BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Victoria Pure Blue BO (VPBO), juga dikenal sebagai Basic blue 7, adalah pewarna yang
ditemukan pada ikan panga yang terkontaminasi (pangasius bocourti)diimpor dari Vietnam pada
tahun 2010. Kontaminasi tersebut dilaporkan di Eropa melalui Rapid Alert System for Food and
Feed (RASFF) yang dikelola oleh Uni Eropa (pemberitahuan 2010.1372) (RASFFportal, Komisi
Eropa). Pencemaran tersebut dapat berasal dari limbah buangan lingkungan karena Basic blue 7
banyak digunakan di industri untuk mewarnai tekstil tertentu (Gessner dan Mayer, 2000). Atau,
itu bisa berasal dari perlakuan yang disengaja dan ilegal dalam budidaya. Kemanjuran zat
tersebut belum terbukti dalam akuakultur, tetapi telah dibuktikan di masa lalu bahwa zat itu
dapat menghasilkan beberapa aktivitas terapeutik. Sebuah tim peneliti (Alderman, 1982) maju in
vitro tes untuk menentukan kemanjuran 11 pewarna triarylmethane terapeutik, termasuk VPBO,
terhadap jamur parasit Saprolegnia parasitica dalam ikan. Dalam laporan terbaru yang
dikeluarkan oleh European Food Safety Authority (EFSA), VPBO diklasifikasikan sebagai
berpotensi genotoksik, bersama dengan 19 pewarna lainnya, karena kurangnya pengetahuan
mengenai genotoksisitasnya (ECHA;EFSA dkk., 2017). VPBO telah ditemukan secara efisien
mengikat DNA dan memediasi penghancuran fotokimiawi dalam sel tumor.Lewis dan Indig,
2001, 2002).
Berdasarkan informasi yang terisolasi ini dan pemodelan menggunakan pendekatan
kuantitatif struktur-aktivitas hubungan (QSAR), EFSA menyimpulkan bahwa VPBO harus
dianggap genotoksik (EFSA dkk., 2017). Pewarna ditugaskan ke grup I berdasarkan pohon
keputusan yang menerapkan nilai skrining toksikologi (TSV) 0,0025Mg kg-1 berat badan per
hari (EFSA dkk., 2017). TSV ini bisa menjadi dasar dalam waktu dekat jika EFSA menetapkan
Reference Point for Action (RPA), sebuah batasan tindakan terkait obat-obatan veteriner ilegal
yang ditemukan dalam produk makanan hewani. Kecurigaan toksisitas baru-baru ini didukung
oleh sebuah penelitian dalam kerangka program nasional Tox21 di Amerika Serikat. Toksisitas
10.000 bahan kimia telah dipelajari dalam 70 tes sel berbeda yang mencakup lebih dari 200 jalur
pensinyalan sel. Sementara MG berada di peringkat di antara 30 obat paling aktif, VPBO (biru
dasar 7) adalah senyawa paling aktif di antara kontaminan lingkungan (Ngan dkk., 2019).
 Selain itu, struktur VPBO, pewarna kationik yang berasal dari keluarga triarylmethane
dengan penggantian gugus aril dan gugus metil masing-masing oleh gugus naftil dan gugus etil,
dapat menghasilkan sifat fisikokimia tertentu yang terkait dengan senyawa terkenal. Malachite
Green (MG) dan Crystal Violet (CV). Mungkin yang paling banyak digunakan dari bahan kimia
ini adalah MG, yang merupakan fungisida paling populer di peternakan dan ikan peliharaan dan
juga efektif melawan ektoparasit dalam kondisi parasit protozoa tertentu (Alderman, 1985;
Srivastava dkk., 2004). Karena MG dan metabolit utamanya Leuco-Malachite Green (LMG)
memiliki beberapa efek toksik pada sel mamalia, MG tidak pernah terdaftar sebagai produk obat
hewan di Uni Eropa; ini juga kasus untuk Crystal Violet. Administrasi Makanan dan Obat-obatan
Amerika Serikat juga tidak menyetujui penggunaan pewarna ini (Culp et al., 1999; Srivastava
dkk., 2004; Verdon dkk., 2015). Meskipun toksisitasnya pada manusia dan ikan, MG dan CV
masih digunakan di seluruh dunia, mungkin karena tidak ada obat farmasi lain yang terbukti
efektif, dan terlalu sedikit perawatan terapeutik yang saat ini disetujui dalam budidaya ikan
(Schnick, 1988; Sudova dkk., 2007; Okocha et al., 2018). Telah ditemukan bahwa obat-obatan
terlarang kadang-kadang diganti dengan obat-obatan terlarang yang serupa atau campuran zat-zat
ini (Dervilly-Pinel et al., 2015; Gallart-Ayala dkk., 2015).
Meskipun LMG adalah penanda residu utama dari perlakuan ilegal MG dalam praktik
akuakultur, tidak ada penanda residu yang pernah ditentukan untuk keluarga pewarna Victoria
dan khususnya, untuk VPBO. Sebelumnyain vitro Studi di rainbow trout yang melibatkan
inkubasi fraksi subselular dengan pewarna menunjukkan bahwa metabolit utamanya adalah
deethylVPBO (Dubreil dkk., 2020b). Sebelumnya vivo Studi metabolomik pada ikan rainbow
trout yang dirawat mengarah pada penemuan penanda asam empedu endogen tertentu dan juga
dua metabolit VPBO (Dubreil dkk., 2019b, 2020a). Sejauh pengetahuan kami, tidak ada studi
farmakokinetik yang pernah dilakukan pada senyawa VPBO pada ikan. Namun, beberapa
penelitian menggambarkan farmakokinetik MG dan LMG. MG cepat diserap pada spesies ikan
yang berbeda, sebagian tergantung pada pH dan suhu air di kolam, dan direduksi menjadi
leucoform (LMG) yang tetap berada di jaringan untuk waktu yang lama (Alderman dan Clifton-
Hadley, 1993; ibu- chova- dkk., 1996; Plakas et al., 1996; Bergwerff et al., 2004; Jiang dkk.,
2009; Bajc et al., 2011; Kwan dkk., 2020).
1.2 Rumusan Masalah
1. Bagaimanakah identifikasi metabolit utama VPBO pada ikan trout pelangi yang dirawat?
2. Bagaimanakah mengkarakterisasi distribusi jaringan VPBO dan metabolit utama yang
ditemukan pada ikan rainbow trout yang dirawat selama periode penyerapam dan
pembersihan?
3. Bagaimanakah memperkirakan dan membandingkan waktu paruh VPBO dan metabolit
utamanya di otot dan kulit?

1.3 Tujuan
1. Untuk mengidentifikasi metabolit utama VPBO pada ikan trout pelangi yang dirawat
2. Untuk mengkarakterisasi distribusi jaringan VPBO dan metabolit utamanya yang
ditemukan pada ikan rainbow trout yang dirawat selama periode penyerapan dan
pembersihan
3. Untuk memperkirakan dan membandingkan waktu paruh VPBO dan metabolit utamanya
di otot dan kulit
4. Untuk menyarankan penanda residu pada jaringan yang dapat dimakan (otot dan kulit)
untuk penilaian keamanan pangan yang sesuai.

BAB II
PEMBAHASAN

2.1
Reagen dan standar analitis Bahan standar Victoria Pure Blue BO (VPBO), dan standar internal
(IS) Malachite Green-d5 (MG-d5), dibeli dari Sigma-Aldrich (Eropa). IS Crystal Violet-d6 (CV-
d6) diperoleh dari WITEGA (Berlin, Jerman). MG-d5 digunakan untuk mengoreksi area puncak
MG dan CV-d6 untuk VPBO. Untuk pengujian analitik, larutan stok VPBO disiapkan pada
100Mg mL -1 dalam metanol (tidak didedikasikan untuk studi hewan). Larutan stok selanjutnya
diencerkan untuk mendapatkan beberapa konsentrasi mulai dari 0,01Mg mL-1 ke 1 Mg mL-1.
Standar internal disiapkan pada 0,1 mg mL-1 dalam asetonitril. Untuk percobaan rainbow trout,
larutan stok VPBO disiapkan pada 1000Mg mL-1 dalam air. Asetonitril, metanol, amonium
asetat, dan asam format memiliki tingkat analitik yang sesuai (tingkat HPLC). Air dimurnikan
menggunakan sistem Milli-Q (Millipore, Taunton, MA, USA).

2.2. Desain studi eksperimental

Penelitian ini dilakukan untuk mengevaluasi kinetika serapan dan depurasi senyawa induk dan
metabolit utamanya. Sebanyak 100 trout pelangi bebas patogen spesifik termasuk campuran
jantan dan betina dari kelompok genetik yang sama digunakan dalam percobaan ini. Mereka
ditangani di fasilitas yang dilindungi dan dipantau dari ANSES Plouzane- situs laboratorium
(Prancis). Ikan pada kelompok penelitian berumur satu tahun, dengan berat 105 . ± 25 g dan
panjang 15 ± 2 cm. Mereka diberi makan pelet kering komersial 1,5% berat badan (Neo Prima 4,
Le Gouessant Aquaculture, Prancis) sekali sehari. Tangki percobaan 400 L dipertahankan dalam
sirkuit terbuka dengan air sungai segar yang dimurnikan pada laju aliran 0,3 m3 H-1 (suhu 13 ±
1 C, oksigen terlarut < 90%, pH mendekati 8, dan bebas nitrat dan nitrit) selama percobaan.
Tangki dipertahankan dalam siklus terang/gelap alami (14 jam/10 jam di musim semi, kira-kira)
di ruangan dengan perubahan volume udara setiap jam. Setelah satu minggu aklimatisasi, 20
ekor ikan kontrol bebas pajanan dikumpulkan dan di-eutanasia untuk mendapatkan matriks
blanko. Sistem kemudian diposisikan dalam konfigurasi sirkuit tertutup di mana tangki terkena
0,1 mg.L-1 VPBO dengan menambahkan 40 mL larutan standar yang dilarutkan dalam air pada
1 gL-1 ke dalam tangki (dosis 40 mg.kg-1 bw Dari VPBO). Setelah periode akumulasi 24 jam,
ikan dipindahkan ke tangki baru, untuk periode depurasi 64 hari di sirkuit terbuka air sungai
segar yang dimurnikan. Enam ikan diambil sampelnya secara acak pada beberapa tanggal
pengambilan sampel: - selama periode paparan 24 jam pada: 0,083, 0,25, 0,417 dan 1 hari. -
pasca perawatan selama periode depurasi pada 2, 3, 5, 9, 17, 34, 49 dan 65 hari. Untuk setiap
ikan, 1 mL darah diambil dari vena ekor dengan menggunakan vacutainer lithium heparin (BD
Vacutainer LH 85 IU). Sampel darah utuh disentrifugasi (1200G, 10 menit, 4 C) dan plasma
disimpan pada -80 C. Ikan di-eutanasia setelah diambil darahnya dengan pemingsanan perkusi
dengan pukulan kepala, kemudian diukur dan ditimbang. Hati dan otot dengan kulit dikeluarkan
dan disimpan pada -80 C untuk analisis selanjutnya. Kulit dipisahkan dari otot sebelum
dibekukan. European Medicines Agency (EMA) telah mengindikasikan bahwa jaringan target
yang dianggap tepat untuk Salmonidae adalah otot termasuk kulit, dalam proporsi alami, sebagai
jaringan yang dapat dimakan pada ikan. Namun, untuk tujuan penilaian keamanan pangan untuk
obat terlarang, diputuskan untuk memisahkan otot dan kulit untuk mendapatkan gambaran yang
jelas tentang kontaminasi pada jaringan individu (CVMP, 1998). Studi ini telah disetujui oleh
Komite Etika Prancis No.16, nomor referensi 12222e201.711.161.618.463.

2.3 Persiapan Sampel untuk studi VPBO di otot, plasma, kulit dan hati
Sampel ditimbang (2 g otot campuran, 200 ML plasma, 200 mg kulit campuran, 200 mg hati
campuran) dan dipindahkan ke tabung sentrifus. Lalu 100ML untuk otot atau 10 ML untuk
plasma, kulit, dan hati dari larutan standar internal (MG-d5 dan CV-d6 pada 50 MgL-1 dalam
asetonitril) ditambahkan. Sampel divorteks dan didiamkan selama 10 menit dalam gelap.
Kemudian ditambahkan asetonitril: 8 mL untuk otot, 1 mL untuk plasma, kulit, dan hati). Sampel
diaduk dengan vortex untuk menghomogenkan bahan dengan pelarut. Sampel selanjutnya
ditempatkan pada pengocok putar mekanis selama 15 menit pada 100 rpm, dan kemudian
ditempatkan dalam penangas ultrasound selama 5 menit pada 20 C± 2 C. Sampel disentrifugasi
selama 10 menit pada 20.000 G didinginkan pada 4 C. Supernatan dipindahkan ke tabung
polipropilen dan diuapkan sampai kering di bawah aliran nitrogen lembut pada 50 C. Ekstrak
kering dilarutkan dengan ultrasound dalam asetonitril/air untuk rekonstitusi (80/20, v/v) (500 ML
untuk otot, 200 ML untuk plasma, kulit, dan hati), dan vortexmixed. Residu untuk otot
diekstraksi melalui 0,45Mm filter PVDF jarum suntik, dan residu untuk matriks lainnya
diekstraksi dengan sentrifugasi selama 5 menit pada 20.000 G didinginkan di th4 C. Sampel
dipindahkan ke vial LC.

2.4. Kromatografi cair-analisis spektrometri massa resolusi tinggi

Penyelidikan metabolisme dilakukan dalam dua langkah: pertama konsentrasi senyawa induk
diukur melalui metode LC-HRMS kuantitatif, dan kemudian pembentukan metabolit dipelajari
melalui perangkat lunak penelitian metabolit Met-Works®. Kromatografi dilakukan pada sistem
Thermofisher U-HPLC Accela (Bremen, Jerman), dilengkapi dengan kolom Phenomenex Luna
C18 (2) (Phenomenex, Torrance, CA, USA) (150 2,0 mm, 3 MM). Larutan rekonstitusi akhir
untuk sampel setelah ekstraksi dibuat dengan mencampur 80% asetonitril dengan 20% air.
Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan menggunakan dua preparat fase gerak yang
terdiri dari fase gerak (A), campuran amonium asetat 10 mM.L.-1 dan 0,1% asam format, dan
fase gerak (B), 100% asetonitril. Kondisi gradien adalah sebagai berikut: dari 0 hingga 4 menit,
naikkan secara linier dari 98 menjadi 2% dari fase gerak A dan tahan selama 4 menit, lalu
naikkan kembali selama 0,1 menit ke kondisi awal dan tahan selama 4 menit untuk
menyeimbangkan kembali sistem. Laju aliran diatur pada 0,2 mL min-1, volume injeksi adalah
10 ML, dan oven kolom dipertahankan pada 25 C. Spektrometer massa LTQ Orbitrap XL
(Thermofisher, Bremen, Jerman) dioperasikan dengan probe ionisasi elektrospray dalam mode
positif, menggunakan parameter sumber berikut: laju aliran gas selubung: 30 arb; laju aliran gas
tambahan: 10 arb; menyapu laju aliran gas: 2 arb; tegangan semprotan ion: 5 kV; suhu kapiler:
275 C; tegangan kapiler: 35 V; dan lensa tabung: 90 V. Instrumen dikalibrasi menggunakan
larutan kalibrasi pabrikan, untuk mencapai akurasi massa dalam 1ekisaran 3ppm. Instrumen
dioperasikan dalam mode pemindaian penuh darim/z 100e1.000, dengan daya pisah 60.000
(lebar penuh pada setengah maksimum), memungkinkan deteksi VPBO sebagai VPBOth ion,
serta penyelidikan pembentukan metabolit menggunakan perangkat lunak metabolisme
MetWorks 1.3.0. SP1 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Massa yang tepat dari
puncak yang terdeteksi oleh perangkat lunak ini diekstraksi dengan jendela massa 5 ppm di
sekitar ion prekursor terionisasi, untuk mengkonfirmasi atau membuang identitasnya. Untuk
konfirmasi identitas metabolit utama (deethylleuco-VPBO), MS2 fragmentasi massa senyawa
dilakukan dalam penganalisis massa LTQ-Orbitrap. Energi untuk disosiasi akibat tumbukan
(CID) ditetapkan pada 35 eV dan 70 eV, dengan lebar isolasim/z 1.

2.5 Validasi metode analisis untuk VPBO

Kurva kalibrasi dibuat dengan spiking otot, plasma, kulit, dan hati sebelum ekstraksi dengan
VPBO, dengan konsentrasi sebagai berikut: 0,5, 1, 5, 10, dan 50 Mg kg-1. Sampel kalibrasi ini
disiapkan dan dianalisis dalam rangkap dua pada tiga hari yang berbeda untuk otot, dan masing-
masing 1 hari untuk plasma, kulit, dan hati untuk menggabungkan tiga seri. Protokol ini dipilih
untuk memilih fungsi respon yang paling tepat. Standar validasi adalah sampel yang dilarutkan
dengan matriks yang mengandung konsentrasi analit yang diketahui. Ini disiapkan pada tiga
tingkat konsentrasi yang sesuai dengan tingkat konsentrasi rendah (perkiraan batas kuantifikasi),
menengah, dan tinggi: 0,5, 5 dan 50Mg kg-1 dari VPBO. Sampel validasi ini disiapkan dan
dianalisis dalam rangkap tiga pada tiga hari berturutturut untuk otot, dan masing-masing 1 hari
untuk plasma, kulit, dan hati untuk menggabungkan tiga rangkaian dari tiga hari. Analisis
statistik data validasi didasarkan pada profil akurasi menggunakan e. baru® perangkat lunak,
Versi 4.1 b (Pharmalex, Lie -ge, Belgia). Konsentrasi sampel validasi dihitung dari hasil
eksperimen untuk menentukan bias relatif rata-rata, pengulangan, presisi menengah, danB-batas
interval toleransi harapan dengan tingkat 90%. Batas penerimaan ditetapkan pada± 50%.

2.6. Analisis farmakokinetik

Untuk dosis selama periode pengobatan dan pembersihan, konsentrasi di bawah batas bawah
kuantifikasi (LOQ) dibuang. Sampel di atas LOQ atas diencerkan untuk masuk ke kisaran yang
divalidasi. Kurva kalibrasi matriks-cocok dilakukan untuk dosis VPBO dalam beberapa batch.
Persamaan kurva dari dosis VPBO digunakan untuk menilai konsentrasi DLVPBO, dengan
asumsi respon spektrometri massa akan setara, karena tidak ada standar analitis khusus yang
tersedia secara komersial untuk metabolit ini. Model non-kompartemen digunakan untuk
menentukan parameter farmakokinetik. Semua analisis farmakokinetik adalah dilakukan dengan
perangkat lunak Phoenix WinNonlin 8.2 (Certara, Saint Louis, MO, USA).

2.6.1. Analisis non-kompartemen

Data yang diamati jarang; satu titik per hewan dan enam hewan per titik waktu digunakan.
Dalam jenis desain ini, tidak mungkin untuk membedakan variabilitas antar-individu dari intra-
individu, dan akibatnya analisis ini berfokus pada parameter rata-rata dan bukan pada variabilitas
antar-individu. Oleh karena itu, hanya mungkin untuk menghitung kesalahan standar rata-rata
(SEM) untuk dua parameter C maksimal dan AUCterakhir. Konsentrasi maksimum (Cmaksimal)
dan waktu untuk mencapainya (T maksimal) diperkirakan dari setiap konsentrasi jaringan versus
profil waktu. Untuk plasma atau jaringan, luas total di bawah kurva waktu (AUC info)
ditentukan menggunakan aturan trapesium linier dengan ekstrapolasi hingga tak terhingga.
Ekstrapolasi AUC(Clast-inf) didasarkan pada persamaan berikut:
C AUCDinfo-klast TH ¼ terakhir akuz (ini harusnya rumus tp gk bsa copas
di mana C terakhir adalah konsentrasi terakhir yang diamati dan akuz kemiringan fase terminal.
Akibatnya, AUCinfo dihitung dengan:
AUCinfo ¼AUCD0-klasTH th AUCDinfo-klast TH (ini harusnya rumus tp gk bsa copas
di mana AUCD0-klasTH adalah AUC antara 0 dan Cterakhir. Kemiringan terminal diperkirakan
dari bagian linier fase terminal oleh setidaknya tiga titik, dan dilestarikan jika koefisien
determinasi r2 adalah >0,95. Waktu paruh senyawa (t1/2 akuz) ditentukan dengan menggunakan
akuz dengan rumus berikut: 0:693 T1=2 akuz ¼ akuz Area parsial juga diestimasi dengan
metode trapesium linier antara [0-1d], [1-5d], [5-17d], dan [17d-65d] yaitu periode perawatan,
periode depurasi pertama, periode kedua dan terakhir. periode setelah perawatan masing-masing.
Waktu tinggal rata-rata (MRT) dihitung menggunakan aturan trapesium linier antara 0 dan
Cterakhir atau dengan ekstrapolasi hingga tak terhingga. Pembersihan total tubuh yang jelas
(Cltot/F) dan volume distribusi nyata pada kondisi tunak (Vss/F) juga ditentukan oleh: Dosis
AUCinfo CLtot=F ¼ dan. Vss=F ¼ MRT x CLss Untuk kedua senyawa induk dan metabolit
utamanya, waktu untuk mencapai konsentrasi pada LOQ tidak diukur. Namun, itu diperkirakan
dengan ekstrapolasi menggunakan persamaan eksponensial sederhana yang ditentukan oleh laju
eliminasi dan volume distribusi yang tampak. 3.2. Metabolit VPBO Metabolit dideteksi dari total
arus ion kromatogram di otot, plasma, kulit, dan hati oleh perangkat lunak MetWorks, dan
metabolit kemudian diidentifikasi secara tentatif berdasarkan massa akurat, kesalahan massa, dan
waktu retensi dibandingkan dengan waktu retensi VPBO. Seperti yang ditunjukkan padaTabel 1,
terdapat total 15 metabolit VPBO yang ditemukan pada ikan rainbow trout. Massa yang tepat
dan terukur cocok dengan kesalahan massa di bawah 5 ppm, memberikan dukungan untuk
komposisi unsur metabolit yang diusulkan. Selama masa pengobatan, jumlah total metabolit
mengikuti urutan: hati > ototkamu plasma > kulit. Jika tidak, selama periode pembersihan,
jumlah total dari C ¼Sebuah e-lz T Dimana C adalah konsentrasi jaringan, akuz adalah laju
eliminasi dan A adalah konstanta nyata yang dipasang.

2.6.2. Analisis statistik Parameter farmakokinetik

Analisis statistik Parameter farmakokinetik (AUCterakhir, Cmaksimal) dinyatakan sebagai
sarana aritmatika, dengan kesalahan standar yang terkait dari ratarata. Metodologi sparse NCA
menghitung parameter farmakokinetik berdasarkan profil rata-rata untuk semua individu dalam
kumpulan data. Objek NCA menghitung kesalahan standar untuk nilai maksimum kurva
konsentrasi rata-rata (Cmax), dan untuk area di bawah kurva konsentrasi rata-rata dari waktu
dosis hingga waktu pengamatan akhir. Parameter ini diperoleh di otot dan kulit untuk VBPO dan
DLVBPO dibandingkan dengan aT-tes. Tingkat signifikansi 5% dipertahankan.