CAIRAN KINERJA TINGGI

KROMATOGRAFI (HPLC)
PENGANTAR

• HPLC adalah jenis kromatografi yang merupakan jenis kromatografi yang paling serbaguna dan banyak digunakan.

• HPLC adalah salah satu bentuk kromatografi cair yang biasa digunakan senyawa terpisah yang larut dalam larutan .

• Teknik tersebut digunakan para ilmuwan untuk memisahkan dan menentukan spesies dalam berbagai bahan organik,
anorganik, dan biologis.

• HPLC lebih mahal dan menghasilkan lebih banyak limbah daripada GC. Tetapi tidak semua

• senyawa cukup mudah menguap untuk dianalisis dalam GC

• Dalam kromatografi cair, fase gerak adalah sol cair ventilasi berisi sampel sebagai campuran zat terlarut.
PERALATAN

• Instrumen HPLC terdiri dari

• reservoir fase gerak,

• sebuah pompa,

• sebuah injektor,

• kolom pemisah,

• sebuah detektor.
PRINSIP DASAR

• Tekanan pemompaan beberapa ratus atmosfer diperlukan untuk mencapai laju aliran yang wajar dengan pengemasan dalam kisaran ukuran 3
hingga 10 mm, yang umum dalam kromatografi cair modern.

• Karena tekanan tinggi ini, peralatan untuk HPLC cenderung lebih rumit dan mahal daripada jenis kromatografi lainnya.

• Sampel fase cair (campuran) disuntikkan ke kolom LC biasanya menggunakan jarum suntik dan katup injeksi .

• Sampel disapu ke kolom kromatografi dengan aliran fase gerak dan pemisahan kromatografi terjadi saat campuran
bergerak ke bawah kolom.

• Detektor mendeteksi elusi senyawa dari ujung kolom berdasarkan beberapa karakteristik fisik seperti penyerapan sinar ultraviolet ,
itu perbedaan indeks bias diantara analit dan fase gerak
diri.
 1. RESERVOIRS DAN SISTEM PENGOBATAN SOLVEN FASE
SELULER

• Instrumen HPLC modern dilengkapi dengan satu atau lebih wadah kaca, yang masing-masing berisi 500 mL atau lebih pelarut.

• Ketentuan sering disertakan untuk menghilangkan gas dan debu terlarut dari cairan.

• Gas terlarut dapat menyebabkan laju aliran yang tidak dapat direproduksi dan penyebaran pita, gangguan detektor.

• Degassers dapat terdiri dari:

• sistem pompa vakum, sistem

• distilasi,

• alat untuk memanaskan dan mengaduk,

• sebuah sistem untuk semburan di mana gas terlarut disapu keluar larutan oleh gelembung halus dari gas inert yang tidak larut dalam fase gerak.
TYPICALAPPARATUS UNTUK HPLC
 1. RESERVOIRS DAN SISTEM PENGOBATAN SOLVEN
FASE SELULER

• Jenis reservoir pelarut yang paling umum adalah botol kaca. Sebagian besar pabrikan memasok botol ini dengan tutup khusus, tabung teflon dan filter untuk
dihubungkan ke saluran masuk pompa dan ke gas pembersih (helium) digunakan untuk menghilangkan udara terlarut .

• Solusi fase bergerak biasanya sudah disaring terlebih dahulu sebelum digunakan untuk menghilangkan debu dan partikulat. Segala sesuatu yang masuk ke kolom HPLC
harus disaring melalui filter 0,5 µm, termasuk pelarut
JENIS PROSES ELUSI FASE MOBILE:

• Elusi isokratik → gunakan pelarut tunggal atau pelarut

campuran dengan komposisi konstan.

• Elusi gradien, dua (dan terkadang lebih)

sistem pelarut yang
komposisi bervariasi selama pemisahan. Rasio kedua
pelarut bervariasi dengan cara yang terprogram,
kadang-kadang
terus menerus dan terkadang dalam serangkaian langkah.

• Seperti yang ditunjukkan dalam, elusi gradien sering

meningkatkan efisiensi pemisahan,
 SISTEM POMPA

• Persyaratan untuk pompa kromatografi cair meliputi

1. aliran bebas pulsa,

2. laju aliran mulai dari 0,1-10 mL / menit, kontrol aliran yang akurat

3. dengan kemampuan reproduksi yang baik, menghasilkan tekanan

4. tinggi (hingga 6000 psi), dan ketahanan terhadap korosi oleh berbagai

5. pelarut

• Jenis Pompa HPLC

• SyringeType Pumps → kapasitas rendah (~ 250mL) dan tidak nyaman ketika pelarut harus diganti.

• Pompa Piston Reciprocating

Sistem pengiriman pelarut (pompa)

Pompa JASCO LC-1580 dan UV-1570/1575 UV / Detektor Terlihat

http://www.jasco.co.jp/English/main/main.html

http://www.jasco.co.uk/lcpumps.htm
KOLOM ANALITIS

Sebuah.Kolom biasanya tabung stainless steel.

b. Panjangnya biasanya 10 - 30 sentimeter.

c. Diameter bagian dalam 4 - 40 mm adalah tipikal; kolom berkinerja tinggi yang lebih baru berukuran 1 - 4,6 mm. Ukuran kemasan

d. partikulat biasanya 5 - 10 mikrometer.

e. Mahal

f. Mudah terdegradasi oleh debu dan partikel

KOLOM ANALITIS
FASE STATIONARY
• Dukungan paling umum → partikel silika permeabel yang sangat murni, bulat, dan mikro, beberapa ratus m 2 / g

Memindai mikrograf elektron dari partikel kromatografi silika. (a) Agregat partikel bola

(porositas 50%, 150 m 2 / g luas permukaan) (b) Struktur seperti spons (porositas 70%,

300m 2 / g luas permukaan) Skema struktur sillica gel.

KOLOM ANALITIS
FASE KETERANGAN BERIKAT

Permukaan silika dimetil silana R = C8, C18, ……

Itu oktadekil ( C18) fase diam adalah yang paling umum di

HPLC. Ini sering disebut ODS, untuk octadecylsilane
DETEKTOR
• Itu variasi intensitas cahaya disebabkan oleh penyerapan UV, emisi fluoresensi, atau perubahan indeks bias (tergantung pada
jenis detektor yang digunakan) dari komponen sampel melewati sel, dimonitor sebagai perubahan tegangan keluaran.

• Perubahan tegangan ini dicatat pada perekam grafik strip dan sering dimasukkan ke dalam integrator atau komputer untuk memberikan waktu
retensi dan data area puncak.

• Jenis detektor:

• Detektor penyerapan UV → indeks bias paling umum (RI) → bersifat universal tetapi

• juga yang kurang sensitif. fluoresensi (FL)

Detektor FL dan EC cukup sensitif (hingga 10-15 mol)
•
tetapi juga cukup selektif.
• elektrokimia (EC)

• spektrometri massa (MS) → Detektor MS adalah yang paling kuat tetapi tetap yang paling rumit dan paling mahal.
Sistem LC / MS
JENIS HPLC

Jenis HPLC sering diklasifikasikan berdasarkan mekanisme pemisahan atau berdasarkan jenis fase diam.

Kromatografi partisi

→ Fase diam adalah cairan film tipis yang terbentuk pada permukaan penyangga padat dan pemisahannya didasarkan pada partisi zat
terlarut antara dua fase cair.

Kromatografi adsorpsi

→ Fase diam adalah adsorben (seperti gel silika atau kemasan berbasis silika lainnya) dan perpisahan didasarkan pada
langkah-langkah adsorpsi-desorpsi berulang.
KROMATOGRAFI PARTISI

• Jenis HPLC yang paling banyak digunakan adalah kromatografi partisi dimana fase diam adalah cairan kedua yang bercampur
dengan fase gerak cair.

• Cairan kedua terikat ke kemasan silika

• Jadi, banyak polaritas berbeda untuk fase diam terikat tersedia.

JENIS KROMATOGRAFI PARTISI

• Kromatografi Fase Normal → fasa diam bersifat polar dan fasa gerak adalah pelarut nonpolar seperti heksana

• Kromatografi fase terbalik → fasa diam adalah nonpolar, seringkali berupa hidrokarbon, dan fasa gerak adalah pelarut yang relatif polar
(seperti air, metanol, asetonitril, atau tetrahidrofuran).
UKURAN KROMATOGRAFI PENGECUALIAN (SEC)

• Kemasan adalah polimer berpori (resin) atau bahan berbasis silika

• Pengemasan kolom berfungsi seperti filter molekuler yang memungkinkan

molekul kecil mengakses setiap pori, memperlambat kemajuannya - molekul
besar lewat lebih cepat

• Biasanya digunakan untuk memisahkan molekul biologis, dan untuk

menentukan berat molekul dan distribusi berat molekul polimer •

• Biasanya diterapkan pada molekul besar atau kompleks makromolekul

seperti protein dan polimer industri.
TERIMA KASIH
 TINGKAT MIGRASI SOLUT

• Keefektifan kolom kromatografi dalam memisahkan dua zat terlarut sebagian bergantung pada laju relatif di mana dua spesies dielusi.
Laju ini pada gilirannya ditentukan oleh rasio konsentrasi zat terlarut di masing-masing dari dua fase.
KONSTAN DISTRIBUSI
• Semua pemisahan kromatografi didasarkan pada perbedaan sejauh mana zat terlarut didistribusikan antara fase gerak dan fase
diam. Untuk zat terlarut A, kesetimbangan dijelaskan dengan persamaan

• Konstanta kesetimbangan Kc untuk reaksi ini disebut konstanta distribusi, yang didefinisikan sebagai

• dimana SEBAGAI adalah aktivitas zat terlarut A dalam fase diam dan (a SAYA adalah aktivitas dalam fase bergerak. Kami sering mengganti c S, konsentrasi
analitik molar zat terlarut dalam fase diam, untuk (a SEBAGAI dan C M, konsentrasi analitik molar dalam fase gerak, untuk (a SAYA. Oleh karena itu, kita
sering menulis persamaan 31-7 sebagai

• Idealnya, konstanta distribusi adalah konstan pada berbagai konsentrasi zat terlarut, yaitu c S berbanding lurus dengan c M.
RetentionTimes
Waktu t M setelah injeksi sampel agar puncak ini muncul kadang-kadang disebut waktu mati atau kosong. Waktu mati memberikan ukuran
rata-rata tingkat migrasi fase gerak dan merupakan parameter penting dalam mengidentifikasi
puncak analit.

Waktu yang diperlukan zona ini untuk mencapai detektor setelah injeksi sampel disebut waktu retensi dan diberi simbol t R
RetentionTimes
Tingkat migrasi

Demikian pula, jumlah mol zat terlarut dalam fase diam diberikan oleh hasil kali cS, konsentrasi zat terlarut dalam fase diam, dan
volumenya, VS. Oleh karena itu,

Mengganti Persamaan 31-8 ke dalam persamaan ini memberikan ekspresi untuk laju migrasi zat terlarut sebagai fungsi dari konstanta
distribusinya serta fungsi volume fase diam dan bergerak:

Kedua volume tersebut dapat diperkirakan dari metode penyiapan kolom.