisgenik dan intragenik tersebut dari peraturan Eropa untuk organisme hasil rekayasa
genetika. Namun secara umum, intragenesis ditujukan pada ekspresi gen yang berbeda. Jika
untuk intragenesis, promotor alternatif digunakan untuk mengubah ekspresi intragen, ekspresi
intragen dapat menyimpang dari ekspresi dasar. Dalam kasus seperti itu studi tambahan
diperlukan untuk menilai lingkungan dan keamanan pangan dan pakan.
Kelas keempat teknik pemuliaan baru yang dibahas dalam laporan ini menyangkut teknik
di mana modifikasi genetik digunakan sebagai alat untuk membuat mutasi tertentu. Teknik-
teknik ini memperkenalkan mutasi yang diarahkan ke lokasi ke gen asli, yang mengarah ke
knock-out ekspresi gen atau perubahan pola ekspresi gen atau sifat produk gen. Salah satu
metode tersebut melibatkan induksi mutasi yang dimediasi oligonukleotida. Induksi mutasi yang
dimediasi oligonukleotida adalah pendekatan yang menjanjikan untuk melumpuhkan atau
mengadaptasi fungsi gen pada tanaman. Metode ini bertujuan untuk mutasi yang tepat dan
spesifik dari sekuens gen endogen tanpa integrasi DNA asing ke dalam genom tanaman.
Sejauh ini, induksi mutasi yang dimediasi oligonukleotida hanya dijelaskan untuk mutasi
yang mengarah pada substitusi asam amino ke dalam gen asetolaktat sintase (als), menghasilkan
fenotipe yang resisten terhadap herbisida. Mutan yang diperoleh dengan teknik yang dijelaskan
pada prinsipnya juga dapat diperoleh melalui pemuliaan mutasi (menggunakan radiasi pengion
atau mutagen kimia), yang memiliki sejarah panjang penerapannya dalam pemuliaan tanaman
dan dikecualikan dari peraturan UE untuk organisme hasil rekayasa genetika. Oleh karena itu,
produk akhir dari tanaman yang dihasilkan oleh induksi mutasi yang dimediasi oligonukleotida
mirip dengan tanaman yang diperoleh melalui pemuliaan mutasi, yang merupakan dasar yang
baik. Konsekuensi terhadap lingkungan dan keamanan pangan dan pakan serupa dengan yang
terjadi pada baseline. Ini dapat membenarkan pengecualian tanaman yang diperoleh melalui
induksi mutasi yang dimediasi oligonukleotida dari peraturan UE untuk organisme yang
dimodifikasi secara genetik.
Tanaman dan produk dari kelas terakhir teknik pemuliaan tanaman baru ini tidak
mengandung materi genetik apa pun yang digunakan untuk modifikasi genetik awal. Modifikasi
genetik digunakan sebagai alat untuk memperkenalkan mutasi tertentu. Tanaman dan produk
yang diperoleh melalui kelas teknik pemuliaan tanaman baru ini serupa dengan tanaman yang
diperoleh dengan pemuliaan mutasi tradisional, yang digunakan sebagai acuan dasar, dan
akibatnya bagi lingkungan dan keamanan pangan dan pakan tidak berbeda dari tanaman yang
bermutasi secara tradisional. Fakta bahwa tanaman dari kelas ini sama amannya dengan tanaman
yang dibiakkan secara tradisional, membenarkan pengecualian tanaman ini dari peraturan Eropa
untuk organisme hasil rekayasa genetika.
Pendahuluan
Dalam dekade terakhir beberapa teknik pemuliaan tanaman baru telah diusulkan dan
dikembangkan. Teknik-teknik ini menyerupai, berasal dari, atau secara tidak langsung
menggunakan teknik modifikasi genetik. Teknik pemuliaan baru yang dipertimbangkan dalam
laporan ini memiliki kesamaan fitur yang dalam produk akhir (tanaman atau bagian tanaman)
tidak ada gen yang asing bagi spesies tersebut. Penerapan teknik-teknik baru ini menghasilkan
fenotipe tanaman yang juga dapat diperoleh melalui pemuliaan konvensional atau pemuliaan
mutasi, tetapi seringkali dalam jangka waktu yang lebih lama. Di bawah kondisi saat ini, teknik-
teknik baru ini termasuk dalam European Directive 2001/18/EC. Arahan ini menganggap semua
organisme yang dihasilkan menggunakan modifikasi genetik di suatu tempat selama
perkembangannya sebagai organisme yang dimodifikasi secara genetik. Hal ini menyebabkan
bahwa jika dalam organisme seperti itu semua urutan DNA yang terkait dengan modifikasi
genetik dihilangkan, organisme ini, dan juga keturunannya, akan dianggap sebagai organisme
yang dimodifikasi secara genetik.
Di Eropa, budidaya, perdagangan dan penggunaan makanan dan pakan dari setiap
tanaman rekayasa genetika tunduk pada peraturan Uni Eropa dan penilaian keamanan dari
tanaman rekayasa genetika adalah bagian dari prosedur penerimaan. Penilaian untuk keamanan
lingkungan, makanan dan pakan memakan waktu dan mahal (rata-rata €6,8 juta untuk prosedur
penilaian penuh (EU)). Dengan munculnya teknik pemuliaan baru yang membuat penilaian yang
diterima saat ini untuk menentukan apakah tanaman atau produk tanaman adalah transgenik
sangat sulit jika bukan tidak mungkin, pembaruan Arahan Eropa 2001/18/EC diperlukan jika
teknik ini akan dibawa ke dalam praktek. Laporan ini menjelaskan sejumlah perkembangan atau
teknik baru ini dan mencoba menghasilkan pendekatan teknis-ilmiah untuk menilai kemungkinan
konsekuensi dari teknik pemuliaan baru bagi lingkungan dan kesehatan manusia & hewan.
Selanjutnya memberikan pernyataan dengan beberapa teknik pemuliaan baru apakah mereka
dapat dibebaskan atau tidak dari European Directive 2001/18/EC. Aspek etika dan sosial dari
teknik baru tidak dipertimbangkan.
Pemuliaan tanaman klasik dan modern
Domestikasi tanaman adalah proses yang sangat tua. Pemulia terus meningkatkan
varietas yang ada dengan menyilangkan kombinasi varietas tanaman yang mengarah ke varietas
yang lebih terdomestikasi. Untuk pemuliaan tanaman yang lebih baik, pemulia pada prinsipnya
memiliki kumpulan gen lengkap dari spesies tertentu (yaitu semua variasi gen yang ada dalam
suatu spesies) yang mereka miliki. Untuk memperbesar kumpulan gen suatu tanaman, pemulia
memanfaatkan variasi genetik yang ada pada spesies lain yang berkerabat dekat. Ini sering
merupakan spesies liar yang mungkin misalnya menjadi sumber baru gen resistensi. Banyak
tanaman yang ada, seperti banyak Brassica jenisdan gandum merupakan hasil persilangan antar
spesies yang berbeda (pemuliaan antar spesies). Kemungkinan dan keberhasilan pemuliaan
antar-spesifik (atau hibridisasi) namun dapat dibatasi oleh hambatan persilangan alami.
Teknologi yang lebih maju seperti penyelamatan embrio, poliploidisasi, dan hibridisasi
somatik (fusi sel) dapat memindahkan hambatan ini lebih jauh ke luar. Teknologi ini
memanfaatkan keterampilan yang dikembangkan di laboratorium kultur jaringan dan dapat
menghasilkan hibrida baru yang tidak akan dihasilkan tanpa teknik ini. Hibrida baru sering
menemukan aplikasi mereka sebagai induk dalam program pemuliaan. Mengenai teknik baru ini,
European Directive 2001/18/EC hanya berlaku untuk hibridisasi somatik; namun, produk yang
diperoleh dengan hibridisasi somatik dari spesies yang dapat disilangkan dikecualikan dari
arahan ini. Pengecualian ini dimotivasi oleh fakta bahwa tanaman yang diperoleh dengan
hibridisasi somatik dari spesies yang kompatibel silang pada prinsipnya juga dapat diperoleh
dengan menggunakan teknik pemuliaan konvensional.
Teknik pemuliaan modern lainnya adalah pemuliaan mutasi. Terjadinya mutasi genetik
merupakan fenomena biologis alami yang menciptakan variasi genetik baru. Proses penciptaan
variasi genetik baru ini dapat dipercepat dengan menginduksi mutasi secara artifisial,
menggunakan radiasi pengion atau mutagen kimia yang menghasilkan sejumlah besar mutasi di
seluruh genom. Pemilihan selanjutnya dari tanaman mutan yang menguntungkan dan
memperkenalkannya dalam program pemuliaan telah menghasilkan banyak tanaman pangan
yang ada di pasaran saat ini. Pangkalan Pangan dan Pertanian Organisasi Perserikatan Bangsa-
Bangsa/Basis Data Kultivar Mutant Badan Energi Atom Internasional (FAO/IAEA, 2001;
Maluszynski, 2001) mencantumkan lebih dari 2.200 varietas dari berbagai spesies di seluruh
dunia yang telah dikembangkan menggunakan agen mutagenesis terinduksi, termasuk iradiasi
pengion dan etil metana sulfonat (lihat juga Ahloowalia et al., 2004). Meskipun tanaman yang
diperoleh dengan menggunakan teknik pemuliaan mutasi merupakan bagian dari European
Directive 2001/18/EC, mereka dikecualikan dari arahan ini karena sejarah panjang penggunaan
yang aman. Baru-baru ini, pemuliaan mutasi menarik perhatian baru karena perkembangan
teknik biologi molekuler yang disebut 'tilling' yang memungkinkan identifikasi cepat mutasi
pada gen yang diinginkan (Comai dan Henikoff, 2006), sehingga memberikan aplikasi
pemuliaan mutasi yang lebih terfokus. Sejak sekitar dua puluh tahun modifikasi genetik telah
dinamai dan digunakan sebagai alat dengan potensi tinggi untuk memperbaiki tanaman. Pada
prinsipnya, modifikasi genetik memungkinkan pengenalan informasi genetik baru ke dalam
genom suatu organisme. Dalam prakteknya, modifikasi genetik tanaman tidak selalu mudah
untuk dicapai dan tingkat keberhasilan berbeda dari satu spesies ke spesies lainnya. Namun
demikian, untuk banyak metode transformasi tanaman penting telah dikembangkan, banyak galur
yang ditingkatkan secara genetik telah diproduksi dan beberapa tanaman transgenik telah
dikomersialkan dan ditanam dalam skala dunia (ISAAA, 2008).
Metodologi modifikasi genetik
Untuk modifikasi genetik tanaman beberapa metode telah dikembangkan. Teknik transfer
gen langsung (DGT) di mana DNA 'telanjang' dimasukkan ke dalam sel tanaman adalah yang
pertama digunakan. Diantaranya transfer DNA ke protoplas dengan menggunakan arus
listrik (elektroporasi) atau bahan kimia (Poly Ethylene Glycol) atau transfer DNA ke berbagai
jenis jaringan menggunakan balistik. Dalam teknik terakhir ini (juga disebut pemboman
partikel), proyektil mikro yang dilapisi dengan DNA dikirim ke sel tanaman. DNA yang
dilepaskan akan berintegrasi ke dalam genom sel tanaman dan seleksi selanjutnya dari sel-sel
yang dimodifikasi secara genetik dan regenerasi tanaman dari sel-sel ini akan menghasilkan garis
tanaman yang dimodifikasi secara genetik. Dari semua teknik DJP ini, hanya pemboman partikel
yang digunakan secara ekstensif dan berhasil. Teknik DJP lainnya lebih banyak digunakan untuk
kepentingan penelitian. Pengeboman partikel adalah metode yang kuat dan relatif efisien dan
terutama diterapkan untuk transformasi monokotil seperti gandum, beras dan jagung.
Menggunakan pemboman partikel, situs dan pola integrasi DNA seringkali rumit yang
membuat teknik ini kurang menguntungkan untuk transformasi tanaman (komersial). Teknik
modifikasi (atau transformasi) genetik yang paling umum digunakan memanfaatkan vektor-DNA
alami Agrobacterium. Anggota genus bakteri ini mampu memperkenalkan DNA baru ke dalam
genom tanaman. DNA yang ditransfer ke tanaman adalah bagian dari apa yang disebut plasmid
DNA yang ada dalam Agrobacterium sel. Plasmid DNA ini dapat dimodifikasi di laboratorium
molekuler (DNA) dan diperkenalkan kembali pada bakteri menggunakan teknik biologi
molekuler standar. Dengan menggunakan teknik ini, plasmid transformasi tanaman yang
dioptimalkan (juga disebut vektor biner) telah dikembangkan untuk pengenalan gen yang
diinginkan ke dalam genom tanaman. Bagian dari plasmid DNA yang ditransfer ke genom
tanaman (dan mengandung gen yang diinginkan) disebut transfer-DNA (T-DNA) dan dibatasi
oleh 25 pasangan basa spesifik panjang kiri dan kanan perbatasan T-DNA urutan (LB dan RB
resp.). Setelah integrasi, RB parsial (biasanya 3 pasangan basa) dan LB (dalam teori 21-22
pasangan basa) biasanya ada dalam genom dan akan menentukan T-DNA yang terintegrasi
secara stabil dalam genom tanaman. Seringkali, transfer DNA tambahan yang tidak disengaja
dari plasmid transformasi tanaman (tulang punggung vektor) ke genom tanaman telah diamati.
Baru-baru ini juga transfersesekali Agrobacterium DNA kromosomtelah dilaporkan (Ülker et al.,
2008).
Karena proses transformasi genetik tanaman adalah proses yang agak tidak efisien,
metode seleksi digunakan untuk menyaring peristiwa transformasi yang berhasil. Paling sering
untuk gen penanda yang dapat dipilih ini, seperti gen resistensi antibiotik dan gen toleransi
herbisida, digunakan dan diperkenalkan dalam genom tanaman bersama dengan gen yang
diinginkan. Meskipun beberapa gen penanda yang dapat dipilih, seperti gen resistensi kanamisin
nptII, dianggap aman, gen penanda mungkin tidak diinginkan pada galur tanaman rekayasa
genetika akhir. Ada beberapa cara untuk mendapatkan tanaman rekayasa genetika yang tidak
mengandung gen penanda yang dapat dipilih (untuk gambaran metode lihat: Puchta, 2003). Salah
satu pendekatan adalah menghilangkan penanda diduga dengan memisahkannya dengan
menyilangkan secara seksual. Untuk tanaman yang diperbanyak secara vegetatif atau yang
memiliki siklus reproduksi yang panjang (seperti kentang dan banyak tanaman buah-buahan),
persilangan seksual bukanlah metode pilihan untuk menghilangkan gen penanda yang dapat
dipilih. Untuk metode eliminasi penanda tanaman ini memiliki telah dikembangkan
menggunakan rekombinasi spesifik lokasi. Jika efisiensi transformasi cukup tinggi, seseorang
juga dapat melakukan transformasi tanaman tanpa menggunakan gen penanda yang dapat dipilih.
Dalam sistem seperti itu, tanaman hasil rekayasa genetika akan dipilih dari semua tanaman yang
telah diregenerasi dari Agrobacteriumbahan tanaman transformasi yang dimediasimenggunakan
teknik biologi molekuler (PCR). Baru-baru ini, dalam beberapa laporan telah dibuktikan
keberhasilan seleksi tanaman rekayasa genetika tanpa menggunakan gen penanda yang dapat
dipilih (de Vetten et al., 2003; Doshi et al., 2007; Jia et al., 2007; Malnoy et al., 2007).
Teknik pemuliaan tanaman Baru

Teknik pemuliaan tanaman baru yang dibahas dalam laporan ini memiliki ciri umum
karena semuanya menggunakan langkah modifikasi genetik (dalam banyak kasus menggunakan
Agrobacterium sebagai vektor pilihan) dalam produksi produk akhir. Untuk alasan ini, semua
teknik ini termasuk dalam European Directive 2001/18/EC. Enam kelas yang berbeda dari
teknik pemuliaan baru dan teknik yang menyertainya tercantum dalam Tabel 1. Teknik yang
ditandai dengan huruf tebal dijelaskan dalam laporan ini dan untuk teknik ini kemungkinan
konsekuensi terhadap lingkungan dan kesehatan manusia & hewan dibahas. Teknik-teknik ini
dipilih karena aplikasi potensial mereka dalam waktu dekat.
Teknik pencangkokan di mana batang atas yang dimodifikasi secara genetik
dicangkokkan pada batang bawah yang tidak dimodifikasi secara genetik tidak dipertimbangkan
dalam laporan ini karena penerapan teknik pencangkokan tersebut belum dijelaskan. Untuk
teknik pemuliaan baru yang melibatkan rekombinasi homolog atau penerapan nuklease jari-seng
(kelas 4 & 5 pada Tabel 1) hanya satu contoh, induksi mutasi yang diinduksi oligo, yang
dijelaskan. Semua teknik di kelas 4 & 5 ini memiliki potensi yang luar biasa, tetapi masih dalam
tahap awal dan oleh karena itu tidak dijelaskan dalam laporan ini. Namun, pada fase akhir
penulisan laporan ini, dua surat kepada Nature menjelaskan peningkatan penerapan nuklease jari-
seng (Shukla et al., 2009; Townsend et al., 2009), membuat perubahan urutan DNA yang
ditargetkan pada tanaman endogen dalam jangkauan. Laporan-laporan ini juga menunjukkan
kecepatan perkembangan teknik pemuliaan tanaman baru saat ini. Hanin dan Paszkowskiy
(2003) dan Puchta (2003b) memberikan gambaran yang bagus tentang teknik menggunakan
rekombinasi homolog untuk modifikasi genom tanaman dan Durai et al. (2005) dapat
dikonsultasikan untuk informasi latar belakang mengenai teknik nuklease jari seng. Meskipun
modifikasi epigenetik dapat dilihat sebagai teknik pemuliaan baru yang menarik, metilasi DNA
yang stabil sulit dicapai dan faktor-faktor yang mempengaruhinya kurang dipahami. Pengenalan
teknik jangka pendek yang melibatkan metilasi DNA tidak diperkirakan dan oleh karena itu
teknik ini tidak dipertimbangkan dalam laporan ini. Untuk informasi umum mengenai metilasi
DNA, review oleh Bender (2004) direkomendasikan.
1. Teknik modifikasi genetik yang digunakan sebagai alat untuk memfasilitasi pemuliaan.
Dalam teknik ini, galur tanaman rekayasa genetika (sebagian) dibuat dan galur tanaman ini
selanjutnya digunakan untuk membuat turunan yang pada akhirnya benar-benar bebas dari
materi genetik yang digunakan dalam modifikasi genetik awal.
A. Agroinfiltrasi
b. Virus Induced Gene Silence (VIGS)
c. Pembiakan terbalik
d. Pemuliaan dipercepat setelah induksi pembungaan awal
2. Menggabungkan tanaman rekayasa genetika dan non-rekayasa genetika dengan okulasi.

Dari tanaman chimeric ini hanya bagian yang tidak dimodifikasi secara genetik yang digunakan
untuk memanen produk makanan atau pakan.
A. Pencangkokan batang atas yang tidak dimodifikasi secara genetik pada batang bawah yang
dimodifikasi secara genetik b. Pencangkokan batang atas yang dimodifikasi secara genetik pada
batang bawah yang tidak dimodifikasi secara genetik
3. Penggunaan modifikasi genetik sebagai alat langsung untuk memperkenalkan plasma nutfah
baru, tetapi milik karakteristik pada suatu tanaman. Materi genetik yang digunakan untuk
modifikasi berasal dari spesies yang sama atau kompatibel secara seksual.
A. Cisgenesis
b. Intragenesis
4. Teknik dimana modifikasi genetik digunakan sebagai alat untuk membuat mutasi tertentu.
Teknik-teknik ini memperkenalkan mutasi yang diarahkan ke situs ke gen asli, yang mengarah
ke knock-out ekspresi gen atau perubahan dalam pola ekspresi gen atau sifat produk gen.
A. Induksi mutasi akibat oligo
b. Mutasi terinduksi nuklease jari seng (lihat publikasi terbaru dalam bahasa Belanda: Zinkvinger
aan de pols Ontwikkelingen en implikasi van de zinkvingertechnologie. Sinyal COGEM
CGM/090616-02)
c. Mutasi melalui rekombinasi homolog
5. Teknik menggunakan modifikasi genetik untuk memperkenalkan protein yang mengarah pada
rekombinasi homolog. A. Penggantian gen yang diinduksi nuklease jari seng
b. Transformasi kloroplas (rekombinasi homolog)
c. Rekombinasi homolog
6. Modifikasi epigenetik.
A. Inaktivasi gen melalui metilasi DNA
Tabel 1. Kelas yang berbeda dari teknik pemuliaan baru dan teknik yang menyertainya
tercantum dalam tabel ini. Teknik yang ditandai dengan huruf tebal dipilih karena potensi
penerapannya dalam waktu dekat dan dibahas dalam laporan ini.
Baseline
Untuk dapat mendiskusikan konsekuensi dari teknik pemuliaan baru untuk lingkungan
dan untuk keamanan pangan dan pakan, baseline (khusus kasus) harus ditentukan. Garis dasar
dijelaskan menggunakan referensi yang mencakup situasi 'alami' dalam bandwidth penuhnya.
Referensi yang paling jelas adalah genotipe (yang dibiakkan secara konvensional) yang
digunakan untuk modifikasi genetik, tetapi penyaringan genotipe tambahan relevan untuk
menunjukkan bandwidth untuk setiap parameter. Selain itu, produk dari spesies lain dengan
riwayat penggunaan yang aman juga dapat menjadi referensi penting. Jika misalnya dalam buah
yang dimodifikasi secara genetik, senyawa tertentu hadir dalam jumlah yang melebihi garis dasar
spesifik spesies, ini mungkin hanya tingkat alami dalam buah-buahan dari spesies yang berbeda.
Di samping ini, mutan, hibrida somatik dari spesies yang dapat disilangkan dan tanaman yang
dicangkokkan dapat menjadi referensi yang berguna untuk menentukan lebar pita dari garis
dasar. Namun harus ditekankan, bahwa referensi tertentu, misalnya tanaman mutan spesifik yang
diduga, tidak akan selalu tersedia, meskipun jelas bahwa referensi tersebut dapat dihasilkan
menurut teknik pemuliaan tanaman konvensional.

Agroinfiltrasi
Agroinfiltrasi adalah teknik yang menggunakan Agrobacterium sebagai alat untuk
mencapai ekspresi lokal dan sementara dari gen yang asing bagi spesies dalam suatu tanaman.
Teknik ini diterapkan untuk menguji reaksi tanaman target terhadap protein transgenik, atau
untuk analisis gen fungsional pada tanaman. Stek atau biji tanaman terpilih yang bebas
Agrobacterium dapat digunakan untuk pengembangan tanaman lebih lanjut.
Agrobacterium tumefaciens umumnya digunakan untuk modifikasi genetik tanaman yang
stabil. Namun, Agrobacterium juga dapat digunakan untuk mencapai ekspresi gen sementara
pada tanaman. Selama ekspresi gen transien, gen yang diperkenalkan dalam sel inang tidak harus
dimasukkan ke dalam genom tanaman, melainkan menjadi aktif sementara sebagai molekul
DNA bebas dalam sel tanaman. Ini menghasilkan transkripsi cepat menjadi molekul RNA
(messenger RNA (mRNA), dalam kasus gen yang diekspresikan menjadi protein, atau RNA
untai ganda (dsRNA) ketika apa yang disebut konstruksi RNAi digunakan untuk memblokir
ekspresi gen endogen). Ekspresi gen transien diperoleh dengan menginfiltrasi Agrobacterium
selke dalam bagian tanaman, biasanya daun atau jaringan batang, dengan menggunakan infiltrasi
dengan jarum suntik (lihat Gambar 1). Teknik ini disebut agroinfiltrasi dan beberapa hari setelah
agroinfiltrasi tanaman dapat disaring untuk efek yang diinginkan.
Agroinfiltrasi terutama diterapkan sebagai uji ketahanan penyakit diagnostik pada tanaman.
Awalnya, agroinfiltrasi telah digambarkan sebagai metode untuk inokulasi virus yang efektif
pada tanaman. Dalam hal ini kita lebih suka berbicara tentang agroinokulasi atau agroinfeksi.
Karena inokulasi virus mekanis seringkali kurang berhasil, agroinokulasi dikembangkan
menggunakan Agrobacterium sebagai agen penghantar genom virus. Untuk ini, genom virus
diisolasi dari virus yang akan diuji dan kemudian dikloning antara batas kiri dan kanan T-DNA
dari vektor transformasi tanaman. Untuk menilai kerentanan tanaman terhadap infeksi virus,
Agrobacterium yang dilengkapi dengan vektor ini disusupkan ke dalam tanaman melalui
agroinokulasi. Konsekuensi teknik agroinokulasi serupa dengan pembungkaman gen yang
diinduksi virus (VIGS) dan akan dijelaskan di bagian 'Pembungkaman gen yang diinduksi virus'.
Agroinfiltrasi sering digunakan sebagai uji diagnostik dengan mengekspresikan gen yang
mengkode protein avirulensi secara transien ke dalam tanaman yang akan diuji. Gen-gen ini
berasal dari patogen tanaman dan dapat berinteraksi dengan gen ketahanan tanaman yang
mengarah ke respons pertahanan di tanaman. Reaksi tanaman terhadap protein avirulensi ini
dapat menunjukkan tingkat resistensi atau toleransi tertentu. Tanaman dengan pola ketahanan
yang diinginkan kemudian akan diseleksi dan diperbanyak untuk evaluasi lebih lanjut dan/atau
pemuliaan.
Agroinfiltrasi juga digunakan sebagai metode untuk mengekspresikan konstruksi gen
secara sementara untuk induksi pembungkaman gen (atau penurunan regulasi ekspresi gen) pada
tanaman. Salah satu metode tersebut melibatkan pengenalan konstruksi DNA yang mengandung
pengulangan terbalik untuk produksi dsRNA ke dalam tanaman. Konstruksi ini secara efektif
menginduksi pembungkaman RNA oleh interferensi RNA (RNAi) yang mengarah pada
degradasi mRNA target. RNAi sebagai akibat langsung menurunkan regulasi ekspresi gen yang
sesuai. Cara kerja RNAi telah dijelaskan hampir sepenuhnya dan salah satu aspek RNAi yang
kurang dipahami adalah bahwa ia juga dapat menginduksi metilasi DNA yang diarahkan RNA
(Mathieu dan Bender, 2004). Metilasi DNA ini (diarahkan ke gen yang urutan RNAi diarahkan)
menyebabkan perubahan pada tingkat DNA atau kromatin. Metilasi urutan promotor dapat
mengakibatkan pencegahan transkripsi (= produksi mRNA) dari gen target (Mette et al., 2000),
sedangkan metilasi DNA dari daerah yang ditranskripsi biasanya tidak berpengaruh pada
ekspresi gen. Namun demikian, beberapa laporan menjelaskan bahwa metilasi daerah yang
ditranskripsi dapat menyebabkan pembungkaman (Hohn et al., 1996) dan regulasi (Li et al.,
2008; Shibuya et al., 2009) dari ekspresi gen. Agroinfiltrasi juga digunakan untuk pengenalan
vektor virus untuk VIGS. Konsekuensi penerapan VIGS akan dibahas di bagian 'Pembungkaman
gen yang diinduksi virus'.
Gambar 1. Infiltrasi suspensi sel Agrobacterium ke dalam daun tembakau.
Aplikasi potensial dalam program pemuliaan saat ini

Agroinfiltrasi terutama merupakan alat yang menarik dalam program pemuliaan untuk menguji
ketahanan terhadap penyakit virus, bakteri atau jamur. Setelah pengujian, tergantung pada
spesies tanaman yang digunakan, benih atau jaringan vegetatif akan dipanen dari tanaman yang
dipilih dan digunakan untuk pemuliaan lebih lanjut atau perkalian. Selama ini penerapan
agroinfiltrasi hanya sebatas membantu menjawab pertanyaan penelitian saja.
Fitur khusus penerapan teknik

Telah ditunjukkan bahwa setelah agroinfiltrasi Agrobacterium mampu bertahan di tempat
inokulasi untuk waktu yang lama (Moligner et al., 1993). Untuk mencegah infeksi sekunder
dengan Agrobacterium dalam pengembangan tanaman lebih lanjut, benih atau jaringan lain akan
dipanen dari lokasi selain tempat agroinfiltrasi. Namun, telah ditemukan bahwa Agrobacterium
mampu bergerak secara internal melalui pembuluh xilem dalam anggur (Tarbah et al., 1987).
Baru-baru ini juga telah dijelaskan bahwa agrobakteri patogen alami mampu bergerak secara
sistemik di dalam tanaman yang mengarah ke induksi situs infeksi sekunder di luar tempat
inokulasi untuk sejumlah spesies tanaman (tomat, mawar, selentingan, krisan, ceri, persik). x
hibrida almond dan dalam kenari) (Cubero et al., 2006). Jadi, konsekuensi dari agroinfiltrasi
mungkin Agrobacterium berpindah dari tempat infiltrasi di seluruh tanaman ke bagian yang
digunakan untuk perbanyakan lebih lanjut, menyebabkan infeksi dan kemungkinan transformasi
yang stabil (yaitu integrasi DNA yang stabil ke dalam genom tanaman).
Meskipun, beberapa genera bakteri telah ditemukan dalam benih spesies tanaman (Schaad et al;
1982), Agrobacterium ssp. umumnya dianggap tidak ditularkan melalui benih. Namun,
menggunakan TaqMan PCR, teknik penyaringan yang sangat sensitif, dengan Agrobacterium
probe TaqMan spesifikssp., Weller et al. (2002) mampu mendeteksi (wildtype) Agrobacterium
dalam satu dari sekitar 7.000disterilkan permukaan (tidak dimodifikasi secara genetik) Brassica
napus yang biji, menunjukkan bahwa kelangsungan hidup Agrobacterium di dalam biji mungkin
merupakan peristiwa yang jarang terjadi, tetapi tidak dapat dikecualikan. Ini juga menyiratkan
bahwa tidak dapat dikecualikan bahwa DNA yang dimasukkan ke dalam jaringan tanaman dapat
dimasukkan ke dalam DNA inti, meskipun tidak ada laporan yang diketahui tentang hal ini saat
ini. PCR positif untuk benih tunggal juga dapat disebabkan oleh adanyamati Agrobacterium
selyang masih menempel pada permukaan benih atau kesalahan PCR. Dari informasi yang
terbatas tentang nasib Agrobacterium dalam benih tanaman yang diinfiltrasi agro, tidak mungkin
untuk menyimpulkan apakah Agrobacterium mampu menginfeksi benih pada agroinfiltrasi atau
tidak. Meskipun jelas bahwa kemungkinan infeksi internal benih sangat terbatas, setiap bagian
tanaman yang diambil dari tanaman yang diinfiltrasi agro dengan tujuan perbanyakan lebih lanjut
harus disaring dengan hati-hati untuk mengetahui tidak adanya Agrobacterium, kromosom
Agrobacterium DNAdan T-DNA yang digunakan untuk agroinfiltrasi.
Metode penyaringan untuk tidak adanya Agrobacterium dan transgen

Pada prinsipnya tanaman yang dikenai uji agroinfiltrasi dapat dikloning sebelum
pengujian, untuk mencegah kehadiran agrobakteri yang tidak diinginkan dalam bahan tanaman
lanjutan. Namun, dalam program pemuliaan biasanya sejumlah besar keturunan harus disaring,
yang membuat perbanyakan klon dari semua keturunan tidak praktis secara ekonomi. Untuk
menghindari infeksi laten Agrobacterium dan untuk menghindari adanya sel-sel transformasi
yang stabil (yang mengandung T-DNA dan/atau DNA bakteri) pada bahan tanaman yang
akhirnya dipilih, metode deteksi yang efektif dan sensitif seperti PCR atau PCR kuantitatif
(qPCR) (Cubero et al., 1999; Sudarshana et al., 2006) digunakan. Menggunakan qPCR,
Sudarshana et al. (2006) mampu mendeteksi sedikitnya 20 Agrobacterium selper gram tanah.
Cubero dkk. (2006) menggunakan metodologi yang didasarkan pada kombinasi metode isolasi
(bakteri) dan teknologi PCR untuk mendeteksi agrobakteri dalam jaringan tanaman. Dari hasil
mereka dapat disimpulkan bahwa metode berdasarkan pengayaan agrobakteri menggunakan
media kultur selektif (ekstrak tanaman ditambahkan ke media kultur yang dioptimalkan dan
selektif) dalam kombinasi dengan PCR lebih efektif daripada menerapkan PCR langsung pada
DNA yang diekstraksi dari bahan tanaman.
Perbandingan produk akhir dari teknik pemuliaan baru dan tanaman yang dibiakkan
secara konvensional Jika produk akhir tanaman yang diinfiltrasi agro berasal dari bagian
tanaman yang tidak dimodifikasi secara genetik (misalnya meristem atau biji) yang telah terbukti
benar-benar bebas dari Agrobacterium,Agrobacterium sekuens DNA genomatau terintegrasi T-
DNA, produk akhir akan persis sama dengan tanaman asli yang digunakan untuk agroinfiltrasi.
Setelah agroinfiltrasi, kehadiran dan ekspresi gen yang diperkenalkan bersifat sementara dan
efek gen akan memudar seiring waktu. Dalam kasus agroinfiltrasi digunakan untuk induksi
pembungkaman RNA, fenotipe yang dibungkam dapat dipertahankan melalui perbanyakan
vegetatif atau regenerasi organ dan bahkan dapat ditularkan melalui cangkok (Sonoda et al.,
2000; Tournier et al., 2006). Transmisi sinyal pembungkaman RNA melalui benih belum
dilaporkan. Davuluri dkk. (2005) menemukan bahwa ketika menyilangkan tanaman tomat
transgenik dengan fenotipe RNA-silenced dengan tomat non-transgenik, keturunan yang tidak
menerima transgen juga tidak menunjukkan fenotipe yang dibungkam, menunjukkan bahwa
sinyal pembungkaman tidak ditularkan melalui biji. . Jika agroinfiltrasi ditujukan untuk induksi
metilasi DNA yang diarahkan RNAi dari daerah promotor (pembungkaman promotor), fenotipe
terkait metilasi kadang-kadang dapat diwarisi secara stabil oleh generasi seksual berikutnya,
terlepas dari keberadaan transgen (Park et al., 1996). ). Jadi, meskipun keturunan yang dihasilkan
dapat dianggap sebagai non-modifikasi genetik, hasil modifikasi genetik masih dapat efektif
dalam generasi seksual berikutnya.
Konsekuensi lingkungan
Risiko utama penerapan agroinfiltrasi adalah pelepasan hasil rekayasa genetika yang tidak
disengaja Agrobacterium galurke lingkungan. Di dalam tanah, Agrobacterium mampu bertahan
hidup dan dapat mentransfer transgen ke tanaman lain. Selanjutnya, vektor biner dapat ditransfer
ke mikroorganisme lain melalui transfer gen horizontal (Droege et al., 1999; Stewart et al. al.,
2000). Untuk mencegah pelepasan Agrobacterium atau penyebaran DNA rekombinan, metode
yang andal dan tervalidasi harus diterapkan untuk membuktikan bahwa bahan tanam, termasuk
benih, yang berasal dari tanaman yang diinfiltrasi, benar-benar bebas dari Agrobacterium dan
sekuens vektor biner. Jika demikian, Agrobacterium bahan tanaman bebasdan rekombinan DNA
ini mirip dengan tanaman asli sebelum agroinfiltrasi. Tanaman ini dapat berfungsi sebagai dasar.
Pada prinsipnya, tidak ada konsekuensi lingkungan yang diperkirakan ketika
Agrobacteriumbahan tanaman bebasyang berasal dari tanaman yang diinfiltrasi agro dilepaskan
ke lingkungan. Dalam kasus agroinfiltrasi digunakan untuk pembungkaman gen, efek
pembungkaman kadang-kadang mungkin masih ada pada keturunan vegetatif atau seksual yang
tidak dimodifikasi secara genetik dari tanaman yang diinfiltrasi agro. Oleh karena itu, ekspresi
gen yang telah dibungkam harus dievaluasi secara hati-hati dan dibandingkan dengan baseline.
Jika mereka tidak menyimpang dari garis dasar atau dari lebar pita ekspresi maka tidak ada
alasan untuk mengharapkan efek pada lingkungan.
Konsekuensi terhadap keamanan pangan dan pakan

Tanaman tanaman yang berasal dari tanaman tetua yang diseleksi menggunakan
agroinfiltrasi harus terbukti bebas dari Agrobacterium, Agrobacterium chromosomal DNA dan
binary vector sequences sebelum dilepas ke lingkungan. Oleh karena itu, produk makanan yang
dipanen dari tanaman tanaman ini juga bebas dari Agrobacterium, Agrobacterium, DNA
kromosomdan urutan DNA rekombinan. Keamanan pangan dan pakan akan serupa dengan
produk yang
dipanen dari tanaman asli sebelum agroinfiltrasi atau dari galur tanaman terkait yang diproduksi
dengan cara serupa, tetapi tanpa bantuan modifikasi genetik. Tanaman ini dapat berfungsi
sebagai dasar.
Jika agroinfiltrasi ditujukan pada pembungkaman gen, efek pembungkaman kadang-
kadang mungkin masih ada pada keturunan vegetatif atau seksual yang tidak dimodifikasi secara
genetik dari tanaman yang diinfiltrasi agro. Hal ini dapat mengakibatkan perubahan ekspresi gen
target yang telah dibungkam. Dalam kasus seperti itu, keturunannya harus diperiksa secara hati-
hati untuk kemungkinan perubahan dalam ekspresi gen target dan sekali lagi ketika serupa
dengan tingkat dasar atau berada dalam bandwidth ekspresi, tidak ada masalah keamanan
makanan atau pakan yang diharapkan.
Pembungkaman gen yang diinduksi Pembungkaman gen yang diinduksi

Virus-virus (VIGS) adalah teknik yang digunakan untuk pembungkaman (sementara)
ekspresi gen endogen spesifik pada tanaman. VIGS terutama digunakan untuk analisis fungsional
gen. Vektor DNA VIGS biasanya dimasukkan ke dalam tanaman menggunakan Agrobacterium
atau virus tanaman tertentu. Penerapan pembungkaman gen yang diinduksi virus (VIGS) adalah
teknik yang ampuh untuk membungkam ekspresi gen tertentu secara sementara di tanaman inang
melalui interferensi RNA (RNAi) (Baulcombe, 1999; Ratcliff et al., 2001). VIGS dapat
memberikan hasil pembungkaman gen yang serupa seperti yang dijelaskan di bagian
'Agroinfiltrasi', tetapi untuk VIGS RNA untai ganda (dsRNA) diproduksi oleh replikasi virus
RNA untai tunggal virus, bukan oleh transkripsi gen yang diperkenalkan (DNA). Seperti halnya
agroinfiltrasi, VIGS menghindari kebutuhan akan proses transformasi dan regenerasi tanaman
yang memakan waktu. VIGS didasarkan pada mekanisme pertahanan tanaman yang membatasi
keparahan infeksi virus alami pada tanaman (Baulcombe, 1999). VIGS dapat diinduksi dalam
kondisi laboratorium/rumah kaca dengan memasukkan vektor VIGS ke dalam tanaman. Vektor
virus ini terdiri dari genom virus yang dimodifikasi dan termasuk fragmen dari gen tanaman
inang untuk dibungkam. Beberapa metode biasanya digunakan untuk mengirimkan vektor VIGS
ke tanaman, seperti inokulasi mekanis menggunakan RNA virus (transkripsi in vitro) atau
ekstrak dari daun yang terinfeksi (mengandung virus spesifik VIGS) dan agroinokulasi
(menggunakan Agrobacterium). Hasil inokulasi dalam replikasi virus dan produksi intermediet
dsRNA. Zat antara ini dikenali oleh sel tumbuhan sebagai produk asing yang menghasilkan
aktivasi mekanisme pertahanan tumbuhan. Ini kemudian mengarah pada degradasi dsRNA
menjadi molekul RNA kecil yang disebut short interfering RNAs (siRNAs). Akhirnya, siRNA
ini berfungsi sebagai panduan dalam kompleks pembungkaman yang diinduksi RNA, yang
mengarah pada degradasi spesifik messenger RNA (mRNA) dengan homologi yang identik
(Chicas dan Macino, 2001). Jadi, dengan pengenalan molekul RNA yang homolog dengan gen
asli tertentu, ekspresi gen ini akan dibungkam melalui degradasi mRNA yang sesuai.

Sejauh ini, VIGS terutama digunakan sebagai tes cepat untuk fungsionalitas gen asli
tertentu dengan membungkam ekspresinya. Ini mungkin misalnya berlaku untuk gen yang
merupakan bagian dari mekanisme resistensi penyakit. Tanaman yang menunjukkan reaksi yang
diharapkan akan dipilih untuk evaluasi lebih lanjut (Robertson, 2004). VIGS juga dapat
digunakan sebagai teknik pemuliaan baru untuk membungkam gen tertentu, dengan tujuan untuk
mencapai fenotipe tanaman yang diubah yang bermanfaat untuk pemuliaan atau perbanyakan
lebih lanjut. Misalnya pembungkaman gen penekan bunga dapat menginduksi pembungaan awal
(Michaels dan Amasino; 1999, 2001) yang berguna dalam mempercepat pemuliaan
tanaman. spesies dengan waktu generasi yang lama. Saat ini penerapan agroinokulasi dan VIGS
terbatas untuk membantu menjawab pertanyaan penelitian saja.

Untuk VIGS beberapa virus DNA dan RNA yang berbeda dimodifikasi untuk berfungsi
sebagai vektor untuk pembungkaman gen. Inokulasi tanaman (terlepas dari metode yang
digunakan) dengan vektor VIGS menyebabkan replikasi virus dan pergerakan virus ke seluruh
tanaman (Voinnet et al., 2000). Untuk pemulihan keturunan bebas virus dari tanaman terpilih
VIGS dengan perbanyakan klon, teknik khusus dan melelahkan seperti termoterapi dan kultur
ujung meristem diperlukan (Walkey, 1981). Hal ini membuat perbanyakan klonal tanaman
terpilih VIGS tidak cocok sebagai metode langsung untuk mendapatkan bahan tanaman bebas
virus untuk evaluasi lebih lanjut. Tergantung pada jenis virus yang digunakan dan spesies
tanaman yang digunakan, benih mungkin cocok untuk perbanyakan lebih lanjut galur terpilih
VIGS bebas virus. Namun, beberapa virus yang digunakan untuk VIGS, seperti virus mosaik
barley stripe (BSMV), dapat ditularkan melalui benih (Johansen et al., 1994). Karena setiap jenis
virus memiliki, dalam kombinasi dengan spesies tanaman yang digunakan, sifat-sifatnya sendiri,
evaluasi khusus kasus diperlukan untuk menentukan apakah dan bagaimana bahan tanaman
bebas virus dapat diproduksi untuk perbanyakan tanaman uji VIGS.
Berbeda dengan virus hewan dan bakteri, tidak ada laporan tentang urutan virus
tumbuhan yang telah diintegrasikan ke dalam genom tanaman inang setelah infeksi virus. Namun
demikian, tampaknya semua anggota kerajaan tumbuhan telah mengintegrasikan sekuens sisa
virus DNA tertentu, yang menunjukkan bahwa kadang-kadang virus telah berintegrasi ke dalam
genom tumbuhan sepanjang evolusi (Hull et al., 2000). Untuk virus tanaman yang memiliki
genom RNA tidak ada contoh bentuk terintegrasi seperti itu (Harper et al., 2002).
Jika agroinokulasi digunakan untuk mengirimkan sekuens VIGS ke dalam tanaman, sekuens ini
dapat diintegrasikan secara stabil ke dalam genom tanaman inang sebagai hasil dari integrasi
yang dimediasi T-DNA. Hal ini karena untuk agroinokulasi urutan DNA VIGS pertama-tama
diklon ke T-DNA vektor transformasi tanaman (vektor biner) yang selanjutnya ditransfer ke
Agrobacterium. Setelah infiltrasi Agrobacterium ke dalam tanaman, T-DNA yang mengandung
urutan DNA VIGS akan sering berintegrasi ke dalam genom tanaman seperti yang terjadi
pada'normal' Agrobacteriumtransformasi tanaman yang dimediasi. Sebagai konsekuensi
tambahan dari agroinokulasi, Agrobacterium sel-seldapat menyebar secara sistemik ke seluruh
tanaman yang diinfiltrasi. Konsekuensi ini telah dijelaskan secara rinci pada bagian yang
menjelaskan teknik pemuliaan tanaman baru 'Agroinfiltrasi'.
Metode untuk penyaringan ada/tidaknya sekuens VIGS dan virus yang sesuai Untuk sekuens
DNA yang ditentukan VIGS dimasukkan ke dalam tanaman. Kehadiran sekuens VIGS dan virus
terkait karenanya dapat ditentukan dengan andal menggunakan teknik PCR (lihat mis Schneider
dkk., 2004; Bruun-Rasmussen et al., 2007). Juga analisis Southern blot telah digunakan untuk
mendeteksi urutan turunan VIGS (Johansen et al., 1994). Dalam hal penggunaan agroinokulasi,
tes PCR untuk mendeteksi Agrobacterium tumefaciens juga DNA kromosom dan T-DNAperlu
dilakukan.
Perbandingan produk akhir dari teknik pemuliaan baru dan tanaman budidaya
konvensional Setelah aplikasi VIGS, benih atau jaringan vegetatif dapat dipanen dari tanaman uji
VIGS terpilih dan diperbanyak untuk pemuliaan atau perbanyakan lebih lanjut. Jika tanaman
yang diperbanyak ini benar-benar bebas dari virus rekombinan atau VIGS vektor-DNA (dan
Agrobacterium dan Agrobacterium DNA ketika agroinokulasi digunakan), maka produk akhir
pada prinsipnya mirip dengan tanaman asli sebelum VIGS. Namun, meskipun tidak ada DNA
atau virus terkait VIGS, sinyal pembungkaman RNA dapat bertahan dan fenotipe yang
dibungkam dapat dipertahankan melalui perbanyakan vegetatif (Vaistij et al., 2002). Transmisi
sinyal pembungkaman RNA melalui benih belum dilaporkan.
Jika VIGS telah menghasilkan induksi metilasi DNA yang diarahkan RNA, fenotipe
terkait metilasi kadang-kadang dapat diwarisi secara stabil oleh generasi seksual berikutnya,
terlepas dari keberadaan DNA atau virus terkait VIGS (Park et al., 1996). Jadi, walaupun
keturunan yang dihasilkan dapat dianggap sebagai non-genetically modified (tidak ada
perbedaan pada tingkat genomic-DNA sequence), hasil dari modifikasi genetik tersebut masih
dapat efektif untuk generasi berikutnya secara seksual.
Risiko utama penerapan VIGS adalah pelepasan virus rekombinan yang tidak disengaja
ke lingkungan. Karena virus RNA digunakan secara keseluruhan untuk vektor VIGS, inokulasi
yang tidak disengaja melalui transmisi mekanis harus dipertimbangkan sebagai konsekuensi
serius. Virus dari vektor DNA tidak memiliki lapisan protein dan tidak menular. Namun,
ditunjukkan bahwa misalnya geminivirus dapat berkembang pesat di bawah kondisi lapangan
dan mampu bergabung kembali dengan galur geminivirus lain yang ada di tanaman yang sama
(Pita et al., 2001). Cara paling realistis untuk memulihkan VIGS dan tanaman bebas virus adalah
melalui benih ketika virus yang tidak dapat ditularkan melalui benih telah digunakan untuk
VIGS. Jika bahan tanam yang berasal dari tanaman uji VIGS terbukti benar-benar bebas dari
sekuens DNA VIGS atau virus terkait VIGS, bahan ini pada prinsipnya mirip dengan tanaman
asli sebelum penerapan VIGS dan oleh karena itu tidak ada konsekuensi lingkungan yang
diperkirakan saat melepaskan bahan tersebut di lingkungan. Sebagai dasar, tanaman asli yang
digunakan untuk VIGS atau tanaman serupa yang diperoleh dengan penyaringan tanpa bantuan
VIGS dapat digunakan. Karena VIGS umumnya digunakan untuk pembungkaman gen, efek
pembungkaman kadang-kadang mungkin masih ada pada keturunan vegetatif atau seksual yang
tidak dimodifikasi secara genetik dari tanaman yang diuji VIGS. Oleh karena itu ekspresi
gen yang telah dibungkam harus dievaluasi secara hati-hati dan dibandingkan dengan baseline.
Jika ekspresi gen target normal (atau lebih tepatnya berada dalam bandwidth yang diukur atau
dilaporkan untuk tanaman asli) dibandingkan dengan tanaman asli, maka seharusnya tidak ada
efek pada lingkungan.
Konsekuensi untuk keamanan pangan dan pakan

Karena semua bahan tanaman akan bebas dari urutan vektor VIGS atau virus terkait
VIGS, keamanan pangan dan pakan pada prinsipnya akan serupa dengan pangan terkait yang
tidak dimodifikasi secara genetik. Sebagai dasar tanaman serupa yang diperoleh dengan
penyaringan tanpa bantuan VIGS dapat digunakan. Karena VIGS umumnya digunakan untuk
pembungkaman gen, efek pembungkaman kadang-kadang mungkin masih ada pada keturunan
vegetatif atau seksual yang tidak dimodifikasi secara genetik dari tanaman yang diuji VIGS. Hal
ini dapat mengakibatkan perubahan ekspresi gen target yang telah dibungkam. Dalam kasus
seperti itu, keturunannya harus hati-hati diperiksa untuk kemungkinan perubahan ekspresi gen
target. Dalam hal ekspresi serupa seperti pada tanaman asli, keamanan pangan dan pakan
diharapkan serupa dengan tanaman asli.
Pemuliaan terbalik
Pemuliaan terbalik adalah teknik pemuliaan baru yang memanfaatkan modifikasi genetik
untuk memfasilitasi pemuliaan hibrida-F1 dengan menekan rekombinasi meiosis. Pada langkah
pemuliaan terakhir, gen yang digunakan untuk modifikasi genetik dicoret, menghasilkan produk
akhir yang benar-benar bebas dari sekuens DNA terkait modifikasi genetik.
Secara tradisional, varietas dari banyak tanaman diproduksi sebagai hibrida F1. Hibrida
elit F1 dikembangkan dengan seleksi awal yang cermat dari garis tetua homozigot diikuti oleh
generasi hibrida eksperimental yang diuji untuk nilai pertanian atau hortikulturanya. Dalam
seleksi garis tetua awal, dua varietas tetua yang berbeda dikawinkan (disilangkan kembali
berulang kali) untuk sejumlah generasi sampai-sampai hampir homozigot. Perbedaan antara garis
tetua meningkatkan pertumbuhan dan karakteristik hasil dari hibrida F1 heterozigot yang
dihasilkan melalui fenomena heterosis atau kekuatan hibrida. Homozigositas dari garis induk
memastikan generasi F1 heterozigot yang seragam secara fenotipik. Heterozigositas hibrida F1
akan mengakibatkan hilangnya karakteristik elitnya ketika hibrida F1 itu sendiri digunakan untuk
berkembang biak.
Pemuliaan terbalik adalah metode baru yang memungkinkan pemulia menghasilkan
hibrida baru dalam waktu yang jauh lebih singkat dibandingkan dengan teknik konvensional (van
Dun et al., 2005; Dirks et al., 2006). Pemuliaan terbalik dimulai dengan garis heterozigot elit dan
bertujuan untuk menghasilkan garis induk homozigot. Hibridisasi berikutnya dari galur tetua
homozigot ini menghasilkan tanaman hibrida F1 di mana komposisi genetik asli galur
heterozigot elit disusun kembali. Untuk mencapai garis induk homozigot prosedur yang
kompleks diikuti. Pertama, rekombinasi meiosis ditekan dalam garis heterozigot elit. Untuk ini
garis heterozigot dimodifikasi secara genetik dengan pengenalan konstruksi pembungkaman gen
untuk menurunkan regulasi ekspresi gen, seperti dmc1 dan spo11, yang terlibat dalam proses
rekombinasi meiosis. Dari bunga dari garis heterozigot elit transgenik yang dihasilkan,
mikrospora haploid (butir serbuk sari yang belum matang) dipanen dan genom mikrospora
haploid ini selanjutnya akan digandakan menggunakan teknik laboratorium yang disebut
teknologi haploid ganda. Menggunakan teknik kultur jaringan mikrospora diploid (haploid
ganda) akan berkembang menjadi embrio dan selanjutnya pada tanaman diploid homozigot. Di
antara koleksi tanaman diploid homozigot ini, pasangan tetua akan dipilih yang bersama-sama
menyusun kembali komposisi genetik dari garis elit heterozigot elit asli. Pemilihan tanaman tetua
homozigot yang tidak mengandung transgen memastikan bahwa hibrida F1 yang dihasilkan tidak
dimodifikasi secara genetik. Pendekatan pemuliaan tanaman baru ini menawarkan keuntungan
yang jelas dibandingkan teknik yang ada karena pada prinsipnya setiap tanaman heterozigot
sekarang dapat dieksploitasi secara komersial melalui sintesis ulang galur tetua yang sesuai.
Aplikasi potensial dalam program pemuliaan saat ini Pemuliaan terbalik masih dalam
tahap penelitian, tetapi jelas merupakan teknik dengan potensi tinggi. Keuntungan utama
pemuliaan terbalik adalah bahwa dengan pemuliaan terbalik, tanaman elit heterozigot dapat
diproduksi sebagai hibrida F1 karena sintesis ulang galur tetua.
Ciri khusus penerapan teknik

Pemuliaan terbalik adalah teknik pemuliaan baru yang memanfaatkan modifikasi genetik
sebagai langkah awal dalam proses pemuliaan. Dalam langkah-langkah berturut-turut garis induk
yang tidak dimodifikasi secara genetik dipilih untuk melanjutkan pemuliaan, menjamin bahwa
keturunan hibrida F1 akan benar-benar bebas dari urutan DNA yang terkait dengan modifikasi
genetik.
Metode penyaringan ada/tidaknya konstruksi gen yang digunakan

Salah satu langkah penting dalam proses ini adalah pemilihan galur tanaman tetua yang
dapat diandalkan yang benar-benar bebas dari sekuens DNA terkait modifikasi genetik. Teknik
PCR standar cocok untuk mengkonfirmasi secara andal ada atau tidaknya transgen ke dalam
galur terpilih untuk pemuliaan lebih lanjut. Di samping ini, Southern blotting menggunakan
konstruksi T-DNA lengkap yang digunakan untuk modifikasi genetik sebagai penyelidikan,
memberikan bukti tambahan untuk status bebas modifikasi genetik dari garis induk yang
dipilih.
Perbandingan produk akhir dari teknik pemuliaan baru dan tanaman yang dibiakkan
secara konvensional Garis tetua yang dihasilkan oleh pemuliaan terbalik pada prinsipnya dapat
diperoleh dengan cara yang sama dengan menggunakan teknik pemuliaan konvensional, tetapi
dalam jangka waktu yang lebih lama. Oleh karena itu, produk akhir dari pemuliaan terbalik akan
serupa dengan galur tetua yang diperoleh dengan pemuliaan konvensional.
Langkah modifikasi genetik awal melibatkan pembungkaman gen menggunakan interferensi
RNA (RNAi). Diketahui bahwa RNAi kadang-kadang dapat menyebabkan metilasi DNA yang
diarahkan RNA dari wilayah yang ditranskripsi, yang dapat memberikan perubahan ekspresi gen
target dan oleh karena itu dalam fenotipe yang berubah. Sinyal pembungkaman RNA itu sendiri
tidak akan ditransmisikan melalui biji, tetapi fenotipe yang berubah terkait metilasi dapat
diwarisi secara stabil oleh generasi seksual berikutnya (Hohn et al., 1996; Park et al., 1996). Jadi,
meskipun keturunan yang dihasilkan dapat dianggap sebagai non-rekayasa genetika, hasil RNAi
masih bisa efektif dalam generasi seksual berikutnya. Namun, dalam kasus khusus pemuliaan
terbalik, kemungkinan metilasi DNA yang diarahkan RNA dari gen yang terlibat dalam proses
rekombinasi meiosis diharapkan tidak berpengaruh pada produk akhir. Tanaman tetua dan
hibrida F1 tidak akan mengalami perubahan fenotipe karena perubahan rekombinasi meiosis.
Selain itu, variasi dalam rekombinasi meiosis adalah fenomena yang terjadi secara alami
(Wijnker dan de Jong, 2008).
Konsekuensi Lingkungan
Karena galur tetua yang dihasilkan oleh pemuliaan terbalik dan hibrida F1 yang
dihasilkan selanjutnya tidak mengandung sekuens DNA terkait modifikasi genetik dan karena
kemungkinan metilasi DNA yang diarahkan RNA yang ditransmisikan ke keturunannya hanya
akan berpengaruh pada meiosis rekombinasi, konsekuensi terhadap lingkungan pada prinsipnya
mirip dengan garis tetua dan hibrida F1 yang diperoleh dengan pemuliaan konvensional. Garis
induk yang dibiakkan secara konvensional dan hibrida F1 dapat berfungsi sebagai garis dasar.

Hibrida F1 biasanya digunakan untuk produksi pangan dan pakan. Oleh karena itu, hibrida F1
dianggap sebagai konsekuensi untuk keamanan pangan dan pakan, daripada garis induk, yang
merupakan produk akhir sebenarnya dari pemuliaan terbalik. F1-hibrida yang diperoleh melalui
persilangan garis induk turunan pemuliaan terbalik tidak mengandung sekuens DNA terkait
modifikasi genetik dan kemungkinan metilasi DNA yang diarahkan RNA yang ditransmisikan ke
keturunannya hanya akan berpengaruh pada rekombinasi meiosis. Oleh karena itu, produk dari
hibrida ini seaman produk yang diperoleh dari galur heterozigot asli yang digunakan untuk
pemuliaan terbalik atau sebagai hibrida F1 yang dibiakkan secara konvensional. Garis
heterozigot asli atau hibrida F1 yang dibiakkan secara konvensional dapat berfungsi sebagai
garis dasar.
Pemuliaan dipercepat setelah induksi pembungaan awal

Pemuliaan dipercepat adalah teknik pemuliaan baru yang memanfaatkan modifikasi
genetik untuk mempercepat pemuliaan dengan induksi pembungaan awal. Dalam penangkaran
akhir langkah gen digunakan untuk the modifikasi genetik yang dicoret, sehingga produk akhir
yang benar-benar bebas dari urutan DNA terkait modifikasi-genetik.
Dibandingkan dengan tanaman herba, pemuliaan pohon lebih memakan waktu karena waktu
generasi yang lama. Oleh karena itu, masa muda yang lebih pendek dan pembungaan sebelum
waktunya merupakan tujuan pemuliaan yang penting. Inisiasi bunga telah dipelajari secara
intensif di Arabidopsis dan ortolog/homolog dari gen yang terlibat (LEAFY (LFY), APETELA1
(AP1), dan TERMINAL FLOWER (TFL1)) telah diklon dari antara lain apel (Wada et al., 2002;
Kotoda dan Wada, 2005; Flachowsky dkk., 2006). Salah satu pendekatan untuk memperpendek
fase juvenil tanaman tahunan adalah dengan mengurangi juvenilitas/faktor pemeliharaan
vegetatif, seperti TFL1, dengan pembungkaman gen. Pembungkaman gen dari gen seperti TFL1
dapat menghasilkan pembungaan awal yang mengarah pada pengurangan drastis waktu siklus
pemuliaan (Flachowsky et al., 2006). Di samping ini, ekspresi berlebih dari BpMADS4, gen
faktor transkripsi terkait inisiasi bunga dari birch perak (Elo et al., 2001) telah terbukti
menginduksi pembungaan awal pada apel (Flachowsky et al., 2007). Menggunakan
pembungkaman gen atau konstruksi ekspresi berlebih, tanaman yang dimodifikasi secara genetik
dapat menghasilkan bunga itu jauh lebih awal daripada garis asli yang tidak dimodifikasi secara
genetik. Tanaman rekayasa genetika berbunga awal ini akan digunakan secara berurutan dalam
program pemuliaan sampai tingkat pemuliaan yang diperlukan tercapai. Pada langkah pemuliaan
terakhir, transgen yang digunakan untuk induksi pembungaan awal akan dicoret dan galur
tanaman yang benar-benar bebas dari sekuens DNA terkait modifikasi genetik akan dipilih.

Pemuliaan dipercepat menggunakan gen pembungaan awal masih dalam tahap
penelitian. Eksperimen awal telah menunjukkan bahwa dalam apel waktu generasi dapat
dikurangi dari 5-7 tahun menjadi hanya satu tahun (Flachowsky et al., 2009).

Pemuliaan dipercepat adalah teknik pemuliaan baru yang memanfaatkan modifikasi
genetik sebagai langkah awal dalam proses pemuliaan. Pada langkah terakhir, galur yang tidak
dimodifikasi secara genetik dipilih untuk menyelesaikan pemuliaan, menjamin bahwa keturunan
akhir akan benar-benar bebas dari sekuens DNA terkait modifikasi genetik.
Metode untuk menyaring ada/tidaknya konstruksi gen yang digunakan

Salah satu langkah penting dalam proses ini adalah pemilihan galur tanaman tetua yang
dapat diandalkan yang benar-benar bebas dari sekuens DNA terkait modifikasi genetik. Teknik
PCR standar cocok untuk mengkonfirmasi secara andal ada atau tidaknya transgen ke dalam
galur terpilih untuk pemuliaan lebih lanjut. Di samping ini, Southern blotting menggunakan
konstruksi T-DNA lengkap yang digunakan untuk modifikasi genetik sebagai penyelidikan,
memberikan bukti tambahan untuk status bebas modifikasi genetik dari garis induk yang
dipilih.
Perbandingan produk akhir dari teknik pemuliaan baru dan tanaman budidaya konvensional
Varietas elit yang dihasilkan oleh pemuliaan dipercepat dapat diperoleh dengan cara yang sama
dengan menggunakan teknik pemuliaan konvensional, tetapi dalam jangka waktu yang lebih
lama. Oleh karena itu, produk akhir akan serupa dengan rekan-rekan mereka yang dihasilkan
oleh pemuliaan konvensional. Diketahui bahwa RNAi kadang-kadang dapat menyebabkan
metilasi DNA yang diarahkan RNA dari wilayah yang ditranskripsi, yang dapat memberikan
perubahan ekspresi gen target dan oleh karena itu dalam fenotipe yang berubah. Sinyal
pembungkaman RNA itu sendiri tidak akan ditransmisikan melalui biji, tetapi kadang-kadang
fenotipe yang berubah terkait metilasi dapat diwarisi secara stabil oleh generasi seksual
berikutnya (Hohn et al., 1996; Park et al., 1996). Jadi, meskipun keturunan yang dihasilkan dapat
dianggap sebagai non-rekayasa genetika, kadang-kadang hasil RNAi masih bisa efektif dalam
generasi seksual berikutnya. Dalam kasus spesifik induksi pembungaan awal, kemungkinan
metilasi DNA yang diarahkan RNA dari gen yang terlibat dalam proses pembungaan akan
menghasilkan fenotipe yang jelas (pembungaan awal). Meskipun pembungaan awal dapat
dengan mudah dipilih, fenotipe pembungaan awal diharapkan tidak berpengaruh pada produk
akhir.
Karena varietas baru yang dihasilkan oleh pemuliaan dipercepat tidak mengandung
sekuens DNA terkait modifikasi genetik, konsekuensi terhadap lingkungan serupa dengan
varietas yang dibiakkan secara konvensional. Tanaman seperti itu yang dihasilkan oleh
pemuliaan konvensional dapat berfungsi sebagai dasar. Dalam kasus pembungkaman gen yang
dimediasi RNAi telah digunakan untuk menginduksi pembungaan awal, ada kemungkinan
bahwa ini masih menginduksi pembungaan awal pada keturunan seksual akhir (yang bebas dari
sekuens DNA terkait modifikasi genetik). Tidak ada konsekuensi lingkungan yang diharapkan
dari fenotipe berbunga awal. Tentu saja tanaman yang dihasilkan harus diperiksa untuk tidak
adanya rekombinan atau DNA terkait GM dengan teknik molekuler seperti PCR atau Southern
blotting. Jika demikian halnya, tidak ada risiko lingkungan.
Karena varietas baru yang dihasilkan oleh pemuliaan dipercepat tidak mengandung sekuens
DNA terkait modifikasi genetik, produk dari hibrida ini seaman produk yang diperoleh dari
varietas yang dibiakkan secara konvensional. Tanaman seperti itu dihasilkan dengan pemuliaan
konvensional dapat berfungsi sebagai dasar. Dalam kasus pembungkaman gen yang dimediasi
RNAi telah digunakan untuk menginduksi pembungaan awal, ada kemungkinan bahwa ini masih
menginduksi pembungaan awal pada keturunan seksual akhir (yang bebas dari sekuens DNA
terkait modifikasi genetik). Tidak ada konsekuensi yang diharapkan dari fenotipe berbunga
awal.
Menggabungkan bagian tanaman yang dimodifikasi secara genetik dan yang tidak
dimodifikasi secara genetik dengan mencangkok Dengan menggabungkan bagian tanaman yang
dimodifikasi secara genetik dan yang tidak, produk (seperti buah atau bunga) dapat diproduksi
pada bagian tanaman yang tidak dimodifikasi secara genetik yang dicangkokkan pada akar yang
dimodifikasi secara genetik saham. Gabungan tanaman rekayasa genetika-non rekayasa genetika
biasanya memiliki karakteristik budidaya yang lebih baik.
Okulasi adalah metode perbanyakan tanaman di mana biasanya batang atau tunas dari
satu tanaman menyatu dengan batang berakar dari yang lain. Hal ini paling sering digunakan
untuk budidaya komersial pohon buah-buahan, anggur, tomat, mentimun dan beberapa bunga
seperti mawar. Untuk okulasi, satu tanaman dipilih untuk akarnya dan disebut batang bawah.
Tanaman lain dipilih untuk batang, daun, bunga atau buahnya dan disebut batang atas.
Pencangkokan yang berhasil membutuhkan koneksi vaskular antara dua jaringan. Koneksi ini
memungkinkan transportasi vaskular antara batang bawah dan batang atas.
Mencangkokkan batang atas yang tidak dimodifikasi secara genetik pada hasil batang
bawah yang dimodifikasi secara genetik menjadi tanaman chimeric dari mana produk dapat
dipanen dari bagian atas yang tidak dimodifikasi secara genetik, sehingga produk ini tidak
dimodifikasi secara genetik. Namun, menurut peraturan saat ini, jika bagian dari tanaman
dimodifikasi secara genetik, seluruh tanaman harus dianggap telah dimodifikasi secara genetik.
Ada beberapa cara di mana batang bawah yang dimodifikasi secara genetik dapat berguna dalam
okulasi. Dengan menggunakan modifikasi genetik, karakteristik batang bawah, seperti
kemampuan perakaran pada tanah yang berat atau ketahanan terhadap penyakit bawaan tanah,
dapat ditingkatkan. Peningkatan batang bawah seperti itu pada akhirnya akan menghasilkan
kinerja batang atas yang lebih baik.
Aplikasi potensial lain dari batang bawah rekayasa genetika adalah menggunakannya
sebagai sumber pembungkaman gen melalui interferensi RNA (RNAi) (Kalantidis, 2004). RNAi
adalah mekanisme pertahanan alami yang menyebabkan degradasi RNA spesifik sekuens dari
molekul DNA atau RNA asing yang menyerang (seperti yang berasal dari virus) dan juga dapat
digunakan untuk membungkam ekspresi gen endogen tertentu. Telah dibuktikan bahwa sinyal
pembungkaman RNAi pada tanaman bersifat mobile dan dapat menyebar ke seluruh bagian
tanaman (Palauqui et al., 1997). Pada tanaman yang dicangkok, sinyal pembungkaman juga
dapat ditransmisikan melalui cangkok (Sonoda et al., 2000; Crété et al., 2001; Shaharuddin et al.,
2006; Tournier et al., 2006). Oleh karena itu, batang bawah RNAi dapat digunakan untuk
membungkam ekspresi gen spesifik pada batang atas yang tidak dimodifikasi secara genetik.
Bagian ini terbatas pada situasi di mana batang atas yang tidak dimodifikasi secara genetik
dicangkokkan pada batang bawah yang dimodifikasi secara genetik. Situasi sebaliknya, di mana
batang atas dimodifikasi secara genetik, tidak dipertimbangkan karena penerapan teknik
pencangkokan seperti itu belum pernah dilaporkan.
Potensi aplikasi dalam program pemuliaan saat ini

Cangkok biasanya digunakan untuk budidaya komersial pohon buah-buahan, anggur dan
tanaman hias seperti mawar. Sejauh ini, penggunaan batang bawah rekayasa genetika belum
dilaporkan untuk produksi komersial.

Stegemann dan Bock (2009) baru-baru ini melaporkan tentang transfer informasi genetik
plastid dalam cangkok dari sel batang bawah ke sel batang atas dan sebaliknya. Sel-sel chimeric
dipulihkan dari situs cangkok dengan penerapan tekanan seleksi yang kuat. Tidak jelas apakah
informasi genetik ditransfer sebagai fragmen DNA atau sebagai seluruh genom plastid atau
sebagai plastid. Karena pertukaran genetik terbatas pada situs cangkok saja, produk (seperti
bunga dan buah) yang dipanen dari batang bawah yang tidak dimodifikasi secara genetik yang
dicangkokkan pada batang bawah yang dimodifikasi secara genetik tidak akan mengandung
urutan DNA yang direkayasa secara genetik dari batang bawah dan oleh karena itu tidak secara
genetik diubah. Namun, batang atas yang tidak dimodifikasi secara genetik mungkin
mengandung metabolit, protein, dan molekul RNA (kecil) yang diangkut dari batang bawah yang
dimodifikasi secara genetik ke batang atas dan terkait dengan modifikasi genetik. Konsekuensi
dari keberadaan produk transpor terkait rekayasa genetika tersebut bergantung pada sifatnya dan
juga pada kelimpahan produk tersebut. Situasi berikut terjadi setelah mencangkok batang atas
yang tidak dimodifikasi secara genetik pada batang bawah yang dimodifikasi secara genetik. A.
tidak ada transmisi produk
Jika pencangkokan tidak menyebabkan transmisi produk terkait rekayasa genetika ke
batang atas, batang bawah yang dimodifikasi secara genetik tidak akan memiliki konsekuensi
langsung untuk batang atas. B. transmisi RNAi untuk membungkam gen endogen
Dalam kondisi tertentu, penggunaan batang bawah yang dimodifikasi secara genetik yang
mengandung konstruksi RNAi untuk pembungkaman gen akan menghasilkan mobilisasi sinyal
pembungkaman RNAi ke batang atas. Efek pembungkaman pada batang atas dan produknya
bergantung sepenuhnya pada target konstruksi RNAi. Kemungkinan gen target mungkin terlibat
dalam memodifikasi karakteristik kualitas yang memiliki efek langsung pada produk primer
yang akan dipanen, misalnya buah-buahan, tetapi juga efek sekunder setelah perbanyakan klon
atau pencangkokan kembali. Telah ditemukan oleh Sonada et al. (2000) bahwa ketika batang
bawah yang tidak dimodifikasi secara genetik, yang dibungkam sebagai hasil pencangkokan
pada batang bawah pembungkaman (RNAi), dicangkokkan kembali ke batang bawah yang tidak
dimodifikasi secara genetik, fenotipe yang dibungkam dipertahankan dan pembungkaman itu
bahkan ditransmisikan ke batang bawah baru yang tidak dimodifikasi secara genetik. Ini berarti
bahwa pembungkaman RNAi dapat menghasilkan fenotipe batang atas yang diubah secara stabil
(tidak dimodifikasi secara genetik) dan produk yang dipanen dari batang atas yang tidak
dimodifikasi secara genetik mungkin memiliki fenotipe yang diubah yang masih terkait dengan
modifikasi genetik asli.
RNAi-rootstocks juga dapat digunakan untuk memfasilitasi pemuliaan, misalnya dengan
menginduksi pembungaan awal yang disebabkan oleh pembungkaman gen represor bunga yang
dimediasi RNAi (Flachowsky et al., 2007) atau untuk represi rekombinasi meiosis seperti yang
digunakan dalam pemuliaan terbalik (Dirks et al., 2007). al., 2006). Hal itu ditunjukkan oleh
Sonada et al. (2000) bahwa setelah persilangan seksual, keturunan dari batang atas yang tidak
dimodifikasi secara genetik, yang dicangkokkan pada batang bawah yang dimodifikasi secara
genetik (dibungkam), tidak menunjukkan pembungkaman lagi (Sonada et al., 2000). Ini berarti
bahwa sinyal RNAi tidak ditransmisikan ke keturunannya dan bahwa sumber sinyal RNAi tidak
terintegrasi ke dalam genom keturunan. Oleh karena itu, jika pembungkaman RNAi digunakan
untuk membantu pemuliaan, keturunannya dapat dianggap sebagai non-rekayasa genetika karena
keduanya secara genetik dan fenotip mirip dengan rekan-rekan mereka yang tidak dimodifikasi
secara genetik.
Namun sebagai efek samping, pembungkaman RNAi kadang-kadang dapat menginduksi
metilasi DNA yang diarahkan RNA (Mathieu dan Bender, 2004). Metilasi DNA menyebabkan
perubahan pada tingkat DNA atau kromatin dan metilasi daerah yang ditranskripsi dapat
menyebabkan pembungkaman (Hohn et al., 1996) dan peningkatan regulasi (Li et al., 2008;
Shibuya et al., 2009) dari ekspresi gen. Fenotipe terkait metilasi kadang-kadang dapat diwariskan
secara stabil oleh generasi seksual berikutnya, terlepas dari keberadaan transgen (Park et al.,
1996). Jadi, meskipun keturunan yang dihasilkan dapat dianggap sebagai non-genetically
modified, hasil dari modifikasi genetik tersebut masih dapat efektif dalam generasi berikutnya
secara seksual.
C. Transmisi Protein dan Metabolit

Selain nutrisi, getah floem mengandung mRNA, protein dan metabolit. Hoffmann
Benning dkk. (2002) mengidentifikasi dan mengkarakterisasi sejumlah besar protein kecil dalam
eksudat floem, banyak di antaranya terjadi pada konsentrasi rendah. Seperti metabolit, protein
spesifik floem ditranslokasikan ke dalam floem dan telah terbukti dapat ditransmisikan melalui
cangkok (Golecki et al., 1998, 1999). Dut dkk. (2007) membuktikan adanya protein transgenik
pada tanaman anggur non transgenik yang dicangkokkan pada batang bawah yang menghasilkan
protein antimikroba transgenik. Tergantung pada sifat gen yang digunakan untuk modifikasi
batang bawah yang dimodifikasi secara genetik, konsekuensi dari transmisi metabolit dan protein
terkait modifikasi genetik bisa sangat berbeda. Misalnya, metabolit seperti auksin dan sitokinin
memiliki fungsi pensinyalan jarak jauh dan mungkin memiliki efek hilir yang luas pada fisiologi
batang atas. Juga protein seperti faktor transkripsi atau faktor protein lain yang terlibat dalam
regulasi gen dapat diangkut dan mengerahkan aksinya pada jarak jauh. Misalnya, sinyal transisi
bunga yang baru ditemukan tampaknya merupakan faktor protein yang diangkut dari daun ke
pucuk pucuk (Corbesier et al., 2007).
Secara keseluruhan, jelas bahwa konsekuensi pencangkokan batang atas yang tidak
dimodifikasi secara genetik pada batang bawah yang dimodifikasi secara genetik dapat agak
beragam dan evaluasi kasus per kasus diperlukan untuk mengevaluasi konsekuensi ini.
Metode untuk penyaringan ada/tidaknya konstruksi gen yang digunakan

Teknik PCR standar dapat digunakan untuk mengkonfirmasi keberadaan transgen ke
dalam batang bawah. Karena batang atas tidak dimodifikasi secara genetik, tidak perlu
menyaring produk yang dipanen dari batang atas untuk mengetahui ada atau tidaknya transgen.
Perbandingan produk akhir dari teknik pemuliaan baru dan tanaman budidaya konvensional Jika
batang atas yang tidak dimodifikasi secara genetik dicangkokkan pada batang bawah yang
dimodifikasi secara genetik, produk yang dipanen dari batang atas yang tidak dimodifikasi secara
genetik dapat memiliki perubahan fenotipe yang terkait dengan modifikasi genetik. Konsekuensi
dari fenotipe yang diubah tergantung pada sifat modifikasi genetik batang bawah.
Dalam hal efek modifikasi sepenuhnya terbatas pada batang bawah, produk akhir akan serupa
dengan produk dari rekan-rekan yang dibiakkan secara konvensional (seperti halnya situasi a.
dari paragraf sebelumnya).
Jika batang bawah pembungkaman RNAi digunakan untuk membantu pemuliaan melalui
pembungkaman gen di batang atas (misalnya untuk pemuliaan terbalik atau induksi bunga awal;
situasi b. dari paragraf sebelumnya), keturunannya dapat dianggap sebagai tidak termodifikasi
secara genetik dan mirip dengan keturunan dari pasangannya yang tidak dimodifikasi secara
genetik. Namun, jika pembungkaman RNAi telah menyebabkan metilasi DNA target, fenotipe
terkait metilasi kadang-kadang dapat diwarisi secara stabil oleh generasi seksual berikutnya.
Tergantung pada jenis gen yang dibungkam, efeknya pada produk akhir mungkin berbeda. Oleh
karena itu evaluasi kasus per kasus dari efek yang diharapkan dari kemungkinan metilasi DNA
yang diarahkan RNA yang ditransmisikan ke keturunannya diperlukan. Jika pencangkokan
menghasilkan transmisi protein dan metabolit dari batang bawah yang dimodifikasi secara
genetik ke batang atas (situasi c. dari paragraf sebelumnya), ini dapat mengakibatkan keragaman
konsekuensi, tergantung pada sifat gen yang digunakan untuk genetik. modifikasi. Evaluasi
kasus per kasus diperlukan untuk mengevaluasi konsekuensi ini dan referensi dasar yang sesuai
harus digunakan untuk membandingkan cangkok dengan.
Karena sedikit yang diketahui tentang transmisi metabolit dan protein (yaitu efisiensi
transportasi, ukuran dan/atau muatan, jarak, akumulasi) molekul yang diangkut dari batang
bawah ke batang atas, penelitian lebih lanjut diperlukan mengenai hal ini sebelum kesimpulan
umum dapat ditarik. .
Salah satu konsekuensi pelepasan tanaman rekayasa genetika ke lingkungan adalah aliran gen
dari tanaman rekayasa genetika ke tanaman yang kompatibel secara silang atau dibudidayakan
melalui penyebaran serbuk sari rekayasa genetika. Karena pada tanaman cangkokan batang atas
biasanya merupakan bagian yang menghasilkan bunga, aliran gen transgen tidak terjadi. Dalam
kasus pembungkaman batang bawah yang dimediasi RNAi telah menyebabkan metilasi DNA
yang diarahkan RNA dari gen target dalam batang atas yang tidak dimodifikasi secara genetik,
fenotipe terkait metilasi kadang-kadang dapat stabil diwarisi oleh generasi seksual berikutnya.
Jika fenotipe terkait metilasi diharapkan memiliki efek, tidak adanya efek pembungkaman pada
keturunannya harus ditentukan, sebelum dimasukkan ke lingkungan.
Akibat lainnya adalah hasil interaksi batang bawah hasil rekayasa genetika dengan
lingkungan tanah. Tergantung pada sifat modifikasi genetik, hal ini mungkin berdampak pada
organisme tanah, yang mengarah pada perubahan keanekaragaman hayati tanah (lihat makalah
opini oleh Lilley et al., 2006). Sebagai garis cangkok dasar dari batang bawah dan batang atas
non-GM dapat digunakan. Sejauh transmisi metabolit dan protein dari batang bawah ke batang
atas yang bersangkutan sangat tergantung pada sifat dan konsentrasi senyawa ini apakah mereka
menimbulkan masalah lingkungan yang potensial. Jika senyawa tersebut diketahui dan terdapat
pada spesies tanaman lain, maka seseorang dapat menggunakannya sebagai dasar untuk
menentukan apakah senyawa tersebut merupakan masalah lingkungan.

Jika dalam pencangkokan batang bawah yang dimodifikasi secara genetik dan batang atas
yang tidak dimodifikasi secara genetik, efek modifikasi genetik terbatas pada batang bawah, dan
produk dari batang bawah yang tidak dimodifikasi digunakan untuk konsumsi, konsekuensi
untuk keamanan pangan dan pakan akan sebanding dengan baseline.
Jika pencangkokan mengarah pada perubahan terkait modifikasi genetik dari batang atas, sebagai
akibat dari transmisi sinyal RNAi, protein atau metabolit, konsekuensinya bisa sangat beragam.
Konsekuensinya sepenuhnya tergantung pada sifat modifikasi genetik dan oleh karena itu tidak
dapat dipertimbangkan secara umum. Dalam situasi seperti itu, pertimbangan kasus per kasus
dan perbandingan dengan baseline yang sesuai harus diterapkan dan metode analisis yang
berbeda, termasuk proteomik dan metabolomik harus digunakan. Sebagai dasar tanaman yang
dicangkokkan atau tidak dicangkokkan yang tidak dimodifikasi secara genetik dapat digunakan.
Cangkok interspesifik mungkin menjadi referensi dasar yang informatif. Dalam sejumlah
cangkok yang menggabungkan spesies mentimun yang berbeda, protein yang spesifik untuk
spesies batang bawah juga terlihat jelas di batang atas (Golekki et al., 1998). Protein ini tidak asli
dari tanaman yang batang atas telah diperoleh. Zhang dkk. (2008) menunjukkan efek batang
bawah yang luas pada ekspresi gen batang atas dalam cangkokan interspesifik batang atas terong
pada batang bawah tomat. Kedua referensi menunjukkan kemungkinan efek pencangkokan skala
besar, bahkan ketika menggabungkan tanaman yang tidak dimodifikasi secara genetik dan
menekankan pentingnya memilih referensi dasar yang sesuai.
Cisgenesis
Cisgenesis adalah produksi tanaman yang dimodifikasi secara genetik menggunakan
DNA donor dari spesies itu sendiri atau dari spesies yang kompatibel secara silang. DNA yang
baru diperkenalkan adalah fragmen genom alami yang tidak berubah yang mengandung gen yang
diinginkan bersama dengan intronnya sendiri dan sekuens pengatur, seperti sekuens DNA
promotor gen dan terminator gen. DNA yang diintroduksi bebas dari DNA vektor, dengan
pengecualian urutan perbatasan T-DNA yang mengapit urutan DNA cisgenik.
Cisgenesis merupakan metode modifikasi genetik dengan menggunakan sekuens gen
donor dari spesies itu sendiri atau menggunakan gen donor dari spesies donor alami yang dapat
disilangkan (Schouten et al., 2006). Gen-gen donor ini misalnya dapat mengkodekan gen-gen
ketahanan penyakit yang ditemukan pada spesies-spesies yang berkerabat liar, tetapi juga alel-
alel yang bermanfaat dalam spesies tersebut dapat ditransfer dari satu genotipe ke genotipe
lainnya. Karena perkembangan saat ini dalam teknik sekuensing DNA skala besar mengarah
pada peningkatan jumlah gen yang diisolasi dan dikarakterisasi secara eksponensial, cisgenesis
akan memiliki potensi besar sebagai metode modifikasi genetik untuk perbaikan tanaman di
masa depan. Dalam cisgenesis, satu atau lebih gen asli digunakan dalam modifikasi genetik,
termasuk intronnya sendiri dan diapit oleh daerah yang tidak diterjemahkan (UTR) 5'- dan 3'-nya
serta urutan promotor dan terminator, semuanya dalam konteks alaminya (lihat Gambar 2). ).
Gambar 2. Struktur gen asli yang khas. Gen adalah bagian dari kromosom dan terdiri dari
promotor dan terminator, 5'- dan 3'-daerah yang tidak diterjemahkan (UTR) dan ekson dan
intron. Promotor dan terminator adalah urutan DNA pengatur yang mengandung informasi untuk
ekspresi gen dalam waktu, ruang dan intensitas. Sebelum translasi menjadi protein, bagian dari
gen ditranskripsi (disalin) menjadi molekul mirip DNA perantara yang disebut RNA. Selama
proses ini, semua ekson akan menyatu dan membentuk urutan pengkodean protein.
Salah satu karakteristik penting dari cisgenesis adalah bahwa fenotipe akhir tanaman
cisgenik juga dapat dicapai dengan pemuliaan konvensional, tetapi dalam jangka waktu yang
lebih lama. Dalam pemuliaan konvensional selalu sejumlah hambatan hubungan akan terjadi
(Jacobsen dan Schouten, 2007).
Linkage drag adalah transfer simultan dari sekuens DNA yang tidak diinginkan yang
terkait dengan gen yang diinginkan, dan jumlah linkage drag dapat dikurangi dengan melakukan
back-crossing berulang kali. Hal ini membuat pemuliaan konvensional menjadi pendekatan yang
sulit untuk meningkatkan tanaman dengan waktu generasi yang lama, seperti spesies pohon
buah-buahan, atau tanaman dengan genetika kompleks (poliploidi, diperbanyak secara vegetatif),
seperti kentang. Perbedaan utama antara pemuliaan konvensional dan cisgenesis adalah bahwa
dalam cisgenesis gen yang baru diperkenalkan akan dimasukkan sebagai salinan gen tambahan
pada posisi acak dalam genom target. Konteks genomik baru dari penyisipan semacam itu sering
diklaim, setidaknya sebagian, bertanggung jawab atas variabilitas yang diamati dalam ekspresi
gen baru, dan disebut sebagai 'efek posisi'. Integrasi acak dari gen baru juga dapat berpengaruh
pada ekspresi gen yang terletak pada genom penerima di sekitar lokasi integrasi. Penyisipan itu
sendiri dapat mengganggu gen penerima, dan elemen peningkat atau pembungkaman yang
mungkin menjadi bagian dari promotor gen yang baru diperkenalkan mungkin memiliki efek
peningkatan atau pembungkaman pada ekspresi gen penerima (Tani et al., 2004) . Karena
generasi tanaman rekayasa genetika adalah proses yang agak tidak efisien, produksi tanaman
rekayasa genetika biasanya melibatkan langkah seleksi untuk memisahkan tanaman rekayasa
genetika dari tanaman yang belum menerima donor-DNA. Cara yang paling umum untuk seleksi
adalah penggunaan gen resistensi antibiotik atau gen resistensi herbisida yang dimasukkan ke
dalam tanaman bersama dengan gen donor. Namun, karena gen seleksi tersebut biasanya berasal
dari luar negeri, gen seleksi ini tidak dapat digunakan untuk cisgenesis.

Cisgenesis masih dalam tahap penelitian, tetapi mungkin menemukan aplikasi
pertamanya dalam 10 tahun mendatang. Penelitian saat ini di Belanda melibatkan
cisgenesis pada apel dan kentang menggunakan gen tahan penyakit yang berasal dari
spesies liar yang dapat disilangkan.

Tanaman cisgenik diperkaya dengan penambahan satu atau lebih gen yang berasal
dari spesies itu sendiri atau dari spesies yang kompatibel secara silang. Pada prinsipnya
tanaman dengan genotipe dan fenotipe yang sama dapat dicapai dengan pemuliaan
konvensional (Schouten et al., 2006), dengan asumsi bahwa gen yang diperkenalkan pada
tanaman cisgenik telah ditransfer bersama-sama dengan lingkungan regulasi penuhnya
sendiri. Promotor gen sulit untuk dikarakterisasi dan paling sering panjang promotor tidak
ditentukan dengan baik. Mereka terdiri dari serangkaian elemen pengatur positif dan
negatif yang mengatur ekspresi gen dalam tindakan bersama. Elemen-elemen ini
umumnya terletak di dalam fragmen DNA dari 500-1000 pasangan basa yang terletak
langsung di hulu gen (Barta et al., 2005), tetapi promotor dapat memiliki elemen pengatur
yang diposisikan beberapa kilo basa jauhnya dari situs awal transkripsi (Goñi dkk., 2007).
Isolasi cisgen dengan panjang urutan promotor yang tidak mencukupi dapat
mengakibatkan penyimpangan ekspresi gen jika dibandingkan dengan situasi alami
(Szankowski et al., 2009). Penyisipan sekuens DNA donor pada tanaman rekayasa
genetika membawa konsekuensi spesifik yang terkait dengan jenis dan posisi penyisipan
sekuens donor. Sering diamati bahwa banyak salinan dari urutan donor diintegrasikan ke
dalam genom penerima. Salinan ini mungkin terletak di lokus yang berbeda, tetapi juga
(langsung atau terbalik) pengulangan urutan donor pada satu lokus sering ditemukan.
Kehadiran beberapa penyisipan dapat memiliki efek yang signifikan pada kualitas dan
tingkat ekspresi gen yang diperkenalkan. Namun, banyak gen asli juga hadir dalam bentuk
duplikat dalam genom tanaman. Karena, ekspresi cisgen pada tanaman dengan jumlah
salinan cisgen tunggal atau rendah biasanya (tetapi tidak selalu) sesuai dengan garis dasar
lebih baik daripada ekspresi cisgen pada tanaman dengan jumlah salinan cisgen tinggi,
tanaman dengan penyisipan nomor salinan rendah lebih disukai dipilih. . Konsekuensi
terkait integrasi lainnya adalah kemungkinan penyisipan cisgen ke dalam gen yang ada.
Ini menciptakan kemungkinan bahwa urutan yang dimasukkan menjadi bagian dari
kerangka baca terbuka yang ada, menghasilkan potensi produksi protein chimeric baru.
Kemungkinan besar ekspresi gen yang ditargetkan akan terganggu karena
mutagenesis penyisipan. Integrasi acak cisgene dalam genom penerima dapat
menyebabkan apa yang disebut efek posisi. Efek ini digunakan untuk menggambarkan
variasi dalam ekspresi transgen identik (atau cisgenes atau intragenes) yang disisipkan ke
berbagai daerah genom. Perbedaan ekspresi sering disebabkan oleh enhancer yang
mengatur ekspresi gen tetangga dalam genom penerima. Enhancer lokal ini juga dapat
mempengaruhi pola ekspresi gen yang baru diperkenalkan. Sebaliknya, gen yang baru
diperkenalkan juga dapat mempengaruhi ekspresi gen dari genom penerima jika mereka
berada di sekitar lokasi integrasi. Awalnya, efek posisi digambarkan sebagai hasil dari
penataan ulang kromosom struktural spontan yang mengarah pada perubahan posisi gen
dan yang dalam banyak kasus dapat mengakibatkan perubahan ekspresi gen (Papazova
dan Gecheff, 2003).
Konsekuensi lain adalah bahwa, ketika memanfaatkan Agrobacterium
transformasi yang dimediasi, bersama dengan cisgene, sejumlah kecil DNA asing akan
ditransfer ke genom tanaman. Ini menyangkut apa yang disebut urutan perbatasan T-DNA
kanan dan kiri (RB dan LB resp.). Sekuens DNA ini hanya sepanjang 24 bp dan mengapit
cisgene pada vektor transformasi tanaman. Biasanya, hanya sebagian dari RB panjang
penuh (yaitu 3 bp) dan LB (21bp) yang ditemukan kembali pada tanaman rekayasa
genetika setelah Agrobacteriumtransformasi yang dimediasi. Akan tetapi, untuk LB,
seringkali urutan lengkapnya dapat dilacak kembali, dan jika demikian, seringkali
bersama-sama dengan beberapa panjang DNA vektor transformasi. Jika urutan RB dan
LB menjadi bagian dari kerangka baca terbuka (dari gen penerima), mereka dapat
diterjemahkan ke dalam protein sebagai bagian dari protein fusi. Situasi seperti itu tidak
diinginkan dan harus disaring dengan menyelidiki sifat urutan genom penerima yang
mengapit sisipan T-DNA.
Metode untuk penyaringan ada/tidaknya konstruksi gen yang digunakan

Teknik PCR standar cocok untuk mengkonfirmasi keberadaan sekuens terkait
modifikasi genetik ke dalam tanaman cisgenik. PCR juga dapat digunakan untuk
memeriksa keberadaan sekuens DNA yang tidak diinginkan yang berasal dari vektor
transformasi tanaman. Di samping ini, analisis DNA-gel blot (juga disebut Southern blot),
menggunakan tulang punggung vektor T-DNA lengkap yang digunakan untuk modifikasi
genetik sebagai penyelidikan, dapat memberikan bukti tambahan untuk status cisgenik
dari galur yang dipilih. Jumlah salinan cisgene yang dimasukkan ke dalam genom
penerima juga dapat ditentukan dengan menggunakan DNA-gel blotting menggunakan
urutan DNA cisgene sebagai probe, tetapi kita harus menyadari bahwa salinan gen
homolog endogen juga akan dideteksi menggunakan teknik seperti itu. Selain itu, PCR
kuantitatif (qPCR) dapat digunakan untuk memperkirakan jumlah salinan cisgen. Untuk
menyelidiki apakah cisgene telah dimasukkan ke dalam gen penerima atau tidak, teknik
seperti genome walking atau inverse PCR (iPCR) dapat digunakan untuk memperkuat
urutan DNA yang mengapit cisgene ke dalam genom penerima. Namun karena T-DNA
yang diperkenalkan identik dengan apa yang mungkin ada setelah pemuliaan introgresi,
ini seharusnya tidak menjadi masalah. Namun hal itu mungkin memberikan kesempatan
untuk mendapatkan bukti tambahan tentang tidak adanya urutan tulang punggung vektor
T-DNA dan Agrobacterium urutan DNA kromosomyang mungkin telah ditransfer
bersama dengan T-DNA.
Perbandingan produk akhir dari teknik pemuliaan baru dan tanaman yang
dibiakkan secara konvensional Cisgenes sudah menjadi bagian dari kumpulan gen
tanaman penerima dan oleh karena itu mereka juga dapat ditransfer melalui pemuliaan
konvensional. Namun ada beberapa perbedaan antara produk akhir yang diperoleh dengan
cisgenesis dan pemuliaan konvensional. Pada tanaman cisgenik, cisgen akan hadir sebagai
salinan gen tambahan. Selanjutnya cisgene akan disisipkan pada posisi acak dalam genom
penerima, yang mungkin mempengaruhi ekspresi cisgen dalam kuantitas dan kualitas bila
dibandingkan dengan gen dalam konteks genom alaminya. Ini biasanya tidak berarti
bahwa ada perbedaan yang melekat dalam hal tingkat dan waktu ekspresi. Tes dasar untuk
menetapkan bandwidth ekspresi cisgene harus dapat mengetahui apakah ekspresi ini
berbeda secara signifikan dari yang ada di pabrik aslinya.
Penyisipan cisgene dapat mengakibatkan mutasi pada genom penerima di tempat
penyisipan (Forsbach et al., 2003). Mutasi semacam itu biasanya menyebabkan gangguan
fungsi gen dalam genom penerima dan dengan demikian dapat menyebabkan efek
fenotipik. Di samping ini, gen yang baru diperkenalkan juga dapat mempengaruhi
ekspresi gen dari genom penerima jika mereka berada di sekitar lokasi integrasi. Namun,
kedua efek integrasi cisgene adalah fenomena alam yang terjadi selama transisi
transposon (Greco et al., 2001) dan pemuliaan translokasi, masing-masing (Papazova dan
Gecheff, 2003).
Akhirnya, bersama dengan cisgene, beberapa sekuens non-coding kecil yang
berasal dari vektor transformasi, seperti sekuens perbatasan T-DNA, akan ditransfer
ke genom penerima. Urutan ini dapat menjadi bagian dari kerangka pembacaan
terbuka jika T-DNA telah dimasukkan ke dalam gen penerima, dan menghasilkan
protein chimeric baru.
Cisgen sudah menjadi bagian dari kumpulan gen tanaman penerima dan oleh
karena itu mereka juga dapat ditransfer melalui pemuliaan konvensional. Namun ada
kemungkinan bahwa ekspresi cisgen berbeda dari ekspresi gen endogen ketika berada
dalam posisi genomik alami, misalnya melalui efek posisi yang dijelaskan, dan ini dapat
menyebabkan perbedaan fenotipe. Karena efek posisi adalah fenomena yang terjadi secara
alami, pada tanaman cisgenik hal ini diperkirakan tidak akan berdampak pada lingkungan.
Tentu saja ekspresi cisgene harus diperiksa dan dibandingkan dengan baseline. Tanaman
yang dibiakkan secara konvensional dan spesies terkait dari mana cisgen telah diisolasi
dapat digunakan sebagai baseline.
Proses integrasi acak dapat menyebabkan cisgen berintegrasi ke dalam gen genom
penerima. Ini kemungkinan besar akan mengarah pada mutagenesis penyisipan gen di
mana cisgene telah terintegrasi. Bagian dari genom resipien yang mengapit T-DNA yang
disisipkan harus diurutkan untuk menunjukkan bahwa cisgene telah terintegrasi di luar
gen genom resipien. Sebagai konsekuensi dari metode transformasi yang digunakan,
fragmen RB dan LB akan diintegrasikan ke dalam genom tanaman bersama dengan
cisgen. Urutan pendek ini pada dasarnya non-coding dan tidak mungkin memiliki efek
fenotipik (Schouten et al., 2006). Jika variasi ekspresi cisgen berada dalam kisaran variasi
ekspresi gen yang sesuai dalam konteks genomik alaminya, dan ketika tidak ada gen
penerima yang bermutasi sebagai akibat dari integrasi cisgen, dan ketika RB dan LB
belum menjadi bagian dari kerangka baca terbuka, tanaman cisgenik mirip dengan
tanaman yang dibiakkan secara konvensional. Tanaman yang dibiakkan secara
konvensional seperti itu dapat berfungsi sebagai dasar.

Tujuan dari cisgenesis adalah untuk meningkatkan varietas tanaman elit yang ada
dengan karakteristik baru yang berharga. Untuk ini, satu atau beberapa gen dari spesies
yang dapat disilangkan dimasukkan ke dalam varietas elit dengan riwayat makanan yang
aman. Namun ada kemungkinan bahwa ekspresi cisgen berbeda dari ekspresi gen endogen
ketika berada dalam posisi genomik alami, misalnya melalui efek posisi yang dijelaskan,
dan ini dapat menyebabkan perbedaan fenotipe. Karena efek posisi adalah fenomena yang
terjadi secara alami, pada tanaman cisgenik hal ini diperkirakan tidak akan berdampak
pada lingkungan. Tentu saja ekspresi cisgene harus diperiksa dan dibandingkan dengan
baseline. Tanaman yang dibiakkan secara konvensional dan spesies terkait dari mana
cisgen telah diisolasi dapat digunakan sebagai baseline.
Proses integrasi acak dapat menyebabkan cisgen berintegrasi ke dalam gen genom
penerima. Ini kemungkinan besar akan mengarah pada mutagenesis penyisipan gen di
mana cisgene telah terintegrasi. Bagian dari genom resipien yang mengapit T-DNA yang
disisipkan harus diurutkan untuk menunjukkan bahwa cisgene telah terintegrasi di luar
gen genom resipien. Sebagai konsekuensi dari metode transformasi yang digunakan,
fragmen RB dan LB akan diintegrasikan ke dalam genom tanaman bersama dengan
cisgen. Urutan pendek ini pada dasarnya non-coding dan tidak mungkin memiliki efek
fenotipik (Schouten et al., 2006). Jika variasi ekspresi cisgen berada dalam kisaran variasi
ekspresi gen yang sesuai dalam konteks genomik alaminya, dan ketika tidak ada gen
penerima yang bermutasi sebagai akibat dari integrasi cisgen, dan ketika RB dan LB
belum menjadi bagian dari kerangka baca terbuka, tanaman cisgenik mirip dengan
tanaman yang dibiakkan secara konvensional. Tanaman yang dibiakkan secara
konvensional seperti itu dapat berfungsi sebagai dasar.
Intragenesis
Intragenesis adalah produksi tanaman yang dimodifikasi secara genetik dengan
menggunakan DNA donor dari spesies itu sendiri atau dari spesies yang kompatibel secara
silang. Perbedaan dengan cisgenesis adalah bahwa intragenesis memungkinkan terciptanya
kombinasi baru fragmen DNA yang semuanya berasal dari spesies itu sendiri atau dari spesies
yang kompatibel secara silang. Dalam intragenesis juga vektor transformasi itu sendiri dapat
terdiri dari fragmen DNA fungsional dari genom spesies tanaman target.
Deskripsi teknis teknik

Seperti cisgenesis, intragenesis adalah metode modifikasi genetik menggunakan
urutan gen donor dari spesies itu sendiri atau menggunakan gen donor dari spesies donor
alami yang dapat disilangkan. Perbedaannya dengan cisgenesis adalah bahwa dalam
intragenesis gen baru dapat dibuat 'in vitro' dengan menggabungkan elemen genetik
fungsional seperti promotor, bagian pengkode (dengan atau tanpa intron) dan terminator
gen alami, dan memasukkan gen chimeric baru ini ke varietas yang ada ( Rommens et al.,
2004, 2006, 2007; Conner et al., 2007; Schouten dan Jacobsen 2008). Intragenesis juga
memungkinkan penggunaan pengulangan DNA terbalik untuk interferensi RNA (RNAi)
dengan tujuan pembungkaman gen.
Rommen dkk. (2004) menunjukkan bahwa urutan seperti T-DNA fungsional hadir
dalam genom tanaman (disebut P-DNA). P-DNA ini dapat menggantikan
Agrobacteriumsekuens T-DNA turunanyang merupakan bagian penting dari vektor
transformasi tanaman. Rommen dkk. (2006) memperkenalkan istilah transformasi DNA
asli untuk transformasi menggunakan intragen yang dikombinasikan dengan P-DNA
spesifik spesies sehingga DNA asli secara eksklusif dimasukkan ke dalam genom
tanaman. Untuk transformasi DNA asli, Rommens et al. (2006, 2007) menggabungkan P-
DNA dengan Agrobacterium vektor biner. Conner dkk. (2007) membangun vektor
transformasi spesifik spesies yang sepenuhnya terdiri dari fragmen DNA tanaman
fungsional dari genom spesies tanaman penerima. Mereka berargumen bahwa
menggunakan vektor yang seluruhnya berasal dari sekuens tanaman akan menghasilkan
tanaman yang diubah yang tidak pernah mengandung DNA asing, terlepas dari apakah
peristiwa transformasi melampaui wilayah T (atau P)-DNA. Berbeda dengan cisgenesis,
fenotip akhir tanaman intragenik tidak selalu dapat dicapai dengan pemuliaan
konvensional. Jika misalnya kombinasi baru dari elemen pengatur dan urutan pengkodean
protein telah dibuat, tingkat ekspresi dan pola kombinasi gen baru mungkin berbeda dari
situasi alami. Dalam kasus intragenesis bertujuan membungkam gen tunggal melalui
RNAi, fenotipe serupa dapat diperoleh dengan pemuliaan mutasi.
Di AS, produksi tanaman kentang intragenik, di mana tiga gen berbeda
dibungkam melalui RNAi, diterbitkan (Rommens et al., 2006). Ini dicapai dengan
menggabungkan fragmen DNA fungsional dari setidaknya 7 gen kentang yang berbeda
dalam konstruksi transformasi yang mengarah pada produksi kentang yang
ditingkatkan kualitasnya. Di Kanada, intragenesis saat ini sedang digunakan untuk
mengembangkan apel yang tidak kecoklatan dengan mentransformasikannya dengan
konstruksi peredam RNAi terhadap gen polifenol oksidase
apel (www.okanaganbiotechnology.com). Proyek intragenesis lain yang sedang
berlangsung di Selandia Baru mengembangkan ryegrass toleran kekeringan (Lolium
perenne) yang mengekspresikan gen toleransi garam asli
secara(berlebihanwww.isb.vt.edu/articles/aug0601.htm;). Contoh-contoh ini
menunjukkan bahwa intragenesis berkembang menuju metode yang dapat diterapkan
dalam waktu dekat, setidaknya di luar Eropa.
Fitur khusus dari penerapan teknik

Kemungkinan kombinasi baru dari elemen genetik fungsional yang ada pada
tanaman intragenik tidak ada di alam dan tidak mungkin mereka muncul secara spontan
atau sebagai hasil dari pemuliaan konvensional. Tergantung pada urutan regulasi dan
pengkodean yang digunakan untuk modifikasi genetik, ekspresi gen dapat menyimpang
jauh dalam tingkat dan pola dari situasi alami seperti yang ditemukan pada tanaman yang
dibiakkan secara konvensional. Oleh karena itu, evaluasi kasus per kasus diperlukan
untuk membahas konsekuensi dari teknik yang diterapkan, terutama jika tujuan
intragenesis adalah untuk mengubah tingkat ekspresi dan pola gen asli. Dalam kasus
intragenesis ditujukan untuk membungkam gen asli, fenotipe serupa dapat diperoleh
melalui pemuliaan mutasi. Secara umum, konsekuensi pembungkaman akibat intragenesis
tidak berbeda dengan pemuliaan mutasi yang mengarah pada mutasi knock-out.
Penyisipan sekuens DNA donor pada tanaman rekayasa genetika membawa konsekuensi
spesifik yang terkait dengan jenis dan posisi penyisipan sekuens donor. Sering diamati
bahwa banyak salinan dari urutan donor diintegrasikan ke dalam genom penerima.
Salinan ini mungkin terletak di lokus yang berbeda, tetapi juga (langsung atau terbalik)
pengulangan urutan donor pada satu lokus sering ditemukan. Kehadiran beberapa
penyisipan dapat memiliki efek yang signifikan pada kualitas dan tingkat ekspresi gen
yang diperkenalkan. Namun, banyak gen asli juga hadir dalam bentuk duplikat dalam
genom tanaman. Karena, ekspresi intragen pada tanaman dengan nomor salinan cisgen
tunggal atau rendah biasanya (tetapi tidak selalu) sesuai dengan garis dasar lebih baik
daripada ekspresi intragen pada tanaman dengan nomor salinan intragen tinggi, tanaman
dengan penyisipan nomor salinan rendah lebih disukai dipilih. . Konsekuensi terkait
integrasi lainnya adalah kemungkinan penyisipan intragen ke dalam gen yang ada. Ini
menciptakan kemungkinan bahwa urutan yang dimasukkan menjadi bagian dari kerangka
baca terbuka yang ada, menghasilkan potensi produksi protein chimeric baru. Lebih
mungkin gen yang ditargetkan akan terganggu karena mutagenesis penyisipan.
Integrasi acak cisgene dalam genom penerima dapat menyebabkan apa yang
disebut efek posisi. Efek ini digunakan untuk menggambarkan variasi dalam ekspresi
transgen identik (atau cisgenes atau intragenes) yang disisipkan ke berbagai daerah
genom. Perbedaan ekspresi sering disebabkan oleh enhancer yang mengatur ekspresi gen
tetangga dalam genom penerima. Enhancer lokal ini juga dapat mempengaruhi pola
ekspresi gen yang baru diperkenalkan. Sebaliknya, gen yang baru diperkenalkan juga
dapat mempengaruhi ekspresi gen dari genom penerima jika mereka berada di sekitar
lokasi integrasi. Awalnya, efek posisi digambarkan sebagai hasil dari penataan ulang
kromosom struktural spontan yang mengarah pada perubahan posisi gen dan yang dalam
banyak kasus dapat mengakibatkan perubahan ekspresi gen (Papazova dan Gecheff,
2003).
Seperti pada Agrobacteriumtransformasi yang dimediasimenggunakan vektor
T-DNA, dengan menggunakan vektor P-DNA, urutan DNA yang mengapit intragen
juga akan berintegrasi ke dalam genom tanaman. Karena P-DNA berasal dari spesies
itu sendiri, tidak ada konsekuensi yang diharapkan dari integrasi urutan tersebut.
Rekombinasi yang dihasilkan mirip dengan yang muncul oleh penataan ulang genom
yang disebabkan oleh mutagenesis.
Metode untuk skrining ada/tidaknya konstruksi gen yang digunakan

Teknik PCR standar cocok untuk mengkonfirmasi keberadaan sekuens terkait
modifikasi genetik ke dalam tanaman intragenik. Jumlah salinan intragen yang
dimasukkan ke dalam genom penerima dapat ditentukan dengan menggunakan analisis
DNA-gel blot (juga disebut Southern blot) menggunakan urutan DNA intragenik
sebagai probe, tetapi kita harus menyadari bahwa salinan gen homolog endogen juga
dapat dideteksi menggunakan seperti itu. teknik. Selain itu, PCR kuantitatif (qPCR)
dapat digunakan untuk memperkirakan jumlah salinan intragen. Untuk menyelidiki
apakah intragen telah dimasukkan ke dalam gen penerima atau tidak, teknik seperti
genome walking atau inverse PCR (iPCR) dapat digunakan untuk memperkuat urutan
DNA yang mengapit P-DNA ke dalam genom penerima. Ini akan menunjukkan apakah
P-DNA yang diperkenalkan telah dimasukkan ke dalam gen penerima atau tidak.
Selanjutnya, ini memberikan bukti tambahan tentang tidak adanya urutan tulang
punggung vektor (dalam hal vektor belum sepenuhnya diturunkan dari DNA genom
spesies penerima) dan Agrobacterium urutan DNA kromosomyang mungkin telah
ditransfer bersama dengan P-DNA .
Perbandingan produk akhir dari teknik pemuliaan baru dan tanaman budidaya
konvensional Gen yang disisipkan melalui intragenesis adalah kombinasi baru dari
elemen genetik fungsional, tetapi semuanya berasal dari asal asli. Karena kombinasi
baru, ekspresi intragen dapat menyimpang dari situasi alami seperti yang ditemukan
dalam referensi dasar. Karena kombinasi baru ini biasanya tidak ada dalam situasi
alami, tidak ada perbandingan umum dengan tanaman yang dibiakkan secara
konvensional, dan studi kasus per kasus diperlukan. Di sebelah ini aspek seperti nomor
salinan dari intragen yang dimasukkan dan posisi integrasi dalam genom penerima
mungkin memiliki efek tambahan pada variabilitas ekspresi intragen. Dalam kasus
intragenesis ditujukan untuk membungkam gen endogen tunggal, produk akhir dapat
dibandingkan dengan mutan knock-out yang diperoleh dengan pemuliaan mutasi.
Penyisipan intragen dapat mengakibatkan mutasi pada genom penerima di tempat
penyisipan (Forsbach et al., 2003). Mutasi semacam itu biasanya menyebabkan gangguan
fungsi gen dalam genom penerima dan dengan demikian dapat menyebabkan efek
fenotipik. Di samping ini, gen yang baru diperkenalkan juga dapat mempengaruhi
ekspresi gen dari genom penerima jika mereka berada di sekitar lokasi integrasi. Namun,
kedua efek integrasi intragen adalah fenomena alam yang terjadi selama transisi
transposon (Greco et al., 2001) dan pemuliaan translokasi, masing-masing (Papazova dan
Gecheff, 2003).
Proses integrasi acak dapat menyebabkan intragen berintegrasi ke dalam gen
genom penerima. Ini kemungkinan besar akan mengarah pada mutagenesis penyisipan
gen di mana intragen telah terintegrasi. Bagian dari genom penerima yang mengapit T-
DNA yang disisipkan harus diurutkan untuk menunjukkan bahwa intragen telah
terintegrasi dengan gen luar dari genom penerima.
Karena sifat rekombinan mereka, ekspresi intragen diharapkan tidak selalu sesuai
dengan ekspresi gen asli yang sesuai dalam posisi genom alami mereka. Di samping ini
mungkin ada variabilitas dalam ekspresi intragen yang disebabkan oleh efek posisi.
Tergantung pada sifat intragen dan dampak dari efek posisi, ini mungkin memiliki
konsekuensi yang berbeda bagi lingkungan jika dibandingkan dengan baseline. Ini berarti
bahwa untuk intragenesis tidak ada pernyataan umum tentang konsekuensi bagi
lingkungan yang dapat dibuat dan evaluasi kasus per kasus diperlukan. Sebagai dasar,
tanaman yang dibiakkan secara konvensional milik spesies yang sama atau kompatibel
secara seksual dapat digunakan.
Jika intragenesis secara khusus ditujukan untuk membungkam gen endogen
tunggal, tanaman intragenik mungkin sebanding dengan tanaman dengan mutasi knock-
out yang diperoleh dengan pemuliaan mutasi. Tanaman seperti itu dapat digunakan
sebagai dasar. Secara umum, konsekuensi intragenesis yang ditujukan pada
pembungkaman gen dari satu gen akan serupa dengan konsekuensi pemuliaan mutasi,
dengan asumsi bahwa penyisipan intragen tidak menyebabkan mutagenesis penyisipan.

Untuk intragenesis, kombinasi baru dari elemen genetik fungsional asli dibuat
yang mengarah ke gen chimeric yang tidak ada di alam. Gen baru ini mungkin memiliki
tingkat dan pola ekspresi yang tidak sesuai dengan gen asli. Di samping ini, efek posisi
mungkin memiliki efek tambahan pada ekspresi intragen. Konsekuensi untuk makanan
dan pakan keselamatan penyimpangan ini dalam ekspresi gen harus dievaluasi dalam
studi kasus per kasus dan dibandingkan dengan baseline. Sebagai produk dasar dari
tanaman yang dibiakkan secara konvensional dapat digunakan. Jika intragenesis
digunakan untuk membungkam satu gen asli, konsekuensi keamanan pangan dan pakan
secara umum serupa dengan tanaman yang diperoleh melalui pemuliaan mutasi di mana
gen yang sama dihilangkan. Tanaman seperti itu dari program pemuliaan mutasi dapat
berfungsi sebagai dasar. Integrasi acak intragen mungkin memiliki efek pada ekspresi
gen dari genom penerima. Namun fenomena ini juga diharapkan ketika pemuliaan
translokasi, metode pemuliaan tradisional, diterapkan. Untuk menyelidiki apakah
intragen telah dimasukkan ke dalam gen penerima atau tidak, dan telah menjadi bagian
dari kerangka baca terbuka, bagian genom penerima yang mengapit situs P-DNA yang
disisipkan dapat diurutkan.
Induksi mutasi yang dimediasi
Induksi mutasi yang dimediasi oligonukleotidaoligonukleotida adalah sistem
modifikasi gen spesifik lokasi yang membuat perubahan yang tepat dalam urutan gen
tanpa penggabungan gen yang asing bagi spesies.
Deskripsi teknis teknik

Induksi mutasi yang dimediasi oligonukleotida adalah metode untuk menghasilkan
mutasi gen yang tepat pada lokus genom tanaman yang ditargetkan. Itu menggunakan
oligonukleotida chimeric yang disintesis secara kimia, yang merupakan asam nukleat
kecil (sekitar 70 nukleotida) yang terdiri dari DNA dan nukleotida RNA yang
dimodifikasi, untuk menginduksi substitusi, penyisipan, atau penghapusan nukleotida
dalam urutan genom.
Oligonukleotida diperkenalkan menggunakan pemboman partikel jaringan
tanaman atau elektroporasi protoplas. Dalam sel tumbuhan, oligonukleotida diyakini
berhibridisasi di lokasi gen yang ditargetkan untuk menciptakan pasangan basa yang tidak
cocok. Pasangan basa yang tidak cocok ini menginduksi koreksi yang tepat (mengganti,
menyisipkan atau menghapus) nukleotida yang ditunjuk oleh sistem perbaikan gen alami
sel itu sendiri. Setelah proses koreksi selesai, oligonukleotida terdegradasi, sehingga tidak
akan ada integrasi DNA asing ke dalam genom tanaman. Mutasi urutan pengkodean gen
dapat ditujukan untuk melumpuhkan fungsi gen dengan mengubah kodon asam amino
menjadi kodon stop awal, atau dengan memperkenalkan mutasi pergeseran kerangka baca.
Atau, fungsi gen dapat diubah oleh mutasi yang dimediasi oligonukleotida yang mengarah
pada substitusi asam amino. Terakhir, sekuens promotor gen dapat menjadi target induksi
mutasi yang dimediasi oligonukleotida dengan tujuan untuk mengubah sifat ekspresi gen
dari gen tersebut.

Sejauh ini, induksi mutasi yang dimediasi oligonukleotida hanya dijelaskan untuk mutasi
yang mengarah pada substitusi asam amino ke dalam gen asetolaktat sintase (als) yang
menghasilkan fenotipe tahan herbisida (Beetham et al., 1999; Kochevenko. dan Willmitzer,
2003; Okuzaki et al., 2004) atau dijelaskan untuk perbaikan gen reporter bermutasi yang
diperkenalkan ke tanaman transgenik
Perbandingan produk akhir dari teknik pemuliaan baru dan tanaman pemuliaan
konvensional Mutan yang diperoleh dengan teknik yang dijelaskan pada prinsipnya juga dapat
diperoleh melalui pemuliaan mutasi (menggunakan radiasi pengion atau mutagen kimia), yang
memiliki sejarah panjang aplikasi dalam pemuliaan tanaman (Ahloowalia et al. ., 2004). Oleh
karena itu, produk akhir dari tanaman yang dihasilkan oleh induksi mutasi yang dimediasi
oligonukleotida mirip dengan tanaman yang diperoleh melalui pemuliaan mutasi. Seperti dalam
pemuliaan mutasi, dalam induksi mutasi yang dimediasi oligonukleotida, terjadinya mutasi semi-
target telah dilaporkan (Kochevenko dan Willmitzer, 2003). Tanaman yang dipilih dalam
pemuliaan mutasi selalu diuji untuk sifat-sifat yang tidak diinginkan (disebabkan oleh mutasi
yang tidak ditargetkan) sebelum varietas dilepas ke pasar, dan hal yang sama harus diterapkan
pada tanaman yang diperoleh melalui induksi mutasi yang diperantarai oligo.

Introduksi tanaman yang diperoleh melalui induksi mutasi yang dimediasi
oligonukleotida di lingkungan tidak memiliki konsekuensi tambahan terhadap introduksi
tanaman yang dihasilkan oleh pemuliaan mutasi. Tentu saja tanaman tersebut harus bebas dari
oligonukleotida yang tergabung yang digunakan untuk induksi mutasi. Mutan semacam itu
adalah garis dasar yang cocok untuk membandingkan tanaman turunan mutasi yang dimediasi
oligonukleotida. Tanaman yang dipilih dalam pemuliaan mutasi selalu diuji sifat-sifat yang tidak
diinginkan yang mungkin dihasilkan dari perlakuan mutasi, sebelum dilepaskan. Oleh karena itu,
tanaman yang diperoleh melalui induksi mutasi yang dimediasi oligonukleotida harus diuji
dengan cara yang sama.
Konsekuensi untuk keamanan pangan dan pakan Tanaman yang diperoleh melalui
induksi mutasi yang dimediasi oligonukleotida memiliki satu perubahan pada gen target yang
juga dapat diperoleh melalui pemuliaan mutasi. Tanaman yang diperoleh dengan pemuliaan
mutasi karena itu merupakan garis dasar yang cocok. Misalkan tanaman yang bermutasi bebas
dari oligonukleotida yang tergabung, konsekuensi untuk keamanan pangan dan pakan serupa
dengan yang ada pada baseline. Tanaman yang dipilih dalam pemuliaan mutasi selalu diuji sifat-
sifat yang tidak diinginkan yang mungkin dihasilkan dari perlakuan mutasi, sebelum dilepaskan.
Oleh karena itu, tanaman yang diperoleh melalui induksi mutasi yang dimediasi oligonukleotida
harus diuji dengan cara yang sama
Kesimpulan
Teknik pemuliaan tanaman baru yang dijelaskan dalam laporan ini memiliki
kesamaan fitur yang semuanya melibatkan langkah modifikasi genetik, tetapi pada
akhirnya semua mengarah pada produk akhir (tanaman atau bagian tanaman) yang bebas
dari gen yang asing bagi spesies. Karena penerapan langkah modifikasi genetik, tanaman
yang dihasilkan oleh teknik pemuliaan tanaman baru semuanya berada di bawah Arahan
Eropa 2001/18/EC saat ini, bahkan jika tanaman benar-benar bebas dari urutan DNA apa
pun yang digunakan untuk modifikasi genetik. Fakta ini mengarah pada permintaan untuk
modernisasi peraturan UE saat ini untuk pelepasan tanaman rekayasa genetika. Penilaian
keamanan yang diperlukan untuk prosedur penerimaan setiap organisme yang
dimodifikasi secara genetik mahal dan memakan waktu. Selain itu, tidak adanya sekuens
DNA asing menyebabkan kesulitan yang ekstrem dan dalam beberapa kasus
ketidakmampuan untuk menunjukkan produk akhir sebagai hasil rekayasa genetika. Hal
ini dapat mempersulit penegakan peraturan.
Untuk mendukung modernisasi peraturan Uni Eropa saat ini, laporan ini
menjelaskan pendekatan ilmiah teknis untuk menilai kemungkinan konsekuensi dari
teknik pemuliaan baru bagi lingkungan dan kesehatan manusia dan hewan. Untuk
pembahasan konsekuensi, teknik pemuliaan tanaman baru dibandingkan dengan baseline,
yang ditentukan oleh referensi, misalnya tanaman serupa, tetapi dibiakkan menurut teknik
pemuliaan konvensional. Garis dasar mencakup situasi 'alami' dalam bandwidth
penuhnya. Kemungkinan dasar untuk setiap teknik dirangkum dalam Tabel 2.
Untuk semua tanaman atau produk tanaman yang merupakan hasil dari teknik
pemuliaan tanaman baru, jelas bahwa tindakan pencegahan umum harus dilakukan untuk
membuktikan bahwa produk akhir bebas dari agrobakteri dan urutan yang asing bagi
spesies. Seperti yang ditunjukkan dalam lihat Tabel 2, hal ini dapat memerlukan pengujian
PCR atau analisis hibridisasi DNA gel blot (Southern blot).
Beberapa metode bertujuan untuk pembungkaman gen sementara oleh RNAi.
Salah satu aspek RNAi yang kurang dipahami adalah bahwa kadang-kadang dapat
menginduksi metilasi DNA yang diarahkan RNA. Metilasi dapat mengakibatkan
pembungkaman dan peningkatan regulasi ekspresi gen target. Dalam beberapa kasus,
fenotipe yang berubah terkait metilasi bahkan ditemukan diwarisi secara stabil oleh
generasi seksual berikutnya. Oleh karena itu, ekspresi gen yang dimaksudkan untuk
dibungkam secara sementara harus dievaluasi secara hati-hati dan dibandingkan dengan
baseline ketika RNAi diterapkan.
Empat kelas teknik yang berbeda dijelaskan secara rinci dalam laporan ini. Untuk
setiap teknik pemuliaan tanaman baru, konsekuensi terhadap lingkungan dan keamanan
pangan dan pakan didiskusikan. Konsekuensi dari masing-masing teknik dirangkum
dalam Tabel 2.
Kelas pertama teknik pemuliaan tanaman baru memerlukan teknik yang berbeda
(agroinfiltrasi, pembungkaman gen yang diinduksi virus (VIGS), pemuliaan terbalik dan
pemuliaan dipercepat setelah induksi pembungaan awal) di mana modifikasi genetik
digunakan sebagai alat untuk memfasilitasi pemuliaan. Tanaman dan produk dari kelas
pertama ini tidak mengandung materi genetik apa pun yang digunakan untuk modifikasi
genetik awal. Oleh karena itu, tanaman dan produk yang diperoleh melalui teknik
pemuliaan tanaman baru ini mirip dengan tanaman dasar, yang merupakan tanaman yang
dibiakkan secara tradisional, dan akibatnya bagi lingkungan dan keamanan pangan dan
pakan tidak berbeda dari tanaman yang dibiakkan secara tradisional. Fakta ini
membenarkan pengecualian tanaman ini dari peraturan Eropa untuk organisme hasil
rekayasa genetika.
Kelas kedua dari teknik pemuliaan tanaman baru, menjelaskan produksi chimeric,
tanaman yang dimodifikasi secara genetik sebagian. Tanaman ini diperoleh dengan
menggabungkan tanaman rekayasa genetika dan non-rekayasa genetika dengan cara
okulasi. Pada cangkok seperti itu, produk (seperti buah atau bunga) dapat diproduksi pada
tanaman yang tidak dimodifikasi secara genetik yang ditanam pada batang bawah yang
dimodifikasi secara genetik. Meskipun bagian tanaman cangkok yang tidak dimodifikasi
secara genetik tidak mengandung materi genetik baru, molekul RNA, protein dan
metabolit yang diangkut dari batang bawah yang dimodifikasi secara genetik mungkin
ada. Oleh karena itu, tanaman dan produk yang diperoleh dalam kelas ini mungkin
berbeda dari baseline, dan tidak ada kesimpulan umum sehubungan dengan konsekuensi
terhadap lingkungan dan keamanan pangan dan pakan yang dapat dibuat. Di sini
diperlukan evaluasi kasus per kasus.
Kelas ketiga teknik pemuliaan tanaman baru menggunakan modifikasi genetik
sebagai alat langsung untuk memperkenalkan karakteristik baru tetapi asli ke tanaman
(cisgenesis, intragenesis). DNA yang diintroduksi berasal dari spesies itu sendiri atau dari
spesies yang kompatibel secara silang. Ketika memanfaatkan transformasi yang dimediasi
Agrobacterium, bersama dengan sekuens gen asli, sejumlah kecil DNA asing akan
ditransfer ke genom tanaman. Ini menyangkut apa yang disebut urutan perbatasan T-DNA
kanan dan kiri. Dalam beberapa kasus, urutan ini dapat menjadi bagian dari kerangka
pembacaan terbuka jika T-DNA telah dimasukkan ke dalam gen penerima, dan ini dapat
menghasilkan protein chimeric baru. Situasi seperti itu tidak diinginkan dan harus disaring
dengan menyelidiki sifat urutan genom penerima mengapit. Menggunakan modifikasi
genetik yang dimediasi Agrobacterium, sekuens cis atau intragen akan berintegrasi pada
posisi acak dalam genom penerima. Posisi acak ini dapat mempengaruhi ekspresi cis- atau
intragen melalui fenomena yang disebut efek posisi, dan ini dapat menyebabkan
perbedaan fenotipe. Karena efek posisi adalah fenomena yang terjadi secara alami yang
juga ditemukan sebagai akibat dari perkawinan introgresi, efek posisi tidak diharapkan
memiliki konsekuensi terhadap lingkungan keamanan pangan dan pakan. Tentu saja
ekspresi gen yang baru diperkenalkan harus diperiksa dan dibandingkan dengan baseline.
Di samping ini, gen yang baru diperkenalkan juga dapat mempengaruhi ekspresi gen dari
genom penerima jika mereka berada di sekitar lokasi integrasi. Namun, ini juga
merupakan fenomena alam yang mungkin terjadi selama pemuliaan translokasi dan oleh
karena itu juga tidak diharapkan memiliki konsekuensi terhadap lingkungan keamanan
pangan dan pakan.
Dalam hal integrasi gen baru terbukti berada di luar gen dari genom penerima dan
gen yang diperkenalkan menunjukkan ekspresi yang sesuai dengan baseline, tanaman
cisgenik dan intragenik tersebut dianggap mirip dengan baseline, juga dalam hal
keamanan lingkungan. dan keamanan pangan dan pakan. Jika juga terbukti bahwa produk
akhir bebas dari agrobakteri, virus (bila digunakan selama proses) dan sekuens yang asing
bagi spesies, ini membenarkan pengecualian tanaman cisgenik dan intragenik tersebut dari
peraturan Eropa untuk organisme hasil rekayasa genetika. Namun secara umum,
intragenesis sering ditujukan untuk mengubah ekspresi gen asli. Jika ekspresi intragen
menyimpang dari baseline, studi tambahan diperlukan untuk menilai lingkungan dan
keamanan pangan dan pakan.
Kelas terakhir dari teknik pemuliaan baru yang dibahas dalam laporan ini
menyangkut teknik di mana modifikasi genetik digunakan sebagai alat untuk membuat
mutasi spesifik pada gen asli, misalnya menggunakan induksi mutasi yang dimediasi
oligo. Tanaman dan produk daritanaman baru kelas terakhir ini teknik pemuliaantidak
mengandung materi genetik apa pun yang digunakan untuk modifikasi genetik awal. Oleh
karena itu, tanaman dan produk yang diperoleh melalui kelas teknik pemuliaan tanaman
baru ini serupa dengan tanaman yang diperoleh dengan pemuliaan mutasi tradisional,
yang digunakan sebagai referensi dasar, dan akibatnya bagi lingkungan dan keamanan
pangan dan pakan tidak berbeda dari itu. tanaman yang bermutasi secara tradisional. Fakta
bahwa tanaman dari kelas ini sama amannya dengan tanaman yang dibiakkan secara
tradisional, membenarkan pengecualian tanaman ini dari peraturan Eropa untuk organisme
hasil rekayasa genetika.

Konsekuensi Dari Teknik Pemuliaan Tanaman Berbasis M

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Deskripsi Asli:

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Konsekuensi Dari Teknik Pemuliaan Tanaman Berbasis M

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

Konsekuensi dari Teknik Pemuliaan Tanaman Berbasis Modifikasi Genetik Baru

Dibandingkan dengan Pemuliaan Tanaman Konvensional

Pemuliaan tanaman klasik dan modern

Teknik pemuliaan tanaman Baru

2. Menggabungkan tanaman rekayasa genetika dan non-rekayasa genetika dengan okulasi.

Aplikasi potensial dalam program pemuliaan saat ini

Fitur khusus penerapan teknik

Metode penyaringan untuk tidak adanya Agrobacterium dan transgen

Konsekuensi terhadap keamanan pangan dan pakan

Pembungkaman gen yang diinduksi Pembungkaman gen yang diinduksi

Aplikasi potensial dalam program pemuliaan saat ini

Fitur khusus penerapan teknik

Konsekuensi untuk keamanan pangan dan pakan

Ciri khusus penerapan teknik

Metode penyaringan ada/tidaknya konstruksi gen yang digunakan

Konsekuensi untuk keamanan pangan dan pakan

Pemuliaan dipercepat setelah induksi pembungaan awal

Aplikasi potensial dalam program pemuliaan saat ini

Ciri khusus penerapan teknik

Metode untuk menyaring ada/tidaknya konstruksi gen yang digunakan

Potensi aplikasi dalam program pemuliaan saat ini

Fitur khusus penerapan teknik

C. Transmisi Protein dan Metabolit

Metode untuk penyaringan ada/tidaknya konstruksi gen yang digunakan

Konsekuensi untuk keamanan pangan dan pakan

Aplikasi potensial dalam program pemuliaan saat ini

Ciri khusus penerapan teknik

Metode untuk penyaringan ada/tidaknya konstruksi gen yang digunakan

Konsekuensi untuk keamanan pangan dan pakan

Deskripsi teknis teknik

Fitur khusus dari penerapan teknik

Metode untuk skrining ada/tidaknya konstruksi gen yang digunakan

Konsekuensi untuk keamanan pangan dan pakan

Deskripsi teknis teknik

Aplikasi potensial dalam program pemuliaan saat ini

Anda mungkin juga menyukai