BAB III

METODE PENELITIAN

A. Waktu Dan Lokasi Penelitian

Penelitian ini telah dilaksanakan pada Mei 2021. Pengambilan sampel dilakukan di

kelurahan Liliba sedangkan isolasi bakteri endofit, uji aktivitas antibakteri dilakukan di

Laboratorium Bioteknologi Politeknik Pertanian Negeri Kupang.

B. Alat Dan BahanPenelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Erlemeyer, pipet, kertas label,

pensil, digital camera, tabung reaksi, cawan petri, gelas beker, neraca analitik, hot plate,

shaker, laminar air flow, autoclave, bunsen, batang pengaduk, gelas ukur, jarum ose, batang

L, magnetic strirrer, kapas, alumunium foil, pipet, mikro pipet, freezer, tip, shaker,

sentrifuge.

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Daun Binahong yang diambil di

Kelurahan Liliba,Biakan murni Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dari

Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada.Medium kultur

daun Binahong, Medium isolasi bakteri endofit yaitu Nutrien Agar 28g/L, Medium produksi

senyawa antibakteri yaitu medium Nutrient Broth 37g/L, Medium pemeliharaan bakteri uji

bakteri endofit dan medium identifikasi bakteri endofit berupa Nutrien agar 28g/L dan 37g/L,

Bahan untuk pengecatan bakteri berupa Cristal Violet, larutan iodine, Alkohol 95% dan

safranin bahan pengecatan spora berupa Malachite green 5%, safranin.

C. Prosedur Penelitian

Penelitian dilakukan dengan beberapa prosedur yaitu:

1. TeknikPengambilan Sampel

Sampel tanaman binahong (Anredera cordifolia) diambil di Kelurahan Liliba.Teknik

pengambilan sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode purposive sampling

yaitu penarikan sampel dengan pertimbangan tertentu, pertimbangan tersebut didasarkan

pada tujuan penelitian. Penentuan sampel menggunakan metode purposive sampling dengan

kriteria sebagai berikut:

a. Pengambilan sampel padahabitat yang sama denganmemperhatikankriteria yang

meliputi : daerah ternaung, kelembaban dan intensitas cahaya.

b. Tidak menggunakan plot (plotless).

Bahan tanaman yang diambil yaitu berupa daun Binahong 3 daun, dimasukkan di

dalam kantong kertas dan diberi label berisi informasi tempat pengambilan sampel,

sampel tanaman secepatnya dibawa ke laboratorium dan disimpan dalam lemari

pendingin pada suhu 5°C.

2. Pembuatan MS Medium (Murashige-Shoog Medium)

a. Penimbangan unsur makro

Timbang bahan-bahan untuk unsur makro, antara lain: 1,65 g NH4NO3 ; 1,9 g

KNO3 ; 0,44 g CaCl2.2H2O ; 0,37 g MgSO4.7H2O ; 0,17 g KH2PO4.

b. Pembuatan larutan stok hara mikro

Timbang bahan-bahan untuk stok mikro, antara lain : 41,5 mg kalium iodida;

310,0 mg, asam borat; 845,0mg mangansulfat- tetrahidrat; 430,0 mg sengsulfat-

heptahidrat; 1,25mg tembaga (II) sulfat; 12,5 mg natriummolibdat-dihidrat; 1,25 mg

 kobalt (II) klorida- heksahidrat.Masing-masing bahan tersebut dimasukkan satu persatu

ke dalam Beaker Glass 500 ml yang telah diisi dengan 300 ml aquadest, diaduk hingga

larut.Kemudian dipindahkan ke dalam labu ukur 500 ml, diencerkan dengan aquadest

sampai tanda. Untuk 1 liter medium dibutuhkan 5 ml larutan stok ini (Fitrhriyah, 2015).

3. Sterilisasi Daun Binahong (Anredera cordifolia)

Daun Binahong dicuci pada air mengalir kemudian berturut-turut direndam dalam

alkohol 70% selama 5 menit, kemudian rendam dengan larutan sodium hipoklorit 3% selama

4 menit dan dibilas dengan akuades steril 5 kali. Daun yang steril kemudian dihancurkan

dengan mortal dalam keadaan aseptis. Sebanyak 1 gram daun yang telah dimortal diencerkan

dengan akuades steril hingga pengenceran 10-3.

4. Penuangan Hasil Pengenceran Daun Binahong (Anredera cordifolia) pada MS Medium

Sampel daun Binahong yang telah dilakukan seri pengenceran sampai 10-3 diambil

seri pengencerannya sebanyak 0,1 ml dan disebarkan pada cawan petri yang berisi media MS

dan diratakan menggunakan batang kaca L, kemudian dibungkus menggunakan kertas dan

diinkubasi secara terbalik pada suhu 370c selama 24 jam. Setelah 24 jam akan tampak

pertumbuhan bakteri endofit pada media MS (Murashig Skoog) (Lay, 2015).

5. Isolasi Bakteri Endofit dengan Metode Streak Plate

Setelah didapatkan pertumbuhan bakteri endofit, kemudian dilakukan isolasi bakteri

endofit pada Nutrient Agar dalam cawan petri untuk mendapatkan biakan murni bakteri

endofit.Satu ose mikrobia yang didapat diinokulasikan pada nutrient agar secara streak

plate.Diinkubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam.Akan didapat koloni- koloni bakteri yang

terpisah.Koloni bakteri dari goresan terakhir diinokulasikan secara goresan ke dalam medium

NA miring untuk stok mikrobia (Parida & Damayanti, 2016)

6. Pengujian Potensi Antibakteri dari Isolat Bakteri Endofit Terhadap Staphylococcus

aureusdanEscherichia coli Secara Difusi Paper disc

a. Pembuatan Suspensi Bakteri Uji

Diambil ± 1 ose stok bakteri uji dari biakan murni Staphylococcusaureusdan Escherichia

coli, kemudian diinokulasikan pada Nutrien Broth (NB) 9 ml dan diinkubasi pada shaker

inkubator pada suhu 370c selama 24 jam.

b. Skrining Bakteri Endofit yang Memiliki Potensi Antibakteri terhadap

Staphylococcus aureus dan Escherichia coli

Biakan murni bakteri endofit yang diperoleh dari tahap 5 diuji potensi antibakterinya

terhadap Staphylococcusaureusdan Escherichia colidengan metode Paper Disc Agar

Diffusion Technique. Biakan bakteri endofit tersebut kemudian ditumbuhkan dalam medium

Nutrient Broth dan digojog menggunakan shakerpada suhu 37° C dengan kecepatan 1.700

rpm selama 1-2 hari. Pemisahan biomassa sel dengan medium Nutrient Broth yang

mengandung metabolit sekunder bakteri endofit (supernatan) dilakukan dengan sentrifugasi

pada kecepatan 5.000 rpm selama 1 jam, supernatan dipakai untuk skrining bakteri endofit

penghasil senyawa antibakteri.

Sesudah supernatan disiapkan, paper disc steril diinokulasi 40 μl supernatan.Untuk

mengurangi ekses air, paper disc dikeringkan di atas kaca arloji steril selama kurang lebih 1

jam. Mikrobia uji yaitu Staphylococcusaureusdan Escherichia coliditumbuhkan dalam NA

secara pour platting pada petri yang berbeda, yaitu dengan mengambil suspensi bakteri

ujiStaphylococcus aureus dan Escherichia coli sebanyak 1 ml kemudian diinokulasikan ke

dalam 20 ml Nutrient Agar yang sedang mencair pada temperatur 50 OC lalu dituang ke dalam

cawan petri dan digoyang perlahan-lahan untuk mencampur kultur bakteri dengan agar.
 Setelah agar memadat, paper disc yang telah diinokulasi supernatan ditempatkan di

permukaan medium. Inkubasi dilakukan pada suhu 37OC selama 24 jam atau sampai

terbentuknya zona jernih di sekitar paper disc. Potensi penghambatan diukur dengan

mengukur diameter zona jernihnya menggunakan penggaris (Jutono, dkk, 2007).

D. Teknik Analisi Data

1. Data jenis bakteri endofit morfologi koloni bakteri yang diperoleh dianalisis secara

deskriptif dengan mendeskripsikan morfologi bakteri endofit hasil pewarnaan gram.

2. Data kemampuan antibakteri dianalisis dengan menilai ada tidaknya zona hambat dan

menuliskan luas zona hambat yang terjadi pada media pertumbuhan bakteri uji yang

memiliki kemampuan antibakteri.