LAPORAN PRAKTIKUM KI3061

BIOKIMIA UMUM
PERCOBAAN 4
PENGENALAN ANALISIS BIOINFORMATIKA

Disusun oleh:
Nama : I Putu Ikrar Satyadharma
NIM : 11218036
Kelompok :6
Tanggal Percobaan : 03 April 2020
Tanggal Pengumpulan : 11 April 2020

LABORATORIUM BIOKIMIA
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2020
I. TUJUAN
1. Menentukan kekerabatan Bacillus aquamaris MKSC.2 dengan spesies bacillus lainnya

menggunakan sekuens asam amino -amilase (baqA) menggunakan analisis Multiple

Sequence Alignment, serta pendekatan pohon filogenetik dari software FastTree dan

PhyML bootstrap;

2. Menentukan motif khas -amilase Bacillus aquamaris MKSC.2;

3. Menentukan desain primer untuk amplifikasi gen pengkode Amilase Bacillus aquamaris

MKSC.2 (baqA) yang baik dalam PCR.

II. TEORI DASAR

Bioinformatika adalah bidang interdisiplin yang bergerak dalam menyimpan,

mendapatkan, dan menganalisis informasi biologis dalam jumlah besar. Bioinformatika

melibatkan ahli dari berbagai bidang seperti, ahli biologi, ahli biomolekuler, ahli komputer,

dan matematikawan. Bioinformatika mencakup studi biologi yang menggunakan

pemrograman komputer sebagai bagian dari metodenya, serta analisis tertentu dan khusus yang

berulang kali digunakan, khususnya di bidang genomik. Penggunaan umum bioinformatika

meliputi identifikasi gen kandidat dan polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) yang sering

dilakukan dengan tujuan untuk lebih memahami genetika dari penyakit, adaptasi unik, sifat-

sifat yang diinginkan dalam suatu individu (biasanya pada spesies tanaman pertanian), atau

perbedaan antar populasi. Secara tidak formal, bioinformatika juga mencoba memahami

prinsip-prinsip organisasi dalam rangkaian atau sekuens asam nukleat dan protein, yang disebut

proteomik (Lesk, 2013). Salah satu peran paling penting dari bioinformatika adalah basis data

dari sekuens biologis. Basis data utama untuk sekuens asam nukleat saat ini adalah GenBank

(Amerika Serikat), EMBL (European Moleculer Biology Laboratory, Eropa), dan DDBJ (DNA

Data Bank of Japan, Jepang). Sementara itu, contoh beberapa basis data penting yang

menyimpan sekuens primer protein adalah PIR (Protein Information Resource, Amerika

Serikat), Swiss-Prot (Swiss), dan TrEMBL (Eropa). Ketiga basis data tersebut telah
digabungkan dalam UniProt (Sukmawati, 2015). Penggunaan database dari sekuen data yang

ada adalah untuk mengidentifikasi homolog pada molekul baru yang telah disekuenskan di

laboratorium. Pencarian database didasarkan pada hasil alignment atau penyejajaran sekuen

DNA dan protein. Pencarian ini berguna untuk mendapatkan fungsi ketika membandingkan

sekuen DNA/protein yang didapat dengan yang ada dalam database. Tujuan adanya

bioinformatika diantaranya adalah untuk melihat kekerabatan organisme yang berguna untuk

identifikasi agen penyakit baru, mendiagnosa penyakit baru, dan penemuan obat. Perangkat

lunak pencari database yang menjadi standar adalah BLAST (Basic Local Alignment Search

Tool) yaitu program pencarian kesamaan yang didesain untuk mengeksplorasi semua database

sekuen yang diminta (DNA atau protein) dan untuk mendeteksi hubungan antara sekuen yang

memiliki kesamaan (Aprijani dan Elfaizi, 2004).

Multiple sequence alignment (MSA) atau persejajaran urutan jamak adalah metode

persejajaran lebih dari dua sekuens protein, asam nukleat, atau RNA untuk melihat homologi

secara keseluruhan maupun parsial, yang akan digunakan untuk menentukan kekerabatan

antara spesies tertentu (Mount, 2004). Pada praktikum kali ini praktikan menggunakan layanan

jaringan dari https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw untuk melakukan Multiple sequence

alignment. Pada praktikum ini praktikan menggunakan 11 data sekuens dari 11 spesies bakteri

Bacillus yaitu, dengan Bacillus aquimaris MKSC.2 dengan accession number Genbank:

JN797599.1 sebagai subjek utama dari pengamatan. Hasil dari Multiple sequence alignment

akan dialurkan menjadi sebuah pohon filogenetik.

Amilase merupakan enzim yang memecah pati atau glikogen menjadi molekul yang

lebih sederhana. Enzim ini terdapat pada berbagai organisme hidup, mulai dari bakteri sampai

manusia. Amilase dibedakan menjadi tiga: (1) α-amilase, memotong ikatan pati secara acak

dan menghasilkan gula yang lebih sederhana dalam bentuk glukosa; (2) β-amilase, memotong

ikatan glukosa-glukosa dengan memutuskan dua unit glukosa dalam satu waktu sehingga yang
dihasilkan adalah maltosa; dan (3) amiloglukosidase, adalah enzim yang memutus ikatan dari

ujung non-reduksi dari rantai lurus yang menghasilkan glukosa (Sindhu, et al.,2017).

Pohon filogenetik adalah sebuah diagram dari sekelompok spesies (taksa) yang

menggambarkan hubungan evolusi di antara spesies. Studi tentang filogeni tidak hanya

membantu mengidentifikasi hubungan historis antara sekelompok organisme, tetapi juga

mendukung beberapa penelitian biologi lainnya seperti desain obat dan vaksin, prediksi

struktur protein, penyelarasan urutan ganda dan sebagainya (Linder & Warnow, 2005). Dalam

pembuatan pohon filogenetik terdapat beberapa tools yang dapat digunakan. Dalam praktikum

ini praktikan menggunakan tool FastTree dan PhyML yang masing-masing memiliki algoritma

tersendiri dalam menyimpulkan hasil kekerabatan menggunakan prinsip perkiraan-

kemungkinan-maksimum, dan kemungkinan-maksimum. Motif khas dalam praktikum ini

didefinisikan sebagai perbedaan asam amino pada sekuens antara amilase dari Bacillus

aquimaris MKSC.6 dengan amilase bakteri bacillus lainnya yang digunakan pada praktikum

ini.

Polymerase Chain Reaction atau disingkat PCR memungkinkan sintesis fragmen DNA

spesifik menggunakan enzim DNA-polimerase, yang mengambil bagian dalam replikasi materi

genetik seluler. Enzim ini mensintesis urutan pelengkap DNA, karena sebuah fragmen kecil

(primer) terhubung ke salah satu untai DNA di situs spesifik yang dipilih untuk memulai

sintesis. Primer membatasi urutan yang akan direplikasi dan hasilnya adalah amplifikasi urutan

DNA tertentu dengan miliaran salinan Primer (Mullis, 1990 & Novais et al., 2004). Kualitas

PCR dipengaruhi oleh kualitas desain primer yang digunakan. Desain primer yang baik

mempertimbangkan panjang primer, primer melting temperature, primer annealing

temperature, kandungan basa nitrogen G dan C, struktur sekunder, ada tidaknya self-

complementary (SC) dan pair-complementary (PC), pengulangan basa, specificity atau

keunikan, panjang produk, dan restriction site. Primer merupakan molekul oligonukleotida
 untai tunggal yang kira-kira terdiri dari 30 basa. Primer yang baik adalah primer yang spesifik.

Primer yang tidak spesifik menyebabkan teramplifikasinya daerah lain dalam genom yang

tidak dijadikan sasaran atau sebaliknya (Saraswati et al., 2019). Pada praktikum kali ini

praktikan menggunakan layanan web https://blast.ncbi.nlm.nih.gov dan didapatkan primer dari

Bacillus aquimaris MKSC.2

III. DATA PENGAMATAN

3.1 Penyejajaran urutan (Multiple sequence alignment) dan penentuan kekerabatan

melalui pendekatan pohon filogenetik

Berikut ini adalah hasil multiple sequence alignment menggunakan layanan jaringan

dari https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw

Keterangan:

tr|G8IJA7|G8IJA7_9BACI : Bacillus aquimaris

tr|A0A0P6WIZ1|A0A0P6WIZ1_9BACI : Bacillus vietnamensis
tr|A0A0M0GSF5|A0A0M0GSF5_9BACI : Bacillus marisflavi
tr|A0A3A1R0T6|A0A3A1R0T6_9BACI : Bacillus salacetis
tr|A0A223KM47|A0A223KM47_9BACI : Bacillus cohnii
sp|P06278|AMY_BACLI : Bacillus licheniformis
sp|P00692|AMY_BACAM : Bacillus amyloliquefaciens
sp|P06279|AMY_GEOSE : Geobacillus stearothermophilus (B.
stearothermophilus)
sp|P08137|AMY_BACCI : Bacillus circulans
sp|P20845|AMY_BACME : Bacillus megaterium
sp|P00691|AMY_BACSU : Bacillus subtilis (strain 168)

tr|G8IJA7|G8IJA7_9BACI -------MKRRVLSLILVPFLLFYALPVG--AVEKEERKWQDETIYFLMV
tr|A0A0P6WIZ1|A0A0P6WIZ1_9BACI -------MKRRVLSLILVPFLLFYALPVG--AVEKEERKWQDETIYFLMV
tr|A0A0M0GSF5|A0A0M0GSF5_9BACI -------MKRRVLSLILVPFLLFYAHPVG--AAEKEERMWQDESIYFLMV
tr|A0A3A1R0T6|A0A3A1R0T6_9BACI -------MKKRVLSLILIPFLLFYALPAG--AAEKEERTWQDESIYFLMI
tr|A0A223KM47|A0A223KM47_9BACI -------MKKRVLLLILVPFLLFSSFNAPSVQAEKEEHAWQDEIIYFIMT
sp|P06278|AMY_BACLI --------------MKQQKRLYARLLTLLFALIFLLPHSAAAAANLNGTL
sp|P00692|AMY_BACAM --------------MIQKRKRTVSFRLVLMCTLLFVSLPITKTSAVNGTL
sp|P06279|AMY_GEOSE --------MLTFHRIIRKGWMFLLAFLLTALLFCPTGQPAKAAAPFNGTM
sp|P08137|AMY_BACCI MNKKWLNIPALIALLAAIAFGSVAPAEAAPATSVSNKQNFSTDVIYQIVT
sp|P20845|AMY_BACME -----MKGKKWTALALTLPLAASLSTGVDAETVHKGKAPTADKNGVFYEV
sp|P00691|AMY_BACSU ------MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETANKSNELTA

tr|G8IJA7|G8IJA7_9BACI DRFNNGDPTNDKE------VNTKDPKAYHGGDFQGVIDRL--DYIKDMGF
tr|A0A0P6WIZ1|A0A0P6WIZ1_9BACI DRFNDGDTSNDKD------VNTKDPKAYQGGDFQGIIDKL--DYIKDMGF
tr|A0A0M0GSF5|A0A0M0GSF5_9BACI DRFNNGDSSNDKN------VDANDPLSYQGGDFQGIIDRL--DYIQEMGF
tr|A0A3A1R0T6|A0A3A1R0T6_9BACI DRFNNGDQSNDFD------VNRKDPKAYQGGDFQGVIDQL--DYIKEMGF
tr|A0A223KM47|A0A223KM47_9BACI DRWNNGDTSNDYE------VDRNDPKAYHGGDFKGIMDRL--DYISDMGF
sp|P06278|AMY_BACLI MQYFEWYMPND------------------GQHWKRLQNDS--AYLAEHGI
sp|P00692|AMY_BACAM MQYFEWYTPND------------------GQHWKRLQNDA--EHLSDIGI
sp|P06279|AMY_GEOSE MQYFEWYLPDD------------------GTLWTKVANEA--NNLSSLGI
sp|P08137|AMY_BACCI DRFVDGNTANNPAGSAYDATCSTNLKLYCGGDWQGIMNKINDGYFTGMGI
sp|P20845|AMY_BACME YVNSFYDANKDGHG-----------DLKGLTQKLDYLNDGNSHTKNDLQV
sp|P00691|AMY_BACSU PSIKSGTILHAWN-------------------WSFNTLKHNMKDIHDAGY

tr|G8IJA7|G8IJA7_9BACI
tr|A0A0P6WIZ1|A0A0P6WIZ1_9BACI
tr|A0A0M0GSF5|A0A0M0GSF5_9BACI
tr|A0A3A1R0T6|A0A3A1R0T6_9BACI
tr|A0A223KM47|A0A223KM47_9BACI
sp|P06278|AMY_BACLI
sp|P00692|AMY_BACAM
sp|P06279|AMY_GEOSE
sp|P08137|AMY_BACCI
sp|P20845|AMY_BACME
sp|P00691|AMY_BACSU
tr|G8IJA7|G8IJA7_9BACI
tr|A0A0P6WIZ1|A0A0P6WIZ1_9BACI
tr|A0A0M0GSF5|A0A0M0GSF5_9BACI
tr|A0A3A1R0T6|A0A3A1R0T6_9BACI
tr|A0A223KM47|A0A223KM47_9BACI
sp|P06278|AMY_BACLI
sp|P00692|AMY_BACAM
sp|P06279|AMY_GEOSE
sp|P08137|AMY_BACCI
sp|P20845|AMY_BACME
sp|P00691|AMY_BACSU
tr|G8IJA7|G8IJA7_9BACI
tr|A0A0P6WIZ1|A0A0P6WIZ1_9BACI
tr|A0A0M0GSF5|A0A0M0GSF5_9BACI
tr|A0A3A1R0T6|A0A3A1R0T6_9BACI
tr|A0A223KM47|A0A223KM47_9BACI
sp|P06278|AMY_BACLI
sp|P00692|AMY_BACAM
sp|P06279|AMY_GEOSE
sp|P08137|AMY_BACCI
sp|P20845|AMY_BACME
sp|P00691|AMY_BACSU
tr|G8IJA7|G8IJA7_9BACI
tr|A0A0P6WIZ1|A0A0P6WIZ1_9BACI
tr|A0A0M0GSF5|A0A0M0GSF5_9BACI
tr|A0A3A1R0T6|A0A3A1R0T6_9BACI
tr|A0A223KM47|A0A223KM47_9BACI
sp|P06278|AMY_BACLI
sp|P00692|AMY_BACAM
sp|P06279|AMY_GEOSE
sp|P08137|AMY_BACCI
sp|P20845|AMY_BACME
sp|P00691|AMY_BACSU
tr|G8IJA7|G8IJA7_9BACI
tr|A0A0P6WIZ1|A0A0P6WIZ1_9BACI
tr|A0A0M0GSF5|A0A0M0GSF5_9BACI
tr|A0A3A1R0T6|A0A3A1R0T6_9BACI
tr|A0A223KM47|A0A223KM47_9BACI
sp|P06278|AMY_BACLI
sp|P00692|AMY_BACAM
sp|P06279|AMY_GEOSE
sp|P08137|AMY_BACCI
sp|P20845|AMY_BACME
sp|P00691|AMY_BACSU
.
TSIWLTPVFDNQP----------KGYHGYWITDFYKTDEH---------F
TAIWLTPIFDNQP----------MGYHGYWITDFYKTEEH---------F
TAIWLTPIFENQP----------GGYHGYWTTDYYKTEEH---------F
TTIWLTPVFDNQE----------KGYHGYWIKDFYNTDEH---------F
TAIWLTPIVKNES----------GGYHGYWAEDFYEVEEH---------F
TAVWIPPAYKGTS----------QADVGYGAYDLYDLGEFHQKGTVRTKY
TAVWIPPAYKGLS----------QSDNGYGPYDLYDLGEFQQKGTVRTKY
TALWLPPAYKGTS----------RSDVGYGVYDLYDLGEFNQKGAVRTKY
TALWISQPVENIYSVINYSGVNNTAYHGYWARDFKKTNPA---------F
NGIWMMPVNPSPS------------YHKYDVTDYYNIDPQ---------Y
TAIQTSPINQVKE----------GNQGDKSMSNWYWLYQPTSYQIGNRYL
. : :
GTMETFKKLVEEAHKRDMKVVLDFVVNHVGPEHPWVD-------------
GSMKTFKKLVEEAHKRDMKVMLDFVVNHVGPGHPWVN-------------
GSIETFKKLVEEAHKRDMKIILDFVVNHVGPEHPWVT-------------
GSIEKFKQLVEEAHNRDMKIILDFVVNHVGPDHEWLN-------------
GTLEEFKQLVEEAHKRDIKVIVDLVVNHTGYEHEWLN-------------
GTKGELQSAIKSLHSRDINVYGDVVINHKGGADATED-------------
GTKSELQDAIGSLHSRNVQVYGDVVLNHKAGADATED-------------
GTKAQYLQAIQAAHAAGMQVYADVVFDHKGGADGTEW-------------
GSMTDFANLISAAHSRNIKVVIDFAPNHTSPAMETNASFGENGKL---YD
GNLQDFRKLMKEADKRDVKVIMDLVVNHTSSEHPWFQAALKDKNSKYRDY
GTEQEFKEMCAAAEEYGIKVIVDAVINHTTSDYAAISN------------
*. . . .::: * . :*
-------DPAKEDWFHE-KQPMNFSDKESLQNAWLYGLPDLNTENPEVRE
-------DPEKKDWFHE-KQPMNFNNEESLQNAWLYDLPDLNTENPEVKN
-------DPAKADWFHE-KQTMNFEDEESVKNDWLYDLPDLNTENPEVKE
-------DPGKEDWFHE-KQPMNMNDDESLQNDWLYDLPDLNTENQEVRE
-------DPEKEDWFNPNRNISDWTNQEQVERGWIYGLPDLNQDNPEVRE
-------VTAVEVDPADRNRVISGEHRIKAWTHFHFPGRGSTYSDFKWHW
-------VTAVEVNPANRNQETSEEYQIKAWTDFRFPGRGNTYSDFKWHW
-------VDAVEVNPSDRNQEISGTYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRW
NGTLLGGYTGDTNGYFHHNGGTDFSTLKNGIYKNLYDLADLNHNNSTIDT
YIWADKNTDLNEKGSWGQQVWHKAPNGEYFYGTFWEGMPDLNYDNPEVRK
------EVKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQS
. . . ..
YLFDAAKWWIKETDVDGYRLDT---VRHVPQ--------DSWSDFSKEVK
YLFDAAKWWIKETDIDGYRLDT---VRHVPQ--------EFWDEFSDEVK
YLIDAAKWWIKETDIDGYRLDT---VKHVPK--------EFWKDFTKEVK
YLLDAARWWINETDIDGYRLDT---VRHVPQ--------DFWKEFTKAVK
YLLDMAKWWIEETNIDGYRLDT---VKHVPK--------SFWEEFTKEVK
YHFDGTDWDESRKLNRIYKFQG--KAWDWEV--------SNENGNYDYLM
YHFDGADWDESRKISRIFKFRGEGKAWDWEV--------SSENGNYDYLM
YHFDGVDWDESRKLSRIYKFRGIGKAWDWEV--------DTENGNYDYLM
YFKNAIRLWLD-MGIDGIRVDA---VKHMPF--------GWQKNWMSSIY
EMINVGKFWLK-QGVDGFRLDAALHIFKGQTPEGAKKNILWWNEFRDAMK
YLKRFLDRALN-DGADGFRFDAAKHIELPDDG-------SYGSQFWPNIT
. :. . :
SVKDDFYLLGEVFDR-----------------------------------
SVKEDFYLLGEVFDR-----------------------------------
AEKDDFYLLGEVFDT-----------------------------------
AEKEDFYLLGEVFDY-----------------------------------
SVKEDFFLIGEVWDT-----------------------------------
YADIDYDHPDVAAEI-----------------------------------
YADVDYDHPDVVAET-----------------------------------
YADLDMDHPEVVTEL-----------------------------------
SYKPVFTFGEWFLGTNE---------------------------------
KENPNVYLTGEVWDQ-----------------------------------
NTSAEFQYGEILQDSASRDAAYANYMDVTASNYGHSIRSALKNRNLGVSN
.
tr|G8IJA7|G8IJA7_9BACI
tr|A0A0P6WIZ1|A0A0P6WIZ1_9BACI
tr|A0A0M0GSF5|A0A0M0GSF5_9BACI
tr|A0A3A1R0T6|A0A3A1R0T6_9BACI
tr|A0A223KM47|A0A223KM47_9BACI
sp|P06278|AMY_BACLI
sp|P00692|AMY_BACAM
sp|P06279|AMY_GEOSE
sp|P08137|AMY_BACCI
sp|P20845|AMY_BACME
sp|P00691|AMY_BACSU
tr|G8IJA7|G8IJA7_9BACI
tr|A0A0P6WIZ1|A0A0P6WIZ1_9BACI
tr|A0A0M0GSF5|A0A0M0GSF5_9BACI
tr|A0A3A1R0T6|A0A3A1R0T6_9BACI
tr|A0A223KM47|A0A223KM47_9BACI
sp|P06278|AMY_BACLI
sp|P00692|AMY_BACAM
sp|P06279|AMY_GEOSE
sp|P08137|AMY_BACCI
sp|P20845|AMY_BACME
sp|P00691|AMY_BACSU
tr|G8IJA7|G8IJA7_9BACI
tr|A0A0P6WIZ1|A0A0P6WIZ1_9BACI
tr|A0A0M0GSF5|A0A0M0GSF5_9BACI
tr|A0A3A1R0T6|A0A3A1R0T6_9BACI
tr|A0A223KM47|A0A223KM47_9BACI
sp|P06278|AMY_BACLI
sp|P00692|AMY_BACAM
sp|P06279|AMY_GEOSE
sp|P08137|AMY_BACCI
sp|P20845|AMY_BACME
sp|P00691|AMY_BACSU
tr|G8IJA7|G8IJA7_9BACI
tr|A0A0P6WIZ1|A0A0P6WIZ1_9BACI
tr|A0A0M0GSF5|A0A0M0GSF5_9BACI
tr|A0A3A1R0T6|A0A3A1R0T6_9BACI
tr|A0A223KM47|A0A223KM47_9BACI
sp|P06278|AMY_BACLI
sp|P00692|AMY_BACAM
sp|P06279|AMY_GEOSE
sp|P08137|AMY_BACCI
sp|P20845|AMY_BACME
sp|P00691|AMY_BACSU
tr|G8IJA7|G8IJA7_9BACI
tr|A0A0P6WIZ1|A0A0P6WIZ1_9BACI
tr|A0A0M0GSF5|A0A0M0GSF5_9BACI
tr|A0A3A1R0T6|A0A3A1R0T6_9BACI
tr|A0A223KM47|A0A223KM47_9BACI
sp|P06278|AMY_BACLI
sp|P00692|AMY_BACAM
sp|P06279|AMY_GEOSE
sp|P08137|AMY_BACCI
sp|P20845|AMY_BACME
sp|P00691|AMY_BACSU
---------------------------------------DPQRIAEYNDV
---------------------------------------DPEKIAAYNGT
---------------------------------------DPEKIAEYNGV
---------------------------------------DPRNIAKYEGV
---------------------------------------DPRYVAAYEET
---------------------------------------KRWGTWYANEL
---------------------------------------KKWGIWYANEL
---------------------------------------KSWGKWYVNTT
---------------------------------------TDANNTYFANE
-----------------------------------------PEVVAPYYQ
ISHYASDVSADKLVTWVESHDTYANDDEESTWMSDDDIRLGWAVIASRSG
GIDGFVNFPQAEELRSVFNKPDTSMDRLFN---FWKYNETFYEDPYLMGT
GIDGFVNVPQAEEMRSVFQKPDTSLDRLFN---FWKYNETFYDNPYVMGT
GIDGFVNVPQAEEMRQVFKKPDTSMDRLFN---FWGYNQTFYENPYLMGT
GIDGFADFPQAQEMREVFQKPDVSMDRLFN---FWQYNQTYFENPYLMGT
GIDSFVDFALYNEISRVFSKPNESLGRLDT---IYAHNSTYFSNPNMLGT
QLDGFR-LDAVKHIKFSFLRDWVNHVREKTGKEMFTVAEYWQNDLGALEN
SLDGFR-IDAAKHIKFSFLRDWVQAVRQATGKEMFTVAEYWQNNAGKLEN
NIDGFR-LDAVKHIKFSFFPDWLSDVRSQTGKPLFTVGEYWSYDINKLHN
SGMSLLDFRFSQKVRQVFRDGSDTMYGLDS---MLSSTAADYYSVNDQVT
SLDSLFNFDLAGKIVSSVKAGNDQGIATAAA--ATDELFKSYNPNKIDGI
STPLFFSRPEGGGNGVRFPGKSQIGDRGSALFEDQAITAVNRFHNVMAGQ
: .
FIDNHDMERFTRLLVQENVFPGTRWKLALTYMYTTPGIPIVYYGSEIAMD
FIDNHDMERFTRMIVQEKLFPGTRWKLALTYMYTTPGIPIVYYGSEIAMD
FIDNHDMKRFTRLMVEEKEFPGTRWKLALTYMYTTPGIPILYYGSEIAVD
FIDNHDMVRFTNLITQNNQFPGTRWKLAMSYMYTVPGLPIIYYGSEIALS
FIDNHDVERFTRVALRNEEYPVTRIKLALSYLYTAPGIPIMYYGTEIALD
YLNKTNFNHSVFDVPLHYQFHAASTQGGGYDMRKLLNSTVVSKHPLKAVT
YLNKTSFNQSVFDVPLHFNLQAASSQGGGYDMRRLLDGTVVSRHPEKAVT
YIMKTNGTMSLFDAPLHNKFYTASKSGGTFDMRTLMTNTLMKDQPTLAVT
FLDNHDMDRFQVSGAN-----GRKLEQALALTLTSRGVPAIYYGTEQYMT
FLTNHDQNRVMSELSG----DVNKAKSAASILLTLPGNPYIYYGEEIGMT
PEELSNPNGNNQIFMNQRGSHGVVLANAGSSSVSINTATKLPDGRYDNKA
. . . :
GGEDPDNR--RLMNFRADKELIDYISKLGKVR-KDYPALTRGTIEPLYEQ
GGNDPDNR--RFMNFRADKELIDYITRLGEIR-QDYPALTRGDITPIYNK
GGEDPDNR--RLMNFRADKELIDYITRLGELR-KTQPALTRGEIEKVYEN
GAEDPDNR--KLMDFRTDKELIEYITKLGKIR-NSYPALTRGSMELLHEK
GGEDPDNR--RDMTFRADKELIEYISRLAEIR-KMHPALTKGTFELLHDD
FVDNHDTQPGQSLESTVQTWFKPLAYAFILTRESGYPQVFYGDMYGTKGD
FVENHDTQPGQSLESTVQTWFKPLAYAFILTRESGYPQVFYGDMYGTKGT
FVDNHDTEPGQALQSWVDPWFKPLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIP--
GNGDPNNR-AKMSSFSTSTTAYNVISKLAPLR-KSNPAIAYGTTQQRWIN
G-EKPDELIREPFRWYEGNGIGQTSWETPVYN--KGGNGVSVEAQTKQKD
GAGSFQVNDGKLTGTINARSVAVLYPDDIAKAPHVFLENYKTGVTHSFND
. : .
DGLGIYKRAYKDQTVVVAINNSSETQTVELDEGELADNNELKG-----LL
DGMGIFKRTYKDQTIVIAINNTSETQNVQLTKEELADNHELKG-----LI
DGMGIYKRTYKDQTLLIAINNTKETQTIDLTEDQLEADQELKS-----LL
DGMAVFKREYEGETMIVAINNTSKSQSVKLQTPQLPEGMELRG-----LL
GGYAIFKRQYEDEMAIIAINNSTGTKIGDIPEEVIGENKELRG-----FL
SQREIPALKHKIEPILKARKQYAYGAQHDYFDHHDIVGWTREGDSSVANS
SPKEIPSLKDNIEPILKARKEYAYGPQHDYIDHPDVIGWTREGDSSAAKS
-QYNIPSLKSKIDPLLIARRDYAYGTQHDYLDHSDIIGWTREGVTEKPGS
NDVYIYERKFGNNVAVVAINKN------------LTSSYSIAG-------
SLLNHYREMIRVRQQHEELVKGTLQSISVDSKEVVAYSRTYKG-------
QLTITLRADANTTKAVYQINNGPETAFKDGDQFTIGKGDPFGKTYTIMLK
. .
tr|G8IJA7|G8IJA7_9BACI
tr|A0A0P6WIZ1|A0A0P6WIZ1_9BACI
tr|A0A0M0GSF5|A0A0M0GSF5_9BACI
tr|A0A3A1R0T6|A0A3A1R0T6_9BACI
tr|A0A223KM47|A0A223KM47_9BACI
sp|P06278|AMY_BACLI
sp|P00692|AMY_BACAM
sp|P06279|AMY_GEOSE
sp|P08137|AMY_BACCI
sp|P20845|AMY_BACME
sp|P00691|AMY_BACSU
tr|G8IJA7|G8IJA7_9BACI
tr|A0A0P6WIZ1|A0A0P6WIZ1_9BACI
tr|A0A0M0GSF5|A0A0M0GSF5_9BACI
tr|A0A3A1R0T6|A0A3A1R0T6_9BACI
tr|A0A223KM47|A0A223KM47_9BACI
sp|P06278|AMY_BACLI
sp|P00692|AMY_BACAM
sp|P06279|AMY_GEOSE
sp|P08137|AMY_BACCI
sp|P20845|AMY_BACME
sp|P00691|AMY_BACSU
tr|G8IJA7|G8IJA7_9BACI
tr|A0A0P6WIZ1|A0A0P6WIZ1_9BACI
tr|A0A0M0GSF5|A0A0M0GSF5_9BACI
tr|A0A3A1R0T6|A0A3A1R0T6_9BACI
tr|A0A223KM47|A0A223KM47_9BACI
sp|P06278|AMY_BACLI
sp|P00692|AMY_BACAM
sp|P06279|AMY_GEOSE
sp|P08137|AMY_BACCI
sp|P20845|AMY_BACME
sp|P00691|AMY_BACSU
Gambar 3.1 Hasil Multiple Sequence Alignment dari web https://www.genome.jp/tools-
bin/clustalw dengan beberapa pointers yang ditambahkan oleh praktikan
SDDLVRSDENGTYKVALDREEAEIYLLKAKSGLNIPYLSALAAVYVLFLL
SDDLVRSDKDGNYHLVLDREESEIYMLKNKSGLNYPYLFALGIMYFLFFL
TTDLVRSDSEGTYKIVLDREESEIYELKSKSGLNIPFLVALGIVYVLFMV
DEDLVRADG-DTYDLILDREEAEIYVLAPKSGLNYGFIGALTAVYVIFMI
NDELIRSTN-GVYKVGLDRDMVEIYNVTEDSGLNYLFLGTMVFIYGGFAA
GLAALITDGPGGAKRMYVGRQNAGETWHDITGNRSEPVVINSEGWGEFHV
GLAALITDGPGGSKRMYAGLKNAGETWYDITGNRSDTVKIGSDGWGEFHV
GLAALITDGPGGSKWMYVGKQHAGKVFYDLTGNRSDTVTINSDGWGEFKV
---LNTSLPSGTYTDVLANSLSGNSITVGSSGAVNTFTLQAGGEASGLTR
-KSISVYHNISNQPVKVSVAAKGNLIFASEKGAKKVKNQLVIPANRTVLI
GTNSDGVTRTEKYSFVKRDPASAKTIGYQNPNHWSQVNAYIYKHDGSRVI
.
FIYLVWKRGRKNRKS-----------------------------------
FLYLVRKRGKAKKK------------------------------------
FLYVVKKRGKKNKHQKE---------------------------------
FIYYVWKKGRENRKNE----------------------------------
LVIFLVRRRKKKSKE-----------------------------------
NGGSVSIYVQR---------------------------------------
NDGSVSIYVQK---------------------------------------
NGGSVSVWVPRKTTVSTIAWSITTRPWTDEFVRWTEPRLVAWP-------
RRQRLR--------------------------------------------
K-------------------------------------------------
ELTGSWPGKPMTKNADGIYTLTLPADTDTTNAKVIFNNGSAQVPGQNQPG
--------------------
--------------------
--------------------
--------------------
--------------------
--------------------
--------------------
--------------------
--------------------
--------------------
FDYVLNGLYNDSGLSGSLPH
Gambar 3.2 Pohon Filogenetik menggunakan FastTree dari web www.genome.jp/tools-

bin/clustalw dengan beberapa pointers yang ditambahkan oleh praktikan

Gambar 3.3 Pohon Filogenetik menggunakan PhyML bootstrap dari web

www.genome.jp/tools-bin/clustalw dengan beberapa pointers yang

ditambahkan oleh praktikan

3.2 Desain Primer gen baqA

Gambar 3.4. Sekuens gen baqA Bacillus aquimaris strain MKSC 6.2 JN797599.1
Gambar 3.5.Desain Primer untuk Bacillus aquamaris MKSC.2 menggunakan

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/primertool.cgi
IV. PEMBAHASAN

4.1. Penyejajaran urutan (Multiple sequence alignment) dan penentuan kekerabatan

melalui pendekatan pohon filogenetik

Pada percobaan multiple sequence alignment praktikan menggunakan sekuens gen -

amilase dari Bacillus aquimaris MKSC.6 (baqA), dengan kode tr|G8IJA7|G8IJA7_ 9BACI,

sebagai sekuens utama. Praktikan juga mengambil sepuluh (10) gen -amilase dari sepuluh

spesies bacilli yang didapatkan dari laman Uniprot (www.uniprot.org), sebagai berikut:

tr|A0A0P6WIZ1|A0A0P6WIZ1_9BACI : Bacillus vietnamensis

tr|A0A0M0GSF5|A0A0M0GSF5_9BACI : Bacillus marisflavi

tr|A0A3A1R0T6|A0A3A1R0T6_9BACI : Bacillus salacetis

tr|A0A223KM47|A0A223KM47_9BACI : Bacillus cohnii

sp|P06278|AMY_BACLI : Bacillus licheniformis

sp|P00692|AMY_BACAM : Bacillus amyloliquefaciens

sp|P06279|AMY_GEOSE : Geobacillus stearothermophilus

(B. stearothermophilus)

sp|P08137|AMY_BACCI : Bacillus circulans

sp|P20845|AMY_BACME : Bacillus megaterium

sp|P00691|AMY_BACSU : Bacillus subtilis (strain 168)

Praktikan kemudian melakukan multiple sequnce alignment menggunakan aplikasi

ClustalW (www.genome.jp/tools/clustalw) dengan hasil yang dapat dilihat pada Gambar

3.1. Dari hasil yang didapatkan, motif sekuens hasil pensejajaran dicocokan dan ditemukan

beberapa Conserved Sequence atau sekuens yang dilestarikan. Conserved Sequence ini
adalah sekuens yang sama atau mirip pada beberapa spesies karena terjadi pelestarian. Pada

conserved sequence inilah dimana biasanya ditemukan struktur-struktur fungsional

(Janecek, 2002). Conserved sequence ini dapat ditemukan pada conserved sequence regions

(CSRs) yang ditandai oleh praktikan dengan kotak merah, dengan B. aquimaris sebagai

sekuens utama. Sedangkan kotak berwarna biru menandakan region dengan sekuens

referensi selain B. aquimaris. Pewarnaan blok kuning pada asam amino menandakan adanya

pelestarian parsial terhadap sekuens dari referensi di dalam region tersebut. Pewarnaan blok

hijau menandakan adanya pelestarian asam amino pada semua spesies.

Dari data-data tersebut, ditemukan beberapa sekuens yang dilestarikan pada sekuens dari

B. aquimaris dengan B. vietnamensis dan B. marisflavi. Pada ketiga sekuens dari bacilli

tersebut banyak ditemukan sekuens yang sama ataupun mirip. Begitu juga dengan sekuens

dari B. vietnamensis dengan B. marisflavi. Hal ini menunjukkan adanya kekerabatan sangat

dekat antara ketiga spesies bacillus tersebut. Selanjutnya, dapat diamati juga terdapat

beberapa kemiripan dari asam amino atau sekuens dari tiga bacilli di atas dengan B. salacetis

dan B. cohnii, walaupun tidak sebanyak antara B. aquimaris, B. vietnamensis, dan B.

marisflavi. Hasil ini menunjukkan adanya kekerabatan yang cukup dekat antara kelima

spesies bacillus tersebut. Kemudian pada sekuens dari B. licheniformis, B.

amyloliquefaciens, dan B. stearothermophilus dapat ditemukan cukup banyak persamaan

antara satu sama lain namun, sangat sedikit persamaan dengan lima spesies bacillus yang

sebelumnya telah disebutkan. Hasil ini menunjukkan adanya kekerabatan yang cukup dekat

antara B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, dan B. stearothermophilus, serta adanya

kekerabatan yang cukup jauh dengan B. salacetis, B. cohnii, B. aquimaris, B. vietnamensis,

dan B. marisflavi. Sedangkan pada sekuens dari B. circulans dan B. megaterium ditemukan

beberapa persamaan sekuens dengan satu sama lain, serta kelima spesies bacillus yang

disebutkan di awal, termasuk B. aquimaris. Kemudian juga ditemukan sangat sedikit

persamaan sekuens dengan B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, dan B.

stearothermophilus. Hasil ini menunjukkan adanya kekerabatan yang tidak terlalu dekat

antara B. circulans dengan B. megaterium, serta kedua spesies bacillus dengan kelima

species bacillus yang disebutkan di awal (B. salacetis, B. cohnii, B. aquimaris, B.

vietnamensis, dan B. marisflavi). Selain itu juga terdapat kekerabatan yang cukup jauh

antara B. circulans dan B. megaterium, dengan B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, dan

B. stearothermophilus. Kemudian pada sekuens B. subtilis (strain 168) didapatkan sedikit

persamaan sekuens dengan B. salacetis, B. cohnii, B. aquimaris, B. vietnamensis, B.

marisflavi, B. circulans dan B. megaterium, serta lebih sedikit lagi persamaan dengan

sekuens B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, dan B. stearothermophilus. Hasil ini

menunjukkan adanya kekerabatn yang tidak terlalu dekat dengan spesies B. salacetis, B.

cohnii, B. aquimaris, B. vietnamensis, B. marisflavi, B. circulans dan B. megaterium, serta

kekerabatan yang cukup jauh dengan sekuens B. licheniformis, B. amyloliquefaciens dan B.

stearothermophilus.

Praktikan juga telah membuat pohon filogenetik menggunakan algoritma FastTree dan

PhyML bootstrap melalui program execute pada aplikasi ClustalW

(www.genome.jp/tools/clustalw). Hasil pohon filogenetik dari FastTree dan PhyML,

masing-masing, dapat dilihat pada Gambar 3.2. dan Gambar 3.3. Dari Gambar 3.2. (pohon

filogenetik dari algoritma FastTree) dapat dilihat terdapat dua grup monofiletik atau clade

utama yaitu, clade B. subtilis (strain 168), B. salacetis, B. cohnii, B. aquimaris, B.

vietnamensis, B. marisflavi, B. circulans, dan B. megaterium; yang selanjutnya akan

praktikan sebut sebagai clade A, dan clade B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, dan B.

stearothermophilus; yang selanjutnya akan praktikan sebut sebagai clade B. Dapat dilihat

pada clade A, B. marisflavi dann B. vietnamensis memiliki kekerabatan paling dekat karena,

memiliki common ancestor paling dekat. Common ancestor dari clade ini merupakan sister
taxon dari B. aquimaris karena, memiliki common ancestor yang sama. Kemudian clade

dari tiga spesies tersebut (di dalam kotak berwarna hijau pada gambar) merupakan sister

taxon dari B. salacetis. Kemudian clade yang berisi B. salacetis, B. aquimaris, B.

vietnamensis, dan B. marisflavi merupakan sister taxon dari B. cohni. Clade yang berisi lima

spesies ini akan praktikan sebut sebagai Clade A11 untuk selanjutnya. Clade A11 ini

kemudian memiliki sister taxon berupa clade yang berisi spesies B. circulans dan B.

megaterium; yang selanjutnya akan praktikan sebut sebagai Clade A12. Spesies Clade A11

dan Clade A12 ini kemudian membentuk satu clade yang akan praktikan sebut sebagai

Clade A1. Clade A1 ini kemudian memiliki sister taxon yaitu B. subtilis (strain 168).

Kemudian pada Clade B (di dalam kotak berwarna merah pada gambar) dapat dilihat bahwa

B. licheniformis dan B. amyloliquefaciens memiliki kekerabatan paling dekat, dimana

common ancestor-nya merupakan sister taxon dari B. stearothermophilus. Dari Gambar 3.2.

didapatkan bahwa kerabat paling dekat dari B. aquimaris adalah common ancestor dari B.

vietnamensis dan B. marisflavi.

Pada Gambar 3.3. (pohon filogenetik dari algoritma PhyML bootstrap) terdapat

perbedaan pada Clade B (di dalam kotak berwana merah pada Gambar 3.2. dan Gambar

3.3.). Pada pohon filogenetik yang dihasilkan dari algoritma PhyML bootstrap, kekerabatan

paling dekat dari B. licheniformis adalah B. stearothermophilus, sedangkan common

ancestor dari keduanya adalah sister taxon dari B. amyloliquefaciens. Selain itu, terdapat

juga perbedaan pada Clade A. Di dalam kotak yang berwarna kuning pada Gambar 3.2. dan

3.3., dapat dilihat bahwa, berbeda dengan pohon filogenetik FastTree, B. megaterium pada

pohon filogenetik PhyML boostrap tidak memiliki sister taxon B. circulans. Sebagai

gantinya, Clade yang berisi B. salacetis, B. cohnii, B. aquimaris, B. vietnamensis, B.

marisflavi, dan B. megaterium merupakan sister taxon dari B. circulans dan B. subtilis.

Namun, pada clade yang berisi B. aquimaris, B. vietnamensis, dan B. marisflaviI tidak
memiliki perbedaan dengan clade yang sama pada pohon filogenetik FastTree. B. marisflavi

dan B. vietnamensis merupakan kerabat paling dekat dari satu sama lain, dengan common

ancestor yang merupakan sister taxon dari B. aquimaris. Dari Gambar 3.3. didapatkan pula

bahwa kerabat paling dekat dari B. aquimaris adalah common ancestor dari B. vietnamensis

dan B. marisflavi. Selain dari pohon filogenetik yang dihasilkan, kedua algoritma juga

memakan waktu yang berbeda untuk menghasilkan pohon filogenetik masing-masing. Pada

perangkat praktikan, FastTree membutuhkan waktu beberapa menit untuk menghasilkan

pohon filogenetik, sedangkan PhyML bootsrap membutuhkan waktu lebih dari 2 jam.

Perbedaan dari kedua pohon filogenetik di atas dapat terjadi karena perbedaan algoritma

yang digunakan, FastTree mencari minimum-evolution menggunakan metode nearest-

neighbor interchanges (NNI) yang relatif lebih cepat, namun akurasi dari hasil topologi

yang dihasilkan tidak terlalu akurat (Price, et al., 2009). Di sisi lain, PhyML bootstrap

mengoptimalkan maximum-likehood menggunakan metode subtree-prune-regraft moves

(SPR) yang memberikan hasil dengan akurasi yang relatif lebih tinggi, namun lebih lambat.

Keakuratan PhyML bootstrap juga didukung dengan metode bootstrap yang melakukan

pengulangan sampel, serta membangun ulang pohon, yang dapat meningkatkan reliabilitas

dari pohon filogenetik yang dihasilkan (Guindon, et al., 2010).

Dalam mencari motif khas, praktikan, terutama, memanfaatkan simbol yang dihasilkan

dari multiple sequence alignment. Simbol bintang (*) menandakan posisi yang memiliki

satu residu yang terlestarikan (conserved) secara penuh (pada semua spesies), simbol titik

dua (:) menandakan adanya pelestarian dari grup dengan kemiripan sifat tinggi, dan simbol

titik (.) menandakan adanya pelestarian dari grup dengan kemiripan sifat rendah (Uniprot,

2018). Selain itu, praktikan juga menggunakan aplikasi ClustalX untuk membantu

memvisualisasikan sekuens. ClustalX memberikan blok warna secara otomatis pada hasil
 persejajaran namun, hasil dari persejajaran ClustalW (Gambar 3.1.) menurut praktikan lebih

cocok untuk ditampilkan pada laporan ini. Praktikan kemudian menggunakan software

SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/interactive) untuk memodelkan struktur

protein -amilase B. aquimaris serta mencari dan menentukan lokasi dari residu tertentu

pada struktur protein tersebut.

Gambar 4.1. Struktus protein -amilase B. aquimaris dari software SWISS-MODEL

tr|G8IJA7|G8IJA7_9BACI DRFNNGDPTNDKE------VNTKDPKAYHGGDFQGVIDRL--DYIKDMGF
tr|A0A0P6WIZ1|A0A0P6WIZ1_9BACI DRFNDGDTSNDKD------VNTKDPKAYQGGDFQGIIDKL--DYIKDMGF
tr|A0A0M0GSF5|A0A0M0GSF5_9BACI DRFNNGDSSNDKN------VDANDPLSYQGGDFQGIIDRL--DYIQEMGF
tr|A0A3A1R0T6|A0A3A1R0T6_9BACI DRFNNGDQSNDFD------VNRKDPKAYQGGDFQGVIDQL--DYIKEMGF
tr|A0A223KM47|A0A223KM47_9BACI DRWNNGDTSNDYE------VDRNDPKAYHGGDFKGIMDRL--DYISDMGF
sp|P06278|AMY_BACLI MQYFEWYMPND------------------GQHWKRLQNDS--AYLAEHGI
sp|P00692|AMY_BACAM MQYFEWYTPND------------------GQHWKRLQNDA--EHLSDIGI
sp|P06279|AMY_GEOSE MQYFEWYLPDD------------------GTLWTKVANEA--NNLSSLGI
sp|P08137|AMY_BACCI DRFVDGNTANNPAGSAYDATCSTNLKLYCGGDWQGIMNKINDGYFTGMGI
sp|P20845|AMY_BACME YVNSFYDANKDGHG-----------DLKGLTQKLDYLNDGNSHTKNDLQV
sp|P00691|AMY_BACSU PSIKSGTILHAWN-------------------WSFNTLKHNMKDIHDAGY
.

Gambar 4.2. Hasil pensejajaran urutan ke-2

Untuk motif khas pertama dapat dilihat pada hasil pensejajaran urutan ke-2 pada basa ke-

58 (Gambar 4.2.). Praktikan menemukan bahwa B. aquimaris memiliki residu Prolin (P)
(berwarna biru pada gambar) sedangkan spesies lain, memiliki residu lain selain prolin.

Prolin sendiri merupakan asam amino yang memiliki bentuk alifatik dan bersifat hidrofobik

namun, karena kecenderungan prolin untuk membentuk struktur turn, prolin sering

ditemukan di permukaan protein. Selain itu, Prolin memiliki peran penting dalam

identifikasi molekuler, seperti signalling intraseluler. Prolin berikatan dengan permukaan

yang memiliki residu aromatik melalui proses yang sampai saat ini masih belum dimengerti

sepenuhnya (Betts & Russell, 2003). Berdasarkan hasil dari SWISS-MODEL, ditemukan

bahwa residu Prolin tersebut berada di sisi permukaan dari protein dan membentuk turn

(Gambar 4.3).

Gambar 4.3. Letak residu Prolin (basa ke-58 pada alignment), ditandai dengan highlight

merah di sisi atas dan bawah blok residu serta terlihat struktur Prolin pada

gambar struktur protein

Motif khas lainnya masih berada pada hasil pensejajaran urutan ke-2 pada basa ke-59.

Dapat dilihat B. aquimaris memiliki residu Threonin (T) (berwarna biru muda pada Gambar

4.2.), sedangkan beberapa spesies lainnya memiliki residu Serin (S), mutasi ini adalah
mutasi konservatif. Threonin secara umum memiliki kesamaan yang tinggi dengan Serin

yaitu, sama-sama bersifat sedikit polar dan disubstitusikan oleh asam amino polar atau

berukuran kecil lainnya. Karena memiliki cabang C-beta, Threonin memiliki bentuk yang

lebih besar dan mengalami halangan yang lebih besar. Hal ini mengakibatkan Threonin

lebih umum ditemukan di dalam beta-sheet dan paling sukar membentuk alpha-helix. Peran

umum dari Threonin dalam protein intraseluler adalah fosforilasi. Protein kinase

menempelkan fosfat pada Threonin untuk memfasilitasi proses transduksi. Karena protein

kinase ini bersifat sangat spesifik Threonin hanya dapat disubstitusikan dengan Serin (Betts

& Russell, 2003). Berdasarkan hasil dari SWISS-MODEL, ditemukan bahwa residu

Threonin tersebut berada di sisi permukaan dari protein dan membentuk turn (Gambar 4.4).

Gambar 4.4. Letak residu Threonin (basa ke-59 pada alignment), ditandai dengan

highlight merah di sisi atas dan bawah blok residu serta terlihat struktur

Threonin pada gambar struktur protein

tr|G8IJA7|G8IJA7_9BACI
tr|A0A0P6WIZ1|A0A0P6WIZ1_9BACI
tr|A0A0M0GSF5|A0A0M0GSF5_9BACI
tr|A0A3A1R0T6|A0A3A1R0T6_9BACI
tr|A0A223KM47|A0A223KM47_9BACI
sp|P06278|AMY_BACLI
sp|P00692|AMY_BACAM
sp|P06279|AMY_GEOSE
sp|P08137|AMY_BACCI
sp|P20845|AMY_BACME
sp|P00691|AMY_BACSU
TSIWLTPVFDNQP----------KGYHGYWITDFYKTDEH---------F
TAIWLTPIFDNQP----------MGYHGYWITDFYKTEEH---------F
TAIWLTPIFENQP----------GGYHGYWTTDYYKTEEH---------F
TTIWLTPVFDNQE----------KGYHGYWIKDFYNTDEH---------F
TAIWLTPIVKNES----------GGYHGYWAEDFYEVEEH---------F
TAVWIPPAYKGTS----------QADVGYGAYDLYDLGEFHQKGTVRTKY
TAVWIPPAYKGLS----------QSDNGYGPYDLYDLGEFQQKGTVRTKY
TALWLPPAYKGTS----------RSDVGYGVYDLYDLGEFNQKGAVRTKY
TALWISQPVENIYSVINYSGVNNTAYHGYWARDFKKTNPA---------F
NGIWMMPVNPSPS------------YHKYDVTDYYNIDPQ---------Y
TAIQTSPINQVKE----------GNQGDKSMSNWYWLYQPTSYQIGNRYL
. : :

Gambar 4.5. Hasil pensejajaran urutan ke-3

Motif khas lainnya ditemukan pada hasil pensejajaran urutan ke-3 pada basa ke-102.

Ditemukan bahwa B. aquimaris memiliki residu Serin (S), sedangkan mayoritas spesies

lainnya memiliki residu Alanin (A) dan sisanya asam amino lainnya. Menurut Betts dan

Russell (2003), Serin memang memiliki kecenderungan untuk disubstitusikan oleh Alanin.

Alanin adalah asam amino berukuran kecil yang tidak secara spesifik bersifat hidrofobik

dan bersifat non-polar. Serin dapat terletak pada interior maupun eksterior dari protein

karena karakteristiknya. Serin lumayan umum ditemukan pada turn dan karena gugus

samping hidroksil Serin memiliki kemungkinan membentuk ikatan hidrogen dengan

backbone protein, Serin dapat me-mimik Prolin. Alanin dapat ditemukan pada hampir

semua konteks protein yang tidak kritis karena memiliki karbon C-beta yang secara umum

membuatnya mengalami halangan. Serin memiliki peran umum dalam protein intraseluler

adalah fosforilasi (Betts & Russell, 2003). Berdasarkan hasil dari SWISS-MODEL,

ditemukan bahwa residu Serin tersebut berada di sisi interior dari protein dan merupakan

bagian dari beta-sheet (Gambar 4.6).

 Gambar 4.6. Letak residu Serin (basa ke-102 pada alignment), ditandai dengan highlight

merah di sisi atas dan bawah blok residu serta terlihat struktur Serin pada

gambar struktur protein

Motif khas lainnya ditemukan pada hasil pensejajaran urutan ke-5, pada basa ke-277.

tr|G8IJA7|G8IJA7_9BACI
tr|A0A0P6WIZ1|A0A0P6WIZ1_9BACI
tr|A0A0M0GSF5|A0A0M0GSF5_9BACI
tr|A0A3A1R0T6|A0A3A1R0T6_9BACI
tr|A0A223KM47|A0A223KM47_9BACI
sp|P06278|AMY_BACLI
sp|P00692|AMY_BACAM
sp|P06279|AMY_GEOSE
sp|P08137|AMY_BACCI
sp|P20845|AMY_BACME
sp|P00691|AMY_BACSU
-------DPAKEDWFHE-KQPMNFSDKESLQNAWLYGLPDLNTENPEVRE
-------DPEKKDWFHE-KQPMNFNNEESLQNAWLYDLPDLNTENPEVKN
-------DPAKADWFHE-KQTMNFEDEESVKNDWLYDLPDLNTENPEVKE
-------DPGKEDWFHE-KQPMNMNDDESLQNDWLYDLPDLNTENQEVRE
-------DPEKEDWFNPNRNISDWTNQEQVERGWIYGLPDLNQDNPEVRE
-------VTAVEVDPADRNRVISGEHRIKAWTHFHFPGRGSTYSDFKWHW
-------VTAVEVNPANRNQETSEEYQIKAWTDFRFPGRGNTYSDFKWHW
-------VDAVEVNPSDRNQEISGTYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRW
NGTLLGGYTGDTNGYFHHNGGTDFSTLKNGIYKNLYDLADLNHNNSTIDT
YIWADKNTDLNEKGSWGQQVWHKAPNGEYFYGTFWEGMPDLNYDNPEVRK
------EVKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQS
. . . ..

Gambar 4.7. Hasil pensejajaran urutan ke-5

Dapat dilihat bahwa pada basa ke-277 tersebut, sekuens dari Bacillus aquimaris

mempunyai asam amino Lisina (K) sedangkan beberapa spesies lainnya memiliki asam

amino Glutamina (Q), Glutamat (E), Aspartat (D), Arginin (R), Leusin (L), dan Glisin (G).

Menurut Betts dan Russell (2003), Lisina lebih cenderung untuk disubstitusikan oleh

Arginin karena sama-sama memiliki muatan positif, serta Glutamat, dan Glutamina karena
sama-sama bersifat polar (mutasi konservatif). Lisina dapat ditemukan secara umum di sisi

luar dari protein. Lisina memiliki peran dalam membentuk ikatan hidrogen menggunakan

gugus sampingnya yang bermuatan positif. Berdasarkan hasil dari SWISS-MODEL,

ditemukan bahwa residu Lisina tersebut berada di sisi permukaan dari protein dan

merupakan bagian dari alpha-helix (Gambar 4.8).

Gambar 4.8. Letak residu Lisina (basa ke-277 pada alignment), ditandai dengan highlight

merah di sisi atas dan bawah blok residu serta terlihat struktur Lisina pada

gambar struktur protein

 Motif khas lainnya ditemukan pada hasil pensejajaran urutan ke-8, pada basa ke-392 dan

basa ke-399.

tr|G8IJA7|G8IJA7_9BACI
tr|A0A0P6WIZ1|A0A0P6WIZ1_9BACI
tr|A0A0M0GSF5|A0A0M0GSF5_9BACI
tr|A0A3A1R0T6|A0A3A1R0T6_9BACI
tr|A0A223KM47|A0A223KM47_9BACI
sp|P06278|AMY_BACLI
sp|P00692|AMY_BACAM
sp|P06279|AMY_GEOSE
sp|P08137|AMY_BACCI
sp|P20845|AMY_BACME
sp|P00691|AMY_BACSU
---------------------------------------DPQRIAEYNDV
---------------------------------------DPEKIAAYNGT
---------------------------------------DPEKIAEYNGV
---------------------------------------DPRNIAKYEGV
---------------------------------------DPRYVAAYEET
---------------------------------------KRWGTWYANEL
---------------------------------------KKWGIWYANEL
---------------------------------------KSWGKWYVNTT
---------------------------------------TDANNTYFANE
-----------------------------------------PEVVAPYYQ
ISHYASDVSADKLVTWVESHDTYANDDEESTWMSDDDIRLGWAVIASRSG

Gambar 4.9. Hasil pensejajaran urutan ke-8

Dapat dilihat bahwa pada basa ke-392, sekuens dari Bacillus aquimaris mempunyai asam

amino Glutamina (Q) sedangkan beberapa spesies lainnya memiliki asam amino Glutamat

(E), Arginin (R), Alanin (A), Prolin (P), dan Triptofan (W). Menurut Betts dan Russell

(2003), Glutamina lebih cenderung disubstitusikan oleh Glutamat dan Arginin krena

memiliki kesamaan yang bersifat polar dan memiliki fungsi yang mirip (mutasi konservatif).

Sedangkan pada Alanin, Prolin, dan Triptofan terjadi mutasi non-konservatif yang masing-

masing memiliki sifat yang berbeda dari Glutamina. Karena sifatnya yang polar, Glutamina

lebih umum ditemukan di permukaan protein. Gugus polarnya berfungsi dalam berinteraksi

dengan atom bermuatan atau polar lainnya. Berdasarkan hasil dari SWISS-MODEL,

ditemukan bahwa residu Glutamina tersebut berada di sisi luar dari protein dan merupakan

bagian dari alpha-helix (Gambar 4.10).

 Gambar 4.10. Letak residu Glutamina (basa ke-392 pada alignment), ditandai dengan

highlight merah di sisi atas dan bawah blok residu serta terlihat struktur

Glutamina pada gambar struktur protein

Dapat dilihat bahwa pada basa ke-399, sekuens dari Bacillus aquimaris mempunyai

asam amino Aspartat (D) sedangkan beberapa spesies lainnya memiliki asam amino Glisin

(G), Glutamat (E), Threonin (T), Asparagin (N), Tirosin (Y), dan Serin (S). Menurut Betts

dan Russell (2003), Aspartat lebih cenderung disubstitusikan oleh Glutamat karena sama-

sama memiliki sifat bermuatan negatif dan polar, serta Asparagin yang bersifat polar dan

memiliki struktur yang mirip (mutasi konservatif). Sedangkan dengan Threonin, Tirosin,

dan Serin terjadi mutasi non-konservatif. Aspartat, di permukaan protein, memiliki fungsi

berikatan dengan atom-atom non-protein yang bermuatan positif. Sedangkan di dalam

protein, Aspartat berfungsi membentuk ikatan hidrogen yang penting dalam stabilitas

protein. Berdasarkan hasil dari SWISS-MODEL, ditemukan bahwa residu tersebut berada

di sisi dari protein dan merupakan bagian dari (Gambar 4.11).

 Gambar 4.10. Letak residu Aspartat (basa ke-399 pada alignment), ditandai dengan

highlight merah di sisi atas dan bawah blok residu serta terlihat struktur

Aspartat pada gambar struktur protein

4.2. Desain Primer gen baqA

Pada praktikum ini pemilihan desain primer dilakukan oleh praktikan menggunakan

software Primer-Blast pada website NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-

blast) dengan hasil yang dapat dilihat pada (Gambar 3.5.). Kemudian, sekuens gen α-amilase

dari Bacillus aquimaris MKSC 6.2 (baqA) JN797599.1 (Gambar 3.4.) diambil dari website

NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore).

Kriteria dari suatu primer yang baik praktikan dapatkan dari Dawkins-hall, 2015 dan

Premier Biosoft, n.d. sebagai berikut:

1. Memiliki GC clamp berada di tengah atau menuju ujung 3’ dari primer.

2. Memiliki panjang sekitar 18-22 base pair karena, cukup panjang untuk specifity dan

cukup pendek untuk primer dapat berikatan dengan mudah ke template pad suhu

annealing.

3. Memliki GC content sekitar 50-60%.

4. Tm atau suhu leleh primer memiliki rata-rata sekitar 60oC. Saat memilih Tm harus

berada pada rentang optimal 55-65oC. Tm tidak boleh di atas 65oC karena memiliki

kecenderungan untuk mengalami annealing sekunder.

5. Pasangan primer memiliki selisih Tm tidak lebih dari 2oC.

6. Memiliki skor self-complementarity rendah untuk mencegah primer berikatan dengan

dirinya sendiri atau primer lain.

7. Memiliki skor self 3’-complementarity yang rendah.

8. Hindari pengulangan basa yang sama lebih dari empat (4) kali karena, dapat

menyebabkan misprime, terutama G dan C

9. Menghasilkan produk dengan panjang mendekati 500 base pair

10. Pada 5 basa terakhir disarankan:

- Terminasi dengan residu G atau C yang didahului oleh basa pirimidin

- Terminasi dengan dobel purin masih dapat diterima, membentuk GC clamp

- Tidak terminasi dengan residu T

- Tidak memiliki lebih dari 2 residu G atau C pada ujung 3’ karena dapat mengurangi

specifity

Menggunakan data pasangan primer yang didapatkan (Gambar 3.5.), praktikan

mendapatkan bahwa pasangan primer 9 adalah pasangan primer yang paling tepat untuk

mengamplifikasi gen baqA dalam PCR, dengan data tertera pada Gambar 4.12.

Gambar 4.12. Data pasangan primer 9

 Pasangan primer 9 praktikan tentukan sebagai yang paling tepat untuk mengamplifikasi

gen baqA dalam PCR, karena:

1. Terdapat GC clamp yang berada mendekati ujung ‘3 dari primer

2. Memiliki panjang 20 base pair; masih di dalam rentang 18-22 base pair

3. Forward dan reverse primer memiliki GC% masing-masing 50% dan 55%; masih di

dalam rentang 50-60%

4. Tm dari forward dan reverse primer masing-masing adalah 60,25oC dan 60,11 oC;

berada di sekitar 60 oC dan memiliki selisih 0,14 oC (kurang dari 2 oC)

5. Memiliki skor self 3’ complementarity cukup rendah, yaitu 2,00 (forward primer)

dan 1,00 (reverse primer)

6. Menghasilkan produk dengan panjang 462 base pair; mendekati 500

7. Pada lima basa terakhir di ujung 3’ forward primer dan reverse primer tidak terdapat

residu G ataupun C berjumlah lebih dari 2

Walaupun begitu, pasangan primer ini emiliki skor self complementarity cukup tinggi

dibanding pasangan primer lainnya, yaitu 6,00 (forward primer) dan 5,00 (reverse primer).
V. KESIMPULAN

Berdasarkan hasil yang didapatkan dari Multiple Sequence Alignment, kekerabatan

paling dekat dari Bacillus aquimaris berdasarkan sekuens asam amino -amilase Bacillus

aquimaris MKSC.6 atau baqA adalah Bacillus vietnamensis dan Bacillus marisflavi. Dari

pohon filogenetik yang dihasilkan FastTree dan PhyML bootstrap, kekerabatan paling dekat

dari Bacillus aquimaris memiliki hasil yang sama yaitu, clade yang berisi Bacillus

vietnamensis dan Bacillus marisflavi atau common ancestor dari Bacillus vietnamensis dan

Bacillus marisflavi. Namun, tetap terdapat perbedaan dari hasil pohon filogenetik FastTree

dan PhyML bootstrap. Pohon filogenetik PhyML bootstrap lebih dapat diandalkan karena

keakuratannya lebih tinggi, walau memiliki waktu pemrosesan yang lebih lama. Motif khas

-amilase Bacillus aquimaris dibandingkan dengan amilase dari spesies-spesies lain

bacillus dapat dilihat pada hasil pensejajaran urutan ke-2 yang berisi mutasi Prolin dan

Threonin menjadi asam amino lainnya (Gambar 4.2), hasil pensejajaran urutan ke-3 yang

berisi mutasi Serin menjadi asam amino lainnya (Gambar 4.5), hasil pensejajaran urutan ke-

5 yang berisi mutasi Lisina menjadi asam amino lainnya (Gambar 4.7), dan hasil

pensejajaran urutan ke-8 yang berisi mutasi Glutamina dan Aspartat menjadi asam amino

lainnya (Gambar 4.9). Beberapa motif khas merupakan hasil dari mutasi konservatif,

sedangkan lainnya hasil dari mutasi non-konservatif. Desain primer yang paling tepat

digunakan untuk mengamplifikasi gen baqA di dalam PCR (Polymerase Chain Reaction)

adalah pasangan primer 9 (Gambar 4.12.), dengan sekuens betikut ini; Forward primer: 5’-

ACCATGGCGGTGATTTCCAA-3’, dan Reverse primer: 5’-

GCACCGTGTCCAGACGATAA-3’
VI. DAFTAR PUSTAKA

Aprijani, D. A., & Elfaizi, M. A. (2004). BIOINFORMATIKA: Perkembangan, Disiplin Ilmu

dan Penerapannya di Indonesia. Diakses dari ftp://202.125, 94 pada 09 April 2020.

Betts, M.J. Russell, R.B. (2003). Amino acid properties and consequences of subsitutions.

Bioinformatics for Geneticists. M.R. Barnes, I.C. Gray eds. Wiley,

Dawkins-Hall, L.S. (2015). Designing Primers for RT PCR and qPCR. (PDF). doi:

10.13140/RG.2.2.26885.35045

Guindon, S. Dufayard, J.-F. Lefort, V. Anisimova, M. Hordijk, W. & Gascuel, O. (2010). New

Algorithms and Methods to Estimate Maximum-Likelihood Phylogenies:

Assessing the Performance of PhyML 3.0. Systematic Biology, 307-321. (PDF).

doi: 10.1093/sysbio/syq010

Janecek, S. (2002). How many conserved sequence regions are there in the α-amylase family?

Biologia, 29-41.

Lesk, A. M. (2013). "Bioinformatics". Encyclopaedia Britannica. Diakses dari

https://www.britannica.com/science/bioinformatics pada 09 April 2020.

Linder, C.R. Warnow, T. (2005). An overview of phylogeny reconstruction. Handbook of

Computational Molecular Biology. Florida: Chapman and Hall/CRC (PDF).

Mount, D.W. (2004). Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis. New York: Cold Spring

Harbor Laboratory.

Mullis K.B. (1990). Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction.

Ann. Biol. Clin. 48(8), 579–582.

Novais, C.M. Pires-Alves, M. & Silva, F.F. (2004). PCR em tempo real. Rev. Biotecnol. Cienc.

Des. 33.
Premier Biosoft. (n.d.). PCR Primer Design Guidelines. Diakses dari PREMIER Biosoft:

http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html pada 09

April 2020

Price, M. Dehal, P. & Arkin, A. (2009). FastTree: Computing Large Minimum Evolution Trees

with Profiles instead of a Distance Matrix. Molecular Biology and Evolution. 26(7),

1641-1650. (PDF) DOI: https://doi.org/10.1093/molbev/msp077

Puspasari, F. Radjasa, O.K. Noer, A.S. Nurachman, Z. Syah, Y.M. van der Maarel, M.

Dijkhuizen, L. Janeček, Š. & Natalia, D. (2012). Raw starch-degrading α-amylase

from Bacillus aquimaris MKSC 6.2: Isolation and expression of the gene,

bioinformatics and biochemical characterization of the recombinant enzyme.

Journal of Apllied Microbiology. 114(1), 108-120. DOI: 10.1111/jam.12025.

Saraswati, H. Seprianto, S. & Wahyuni, F. D. (2019). Desain Primer Secara In Silico untuk

Amplifikasi Gen cryIII dari Bacillus thuringiensis Isolat Lokal. Indonesian Journal

of Biotechnology and Biodiversity, 3(1), 33-38.

Sindhu, R., Binod, P., & Pandey, A. (2017). α-Amylases. Current Developments in

Biotechnology and Bioengineering, 3-24.

Sukmawati, N.M.S. (2015). Bahan Ajar Bioinformatika. Laboratorium Biokimia Fakultas

Peternakan Universitas Udayana. Diakses dari

https://simdos.unud.ac.id/uploads/file_pendidikan_dir/d6dda88bc5abde5f564d24

aaa7bda351.pdf pada 09 April 2020.

UniProt. (2018). Sequence Alignment. Diakses dari UniProt:

https://www.uniprot.org/help/sequence-alignments pada 09 April 2020

 VII. LAMPIRAN

TUGAS

1. Bandingkan sekuens dari asam amino seluruh amilase dari Bacillus. Apakah

terdapat motif khas tertentu? Identifikasi sekuens yang memiliki motif yang khas

Jawaban:

Pada hasil multiple sequence alignment dapat diidentifikasi motif khas yaitu pada

urutan alignment ke-2

tr|G8IJA7|G8IJA7_9BACI DRFNNGDPTNDKE------VNTKDPKAYHGGDFQGVIDRL--DYIKDMGF
tr|A0A0P6WIZ1|A0A0P6WIZ1_9BACI DRFNDGDTSNDKD------VNTKDPKAYQGGDFQGIIDKL--DYIKDMGF
tr|A0A0M0GSF5|A0A0M0GSF5_9BACI DRFNNGDSSNDKN------VDANDPLSYQGGDFQGIIDRL--DYIQEMGF
tr|A0A3A1R0T6|A0A3A1R0T6_9BACI DRFNNGDQSNDFD------VNRKDPKAYQGGDFQGVIDQL--DYIKEMGF
tr|A0A223KM47|A0A223KM47_9BACI DRWNNGDTSNDYE------VDRNDPKAYHGGDFKGIMDRL--DYISDMGF
sp|P06278|AMY_BACLI MQYFEWYMPND------------------GQHWKRLQNDS--AYLAEHGI
sp|P00692|AMY_BACAM MQYFEWYTPND------------------GQHWKRLQNDA--EHLSDIGI
sp|P06279|AMY_GEOSE MQYFEWYLPDD------------------GTLWTKVANEA--NNLSSLGI
sp|P08137|AMY_BACCI DRFVDGNTANNPAGSAYDATCSTNLKLYCGGDWQGIMNKINDGYFTGMGI
sp|P20845|AMY_BACME YVNSFYDANKDGHG-----------DLKGLTQKLDYLNDGNSHTKNDLQV
sp|P00691|AMY_BACSU PSIKSGTILHAWN-------------------WSFNTLKHNMKDIHDAGY
.

Urutan alignment ke-3

tr|G8IJA7|G8IJA7_9BACI TSIWLTPVFDNQP----------KGYHGYWITDFYKTDEH---------F
tr|A0A0P6WIZ1|A0A0P6WIZ1_9BACI TAIWLTPIFDNQP----------MGYHGYWITDFYKTEEH---------F
tr|A0A0M0GSF5|A0A0M0GSF5_9BACI TAIWLTPIFENQP----------GGYHGYWTTDYYKTEEH---------F
tr|A0A3A1R0T6|A0A3A1R0T6_9BACI TTIWLTPVFDNQE----------KGYHGYWIKDFYNTDEH---------F
tr|A0A223KM47|A0A223KM47_9BACI TAIWLTPIVKNES----------GGYHGYWAEDFYEVEEH---------F
sp|P06278|AMY_BACLI TAVWIPPAYKGTS----------QADVGYGAYDLYDLGEFHQKGTVRTKY
sp|P00692|AMY_BACAM TAVWIPPAYKGLS----------QSDNGYGPYDLYDLGEFQQKGTVRTKY
sp|P06279|AMY_GEOSE TALWLPPAYKGTS----------RSDVGYGVYDLYDLGEFNQKGAVRTKY
sp|P08137|AMY_BACCI TALWISQPVENIYSVINYSGVNNTAYHGYWARDFKKTNPA---------F
sp|P20845|AMY_BACME NGIWMMPVNPSPS------------YHKYDVTDYYNIDPQ---------Y
sp|P00691|AMY_BACSU TAIQTSPINQVKE----------GNQGDKSMSNWYWLYQPTSYQIGNRYL
. : :

Urutan alignment ke-5

tr|G8IJA7|G8IJA7_9BACI -------DPAKEDWFHE-KQPMNFSDKESLQNAWLYGLPDLNTENPEVRE
tr|A0A0P6WIZ1|A0A0P6WIZ1_9BACI -------DPEKKDWFHE-KQPMNFNNEESLQNAWLYDLPDLNTENPEVKN
tr|A0A0M0GSF5|A0A0M0GSF5_9BACI -------DPAKADWFHE-KQTMNFEDEESVKNDWLYDLPDLNTENPEVKE
tr|A0A3A1R0T6|A0A3A1R0T6_9BACI -------DPGKEDWFHE-KQPMNMNDDESLQNDWLYDLPDLNTENQEVRE
tr|A0A223KM47|A0A223KM47_9BACI -------DPEKEDWFNPNRNISDWTNQEQVERGWIYGLPDLNQDNPEVRE
sp|P06278|AMY_BACLI -------VTAVEVDPADRNRVISGEHRIKAWTHFHFPGRGSTYSDFKWHW
sp|P00692|AMY_BACAM -------VTAVEVNPANRNQETSEEYQIKAWTDFRFPGRGNTYSDFKWHW
sp|P06279|AMY_GEOSE -------VDAVEVNPSDRNQEISGTYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRW
sp|P08137|AMY_BACCI NGTLLGGYTGDTNGYFHHNGGTDFSTLKNGIYKNLYDLADLNHNNSTIDT
sp|P20845|AMY_BACME YIWADKNTDLNEKGSWGQQVWHKAPNGEYFYGTFWEGMPDLNYDNPEVRK
sp|P00691|AMY_BACSU ------EVKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQS
. . . ..
 Urutan alignment ke-8

tr|G8IJA7|G8IJA7_9BACI ---------------------------------------DPQRIAEYNDV
tr|A0A0P6WIZ1|A0A0P6WIZ1_9BACI ---------------------------------------DPEKIAAYNGT
tr|A0A0M0GSF5|A0A0M0GSF5_9BACI ---------------------------------------DPEKIAEYNGV
tr|A0A3A1R0T6|A0A3A1R0T6_9BACI ---------------------------------------DPRNIAKYEGV
tr|A0A223KM47|A0A223KM47_9BACI ---------------------------------------DPRYVAAYEET
sp|P06278|AMY_BACLI ---------------------------------------KRWGTWYANEL
sp|P00692|AMY_BACAM ---------------------------------------KKWGIWYANEL
sp|P06279|AMY_GEOSE ---------------------------------------KSWGKWYVNTT
sp|P08137|AMY_BACCI ---------------------------------------TDANNTYFANE
sp|P20845|AMY_BACME -----------------------------------------PEVVAPYYQ
sp|P00691|AMY_BACSU ISHYASDVSADKLVTWVESHDTYANDDEESTWMSDDDIRLGWAVIASRSG

2. Bandingkan kedua pohon filogenetik yang diperoleh. Apakah terdapat

perbedaan?

Jawaban:

Pada pohon filogenetik dari algoritma PhyML bootstrap terdapat perbedaan pada

Clade B (di dalam kotak berwana merah pada Gambar 3.2. dan Gambar 3.3.). Pada

pohon filogenetik yang dihasilkan dari algoritma PhyML bootstrap, kekerabatan

paling dekat dari B. licheniformis adalah B. stearothermophilus, sedangkan common

ancestor dari keduanya adalah sister taxon dari B. amyloliquefaciens. Berbeda

dengan pohon filogenetik dari FastTree dimana kerabat terdekat dari B.

licheniformis adalah B. amyloliquefaciens, dengan common ancestor mereka adalah

sister taxon dari B. stearothermophilus. Selain itu, terdapat juga perbedaan pada

Clade A. Di dalam kotak yang berwarna kuning pada Gambar 3.2. dan 3.3., dapat

dilihat bahwa, berbeda dengan pohon filogenetik FastTree, B. megaterium pada

pohon filogenetik PhyML boostrap tidak memiliki sister taxon B. circulans.

Sebagai gantinya, Clade yang berisi B. salacetis, B. cohnii, B. aquimaris, B.

vietnamensis, B. marisflavi, dan B. megaterium merupakan sister taxon dari B.

circulans dan B. subtilis. Meskipun demikian, tidak ada perbedaan kekerabatan

paling dekat dari B. aquimaris di antara kedua pohon filogenetik.

3. Tentukan kekerabatan dari amilase baqA.

Jawaban:

Amilase baqA memiliki kekerabatan paling dekat dengan -amilase Bacillus

marisflavi dan Bacillus vietnamensis atau dari common ancestor dari Bacillus

marisflavi dan Bacillus vietnamensis.

4. Jelaskan syarat primer yang baik untuk PCR?

Jawaban:

Primer yang baik untuk PCR:

1) Memiliki GC clamp berada di tengah atau menuju ujung 3’ dari primer.

2) Memiliki panjang sekitar 18-22 base pair karena, cukup panjang untuk specifity

dan cukup pendek untuk primer dapat berikatan dengan mudah ke template pad

suhu annealing.

3) Memliki GC content sekitar 50-60%.

4) Tm atau suhu leleh primer memiliki rata-rata sekitar 60oC. Saat memilih Tm

harus berada pada rentang optimal 55-65oC. Tm tidak boleh di atas 65oC karena

memiliki kecenderungan untuk mengalami annealing sekunder.

5) Pasangan primer memiliki selisih Tm tidak lebih dari 2oC.

6) Memiliki skor self-complementarity rendah untuk mencegah primer berikatan

dengan dirinya sendiri atau primer lain.

7) Memiliki skor self 3’-complementarity yang rendah.

8) Hindari pengulangan basa yang sama lebih dari empat (4) kali karena, dapat

menyebabkan misprime, terutama G dan C

9) Menghasilkan produk dengan panjang mendekati 500 base pair

 10) Pada 5 basa terakhir disarankan:

- Terminasi dengan residu G atau C yang didahului oleh basa pirimidin

- Terminasi dengan dobel purin masih dapat diterima, membentuk GC clamp

- Tidak terminasi dengan residu T

- Tidak memiliki lebih dari 2 residu G atau C pada ujung 3’ karena dapat

mengurangi specifity

5. Tuliskan primer yang telah dirancang untuk amplifikasi gen pengode amilase

baqA.

Jawaban:

Pasangan primer dengan:

Forward primer: 5’-ACCATGGCGGTGATTTCCAA-3’

Reverse primer: 5’-GCACCGTGTCCAGACGATAA-3’