BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Penemuan mekanisme yang menekan aktivitas gen pada tanaman telah memperluas

cakrawala untuk penelitian tentang kontrol ekspresi gen. Pembungkaman gen (GS)

didefinisikan sebagai proses molekuler yang terlibat dalam regulasi turun gen tertentu, dan

mungkin berkembang sebagai sistem pertahanan genetik terhadap virus dan asam nukleat

yang menyerang. Penemuan RNAi, di mana RNA untai ganda (dsRNA) menekan terjemahan

mRNA homolog, memiliki dampak besar pada genetika evolusioner dengan memungkinkan

analisis fenotipe kehilangan fungsi pada organisme di mana analisis genetik klasik sulit

dilakukan atau mustahil.

Sebelum penemuan RNAi, pembungkaman gen yang bergantung pada homologi

diamati pada petunia. Misalnya, pada tahun 1990 pembungkaman gen pasca transkripsi

pertama kali diamati di petunia. Awalnya itu disebut sebagai co-supresi, mekanisme serupa

juga diamati di Neurospora crassa tetapi istilahnya adalah quelling. Gen kalkon sintase yang

diperkenalkan di petunia telah ditekan oleh ekspresi transgen dan gen homolog. Fenomena ini

menunjukkan bahwa peningkatan salinan gen yang diekspresikan menyebabkan dibungkam

oleh dsRNA dengan cara degradasi mRNA (PTGS) atau metilasi DNA (TGS). Beberapa

transgen harus membungkam ekspresi lokus homolog yang pertama kali diamati pada

tumbuhan setelah itu selanjutnya diidentifikasi pada eukariota lain seperti nematoda, jamur,

serangga dan protozoa. Pada tahun 1998 Andrew fire dan Craig mello diterbitkan di alam

bahwa pembungkaman gen yang dimediasi dsRNA di C.elegans setelah percobaan mereka,

Mello menciptakan istilah interferensi RNA.

B. Rumusan Masalah

1. Apa definisi gen knockdown?

2. Bagaimana prinsip gen knockdown?

3. Bagaimana mekanisme kerja gen knockdown?

4. Bagaimana pengaplikasian knockdown pada hewan?

 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Definisi Gen Knockdown

Pembungkaman gen (GS) didefinisikan sebagai proses molekuler yang terlibat dalam

regulasi turun gen tertentu, dan mungkin berkembang sebagai sistem pertahanan genetik

terhadap virus dan asam nukleat yang menyerang. Seseorang dapat mengubah sifat bakteri

tanpa mengedit genom. Salah satu metode adalah dengan membungkam mRNA target dengan

mengekspresikan asRNA. Metode ini pertama kali dilaporkan pada tahun 1984 pada E. coli.

Keuntungan terbesar menggunakan asRNAs adalah persyaratan efek pembungkaman,

sehingga memungkinkan untuk diterapkan pada gen-gen penting untuk pertumbuhan.

Membuat vektor ekspresi untuk asRNA lebih sulit daripada metode knockout gen.

Gambar 1. Antisense RNA

Dalam banyak kasus, asRNAs dirancang untuk berhibridisasi ke situs pengikatan

ribosom (RBS) dan daerah kodon awal dari mRNA target. Ini karena inisiasi translasi adalah

langkah pembatas dalam proses translasi, sehingga, mencegah ribosom dari mengikat ke situs

RBS mRNA target adalah yang paling penting untuk kemanjurannya.

 Untuk mengamati fenotipe yang berbeda dengan pembungkaman gen yang dimediasi

asRNA, parameter kuncinya adalah jumlah tingkat asRNA seluler di atas mRNA target. Pada

bakteri, transkripsi dan translasi berlangsung secara bersamaan di lokasi yang sama. Untuk

pembungkaman gen yang berhasil, asRNA yang diekspresikan harus mengikat mRNA target

sebelum ribosom. Karena ribosom adalah molekul yang paling melimpah dalam sel, seseorang

harus memaksimalkan ekspresi asRNA dengan menggunakan promotor transkripsi yang kuat.

Jumlah salinan vektor juga mempengaruhi efisiensi dan penggunaan plasmid dengan jumlah

salinan yang lebih tinggi memberikan hasil yang lebih baik.

B. Prinsip Gen Knockdown

Transcriptional Gene Silencing: Pada mamalia dan tumbuhan, hipermetilasi sitosin

pada DNA dan metilasi histon terjadi pada histon H3 pada lisin K9 (H3K9) oleh RNA kecil

non-coding yang mengarah pada pembentukan kompleks heterokromatin (bentuk inaktif

transkripsi). Proses metilasi ini dilakukan oleh DNA methyltrasferase (DNMT) dan Histone

Misalnya homolog pemain dadu manusia adalah enzim multi domain methyltrasferase

(HMT). DNA yang bergantung pada RNA dan/atau metilasi histon mungkin berbeda tetapi

fungsi ini adalah untuk mengontrol ekspresi gen dan bertindak sebagai penanda epigenetik.

Proses metilasi DNA langsung RNA (RdDM) pertama kali ditemukan pada tanaman yang

terinfeksi virus (virus Tembakau, virus RNA sitoplasma). Tanaman menghasilkan siRNA

24nt untuk membentuk kompleks RdDM dan metilasi residu sitosin pada situs simetris dan

asimetris (CpGp dan CpHpHpG H= A, C, atau T) yang bergantung pada protein HEN1 dan

penataan ulang domain metiltransferase2 (DRD2). Dalam nukleus, pembungkaman gen yang

dipicu dsRNA telah diprakarsai oleh transgen yang menyimpang, urutan pengulangan

terbalik dari dsRNA, atau siRNA sekunder yang diproduksi oleh RNA dependent RNA

polimerase (RdRP), mamalia kekurangan produksi dsRNA berbasis RdRP. DNA polimerase

yang bergantung pada RNA harus mensintesis siRNA sekunder dari mengarahkan siRNA
primer yang menyimpang sebagai templat yang dikatalisis oleh pemain dadu, siRNA 24nt

sekunder ini terkait dengan metilasi sitosin spesifik urutan yang berpotensi memicu

pembungkaman gen transkripsi (TGS).

Posttranscriptional Gene Silencing: Proses pembungkaman gen pasca transkripsi

(PTGS) miRNA dan siRNA sedikit berbeda berdasarkan biogenesis dan perakitan kompleks

RISC, perbedaan ini dapat diidentifikasi pada beberapa eukariota. Sebagai contoh, manusia

dan Caenorhabditis elegans hanya memiliki satu enzim dicer, Drosophila memiliki dua enzim

Dicer (Dicer-1 dan Dicer-2), produksi RNA interferensi pendek dikaitkan dengan Dicer-2,

tetapi tidak Dicer-1. Dalam Drosophila pada tahap embrio, pematangan dan fungsi miRNA

dan siRNA masing-masing diperlukan Ago1 dan Ago2 untuk kompleks RICS. Arabidopsis

thaliana memiliki empat enzim Dicer, Dicer-2, 3 dan Dicer-4 menghasilkan ukuran siRNA

yang berbeda (panjang 21, 22, 24 nukleotida) sedangkan Dicer-1 menghasilkan ukuran

miRNA yang bervariasi.

MicroRNA adalah keluarga besar RNA endogen, miRNA standar tunggal pendek

terbentuk dalam dua fase. Dalam nukleus, transkrip miRNA (~60-70nt) disintesis oleh RNA

polimerase II, yang dikenali oleh kompleks Drosha- DGCR8, yang disebut sebagai

mikroprosesor. RNA primer (pri-miRNA mengandung bentuk hairpin menunjukkan batang

loop, struktur topi dan struktur ekor poli A. Exportin5, protein membran nuklir fungsinya

untuk mengekspor priRNA ke sitoplasma [14].The Dicer (RNase III ) memotong pri-miRNA

untuk membentuk miRNA pendek 22 dengan overhang 2nt 3'. MiRNA yang matang telah

dikenali oleh protein Argonaute dan Dicer untuk membentuk RNA induced silencing

complex (RISC) yang hasilnya membelah mRNA komplementer yang disebut PTGS. Pada

tumbuhan, interaksi target miRNA lebih komplementer dan dalam daerah pengkodean tetapi

target miRNA hewan terganggu oleh celah, ketidakcocokan dan terjadi pada mRNA.

Beberapa miRNA sebagian besar bertanggung jawab untuk penekan translasi.

 Ada berbagai sumber dsRNA panjang seperti itu dapat disintesis dari transkripsi dua

arah dari pengulangan terbalik transgen, transposon, transkripsi dari promotor konvergen.

RNA standar ganda dapat dibentuk dengan memasangkan RNA sense dan RNA anto-sense

yang timbul dari transkripsi menyimpang dari gen yang sama. RNA-dependent RNA

polymerase (RdRP) dapat terlibat dalam produksi dsRNA yang dapat memicu PTGS. RdRP

hadir dalam organisme yang luas seperti tanaman, cacing, jamur dan ragi fisi. Enzim ini telah

mengubah transkrip primer dan menyimpang menjadi dsRNA. RNA pengganggu pendek

dihasilkan oleh Dicer dari dsRNA panjang eksogen atau endogen, siRNA pendek dimasukkan

ke dalam ribonukleoprotein (protein argonaut) yang membentuk kompleks RICS. Karena

kompleks RICS akhir mengandung molekul RNA untai tunggal, lebih sering RNA 2nt 3'

overhang dan untai lainnya dihilangkan pada akhirnya pembelahan endonukleotik terjadi

yaitu target mRNA terdegradasi Overhang 3' lebih efisien diproses daripada tumpul molekul

RNA berakhir. RICS awal yang mengandung siRNA tidak aktif sampai diubah menjadi

bentuk aktif, yang melibatkan hilangnya satu untai.

C. Mekanisme Gen Knockdown

 Mekanisme pembungkaman gen siRNA dan miRNA. dsRNA (baik ditranskripsi atau

diperkenalkan secara artifisial) diproses oleh Dicer menjadi siRNA yang dimuat ke dalam

RISC. AGO2, yang merupakan komponen RISC, memotong untai penumpang siRNA. Untai

pemandu kemudian memandu RISC aktif ke mRNA target. Ikatan komplementer penuh

antara untai pemandu siRNA dan mRNA target mengarah ke pembelahan mRNA. miRNA:

Transkripsi gen miRNA dilakukan oleh RNA polimerase II dalam nukleus untuk

menghasilkan pri-miRNA, yang kemudian dibelah oleh Drosha untuk membentuk pra-

miRNA. Pra-miRNA diangkut oleh Exportin 5 ke sitoplasma di mana ia diproses oleh Dicer

menjadi miRNA. miRNA dimuat ke RISC di mana untai penumpang dibuang, dan miRISC

dipandu oleh untai pemandu yang tersisa ke mRNA target melalui pengikatan komplementer

sebagian. Target mRNA dihambat melalui represi translasi, degradasi atau pembelahan.

Interferensi RNA telah banyak digunakan sebagai alat eksperimen untuk menganalisis

fungsi gen mamalia, baik in vitro maupun in vivo. RNAi merupakan penemuan yang relatif

baru untuk menghambat ekspresi gen dan dianggap sebagai salah satu penemuan terbaru yang

paling penting dalam biologi molekuler. Produksi siRNA yang mengikat dan menginduksi

degradasi mRNA endogen spesifik sekarang dikenal sebagai mekanisme yang digunakan

secara luas oleh sel eukariotik untuk menghambat produksi protein pada tingkat pasca-

transkripsi. RNAi dapat mengakibatkan pembungkaman gen atau bahkan pengusiran sekuens

dari genom.

Asimetri dupleks siRNA menentukan untai mana yang memasuki Dicer untuk merakit

RISC dan untuk menginduksi pembelahan mRNA spesifik target. Oligonukleotida siRNA

awalnya diidentifikasi sebagai fragmen dsRNA pendek yang dihasilkan oleh mesin RNAi

yang disebut Dicer yang memproses dsRNA panjang, seperti dari infeksi virus, menjadi

fragmen siRNA. SiRNA ini ditemukan sebagai perantara aktif yang menggunakan bagian

kedua dari mesin, yang disebut RISC, untuk memilih mRNA untuk degradasi. Mekanisme
miRNA tampaknya serupa tetapi tidak identik dengan siRNA. Penelitian kanker adalah

bidang yang dinamis dan menarik untuk penerapan inhibitor siRNA.

interferensi RNA (RNAi) menunjukkan mekanisme pembungkaman gen spesifik

urutan yang diprakarsai oleh pengenalan RNA untai ganda (dsRNA), homolog secara

berurutan dengan gen silencing, yang memicu degradasi mRNA. RNAi menggunakan Dicer

endonuclease untuk menghasilkan RNA pengganggu kecil (siRNA) dari dsRNA. Kompleks

RNAi induced silencing (RISC) kemudian menghancurkan mRNA target spesifik

berdasarkan urutan komplementaritas dengan siRNA. Hal ini telah menjadi alat yang ampuh

untuk membungkam ekspresi gen target dan mempelajari mereka kehilangan fungsi fenotipe,

analisis fungsi gen yang memungkinkan ketika alel mutan tidak tersedia.

D. Aplikasi Gen Knockdown Pada Hewan

Penelitian pada bidang terapi yang berbeda menerapkan aplikasi siRNA untuk

digunakan sebagai alat penelitian untuk validasi fungsi gen. Uji biokimia, farmakologis, dan
histologis yang berbeda telah digunakan untuk menentukan efek penghambatan siRNA pada

gen tertentu dan untuk menganalisis perubahan fenotip pada sel. Misalnya alternatif untuk

hewan transgenic, untuk mempelajari fungsi gen tertentu digunakan interferensi RNA dalam

melakukan pembungkaman gen pasca-transkripsi berdasarkan degradasi mRNA.

Dalam model tikus sepsis, telah ditunjukkan bahwa pretreatment dengan siRNA

spesifik TNF yang disuntikkan secara intraperitoneal mampu meningkatkan tingkat

kelangsungan hidup enam kali lipat setelah tantangan lipo polisakarida yang Mematikan.

Demikian pula, salah satu percobaan pertama untuk menunjukkan potensi terapeutik RNAi

menggunakan siRNA fas-spesifik untuk melindungi tikus terhadap hepatitis fulminan dan

penelitian lain melaporkan bahwa pengobatan siRNA spesifik caspase 8 juga mencegah gagal

hati akut. Studi-studi ini menggambarkan konsep bahwa siRNA dapat digunakan secara

efektif untuk mengontrol respons akut apakah itu berarti membatasi peradangan yang

berbahaya dan tidak terkontrol atau mencegah apoptosis hepatosit dan menjaga fungsi hati.

SiRNA yang distabilkan secara kimiawi dan terkonjugasi kolesterol telah terbukti

membungkam gen endogen melalui pengiriman sistemik siRNA yang dimodifikasi ke dalam

model tikus.

Pada kanker ovarium, teknologi siRNA telah digunakan untuk menghambat ekspresi

Her-2/neu in vitro yang mengakibatkan penurunan proliferasi sel, peningkatan apoptosis,

peningkatan penangkapan G0/G1, dan penurunan pertumbuhan tumor. Penghambatan Her

2/neu oleh RNAi juga mengakibatkan penurunan ekspresi VEGF dan peningkatan ekspresi

faktor antiangiogenik, trombospondin-1. Ekspresi berlebihan p-glikoprotein (p-gp) dan

glutathione S-transferase (GST) adalah mekanisme yang dikenal untuk resistensi multi obat

pada kanker ovarium. Menggunakan target ini, siRNA dikirim terhadap p-gp dan GST yang

menghasilkan pemulihan sensitivitas cisplatin in vitro. Di masa depan, siRNA dapat

digunakan sebagai agen sensitisasi kemo pada pasien yang telah resistensi obat.
 BAB III

PENUTUP

A. Kesimpulan

Kesimpulan dari materi ini yaitu Pembungkaman gen (GS) didefinisikan sebagai

proses molekuler yang terlibat dalam regulasi turun gen tertentu, dan mungkin

berkembang sebagai sistem pertahanan genetik terhadap virus dan asam nukleat

yang menyerang. Prinsip gen knockdown ada 2 yaitu Transcriptional Gene Silencing

(TGS) dan Posttranscriptional Gene Silencing (PTGS). Transcriptional Gene

Silencing tujuannya untuk mencegah sintesis RNA sedangkan Posttranscriptional

Gene Silencing tujuannya adalah untuk mendegradasi RNA yang ada. Mekanisme

pembungkaman gen siRNA dan miRNA. dsRNA (baik ditranskripsi atau

diperkenalkan secara artifisial) diproses oleh Dicer menjadi siRNA yang dimuat ke

dalam RISC. AGO2, yang merupakan komponen RISC, memotong untai

penumpang siR NA. Untai pemandu kemudian memandu RISC aktif ke mRNA

target. Pengaplikasian gen knockdown pada hewan yaitu pada hewan ternak yang

dimana dapat meningkatkan kualitas dari hewan ternak sehingga lebih tahan

terhadap penyakit, dan juga dapat meningkatkan produksi hewan ternak itu sendiri

seperti dapat meningkatkan kuantitas dari daging ternak, dan meningkatkan kualitas

dari susu yang dihasilkan oleh hewan ternak.

B. Saran

Saran terhadap materi ini yaitu sebaiknya diadakan penelitian lebih lanjut mengenai

Gen Knockdown beserta mekanismenya. Agar pembaca dapat lebih memahami

mengenai Gen Knockdown tersebut

 DAFTAR PUSTAKA

Fischer, S.E.J., 2015. RNA interference and microRNA-mediated silencing. Curr. Protoc.
Mol. Biol., Vol. 112.

Lima, W.F., C.L. de Hoyos, X.H. Liang and S.T. Crooke, 2016. RNA cleavage products
generated by antisense oligonucleotides and siRNAs are processed by the RNA
surveillance machinery. Nucleic Acids Res., 44: 3351-3363.

Zhuang, J.J., S.A. Banse and C.P. Hunter, 2013. The nuclear argonaute NRDE-3 contributes
to transitive RNAi in Caenorhabditis elegans. Genetics, 194: 117-131.