Yeast strains and media

Genotipe galur yang digunakan dalam penelitian ini adalah SPC42-GFP::HIS3 MYO1-
GFP::TRP1 leu2-3.112 ura3-1 can1-100 ade2-1 his3-11,15 trp1-1 GAL+, ssd1-d2 (latar belakang
W303). Perubahan genetik adalah dilakukan menggunakan integrasi berbasis PCR satu langkah
di endogen lokus (Longtine et al., 1998) atau dengan persilangan genetik. Untuk kursus waktu
siklus sel, sel ditumbuhkan dalam media YP (ekstrak ragi 1%, pepton 2%, dan 40 g/ml adenin)
ditambah dengan 2% dekstrosa (YPD) atau 2% gliserol dan 2% etanol (YPG/E). Untuk
mikroskop, sel ditumbuhkan dalam media sintetis lengkap (CSM) ditambah dengan 2%
dekstrosa (CSM-Dex) atau 2% gliserol dan 2% etanol (CSM-G/E).
Microscopy
Sel ditumbuhkan semalaman di CSM-DEX atau CSM-G/E pada suhu kamar dengan rotasi
konstan hingga kerapatan optik mendekati 0,1 pada 600. 5 ml kultur ditangkap dengan faktor α
pada 0,5 g/ml selama 3-4 jam. Sel dibebaskan dari penangkapan dengan tiga kali pencucian
berturut-turut dengan medium yang sama dan disuspensikan kembali dalam 500 l medium.
Sekitar 200 l suspensi sel terlihat pada concanavalin A-treated piringan kaca dengan kaca
penutup microwell #1,5 10 mm. Sel dipatuhi selama 5 menit, dan sel-sel yang tidak terikat
tersapu oleh pencucian berulang dengan 1 ml media yang telah dihangatkan. Hidangan itu
kemudian dibanjiri dengan media 3 ml dan ditempatkan pada suhu yang dikontrol panggung
mikroskop diatur ke 27°C (Pecon Tempcontrol 37-2 digital). Itu suhu media dipantau selama
percobaan menggunakan pembaca MicroTemp TQ1 yang digabungkan ke tipe K berinsulasi
Teflon termokopel (Omega). Probe ditempatkan dalam kontak dengan kaca bawah dekat bidang
kontak antara tujuan dan piringan. Suhu dipertahankan pada 27 ± 1°C; sesi pencitraan di mana
suhu bervariasi di luar batas ini ditolak dari analisis akhir. Gambar bidang terang dan fluoresen
diperoleh secara bersamaan menggunakan mikroskop terbalik LSM 5 Pascal Axiovert 200M
(Zeiss) dan objektif minyak Plan-Apochromat 63×/1.4. Cahaya 488-nm diperoleh dari sumber
cahaya laser argon menggunakan primer (488/543/633) dichroic beam splitter (HFT). Laser
diatur ke intensitas 0,7%. Untuk gambar fluoresensi hijau, cahaya dikumpulkan melalui longpass
505 filter emisi menggunakan lubang jarum ukuran 1-AU. Gambar bidang terang adalah
dikumpulkan menggunakan detektor cahaya yang ditransmisikan. Bagian optik adalah diambil
untuk total 11 bidang-z setiap 0,5 m dengan set rata-rata bingkai ke 2, untuk mengurangi
kebisingan. Paparan total dijaga serendah mungkin untuk batasi kerusakan foto (waktu tinggal
1,60-s per piksel, set dimensi gambar 512 × 512 piksel, dan ukuran piksel diatur ke 0,14 × 0,14
m). Gambar adalah diperoleh pada interval 3 menit untuk karbon kaya dan interval 4 menit untuk
miskin karbon dan direkam melalui antarmuka Zen 2000.
Image analysis
Analisis citra dilakukan dengan menggunakan ImageJ (Linkert et al., 2010; Schneider dkk.,
2012). Plug-in ImageJ StackReg dan MultiS tackReg digunakan untuk stabilisasi gambar pasca
akuisisi (Thévenaz dkk., 1998). Gambar bidang terang yang stabil diproses menggunakan Plug-
in ImageJ FindFocusedSlices, dan volume tunas yang tumbuh ditentukan menggunakan BudJ
(Ferrezuelo et al., 2012). Volume tunas diukur untuk tunas yang bidang fokusnya tidak lebih dari
1,5 µm jauh (tiga z-langkah) dari bidang fokus sel induk. Jumlah proyeksi z-tumpukan
diperlakukan menggunakan filter rata-rata 2-piksel, dan tingkat kecerahan/kontras disesuaikan
untuk mengurangi kebisingan latar belakang. Itu gambar fluorescent hijau berwarna semu yang
diperlakukan tumpang tindih dengan garis besar sel yang dicitrakan untuk referensi (garis besar
dibuat menggunakan perintah "temukan tepi" di atas proyeksi jumlah semua z-tumpukan gambar
bidang terang). Posisi kutub spindel ditentukan menggunakan alat crosshair (diatur ke
pengukuran otomatis dan berikutnya otomatis), dan jarak antara dua kutub spindel ditentukan
dengan menggunakan rumus matematika jarak antara dua titik. Hilangnya cincin Myo1
ditentukan secara empiris dengan pengamatan sinyal GFP di leher kuncup.
Statistical analysis
Data yang diperoleh dari ImageJ dianalisis menggunakan Apple Numbers, R (R Tim Inti, 2016),
RStudio (Tim RStudio, 2015), dan usia paket R ggplot2 (Wickham, 2009). Nilai-P dihitung
menggunakan Welch uji t dua sampel dan selang kepercayaan 95%.
Cell cycle time courses and Western blotting
Untuk kursus waktu Western blot, sel ditumbuhkan semalaman pada suhu kamar dalam YPD
cair atau YPG/E hingga kepadatan optik 0,5 pada 600. Karena kepadatan optik dipengaruhi oleh
ukuran sel, kami menormalkan sel angka dengan menghitung sel dengan penghitung Coulter
(Beckman Coulter) ketika membandingkan sel yang tumbuh dalam karbon kaya dan miskin.
Sinkronisasi G1 dicapai dengan menangkap sel dengan faktor α pada konsentrasi 0,5 g/ml
sampai setidaknya 90% sel tidak bertunas. Sel dibebaskan dari penangkapan dengan mencuci
tiga kali dengan segar medium. Kursus waktu dilakukan pada 25 ° C dengan agitasi konstan.
Untuk mencegah sel memasuki kembali siklus sel berikutnya, faktor adalah ditambahkan
kembali setelah sebagian besar sel bertunas. Untuk kursus waktu pergeseran nutrisi, satu budaya
ditangkap dan dipecah pada saat pembebasan dari penangkapan G1. Pada saat shift, kedua kultur
dicuci tiga kali kali dengan suhu kamar YPD (kontrol) atau YPG/E (sel bergeser) dengan
sentrifugasi selama 1 menit pada 3.000 g (Eppendorf 5702). Volume kultur dikembalikan ke
volume aslinya sebelum pencucian dan kultur ditempatkan kembali pada 25 ° C. Untuk Western
blot, sampel 1,6 ml dikumpulkan secara teratur dalam terval, pelet, dan flash beku di hadapan
200 l manik-manik kaca. Lisis sel dan Western blotting dilakukan seperti yang dijelaskan
sebelumnya (Harvey et al., 2005). Analisis imunofluoresensi dari gelendong mitosis dilakukan
seperti yang dijelaskan sebelumnya (Pringle et al., 1991). Pencitraan multiplane dari slide
dilakukan menggunakan Leica DM5500 B Widefield Microscope dan objektif minyak 63×/0.6–
1.4. Spindle dihitung di ImageJ. Data diproses dan diplot menggunakan Apple Numbers.
Online supplemental material
Gambar. S1 menunjukkan distribusi volume sel induk untuk sel yang tumbuh dalam karbon kaya
atau miskin dan untuk kultur sinkron dan asinkron. Gbr. S2 menunjukkan data kurva
pertumbuhan untuk sel yang tumbuh di bon mobil kaya atau miskin. Gambar. S3 menunjukkan
versi dot plot dari data yang digunakan untuk menghasilkan Gambar. 3