1

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Deoxyribonucleic acid atau DNA merupakan senyawa kimia yang paling

penting dalam makhluk hidup.DNA merupakan senyawa yang mengandung

informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya.

Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi

bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel organisme. DNA

genom meliputi gen danintergen (Suryo, 2015).

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi

untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.

DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya

adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein

histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak

berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas

memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu.

Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua.

Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon

dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki

protein histon (Kirsman, 2013).

Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada

(ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan

buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak. Pemisahan DNA

dari materi seluler lainnya merupakan hal yang signifikan dan mengharuskan

penyallinan DNA menjadi RNA dan translasi RNA menjadi protein berlangsung
 2

dalam kompartemen( ruang ) yang berbeda yaitu secara berturut-turut dalam

nucleus dan sitoplasma (Yuwono, 2018).

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu

prinsipisolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik

untukmemisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul

yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan

molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung . Hasil sentrifugasi akan

menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas

dan pelet pada bagian bawah (Rachmat, 2012).

DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian

DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel,

membran plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi.

Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA

murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Pemecahan

dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus

menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan

dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair dan garam dapur adalah

untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA

(Rachmat, 2012).
 3

Tujuan Praktikum

Adapun tujuan dari praktikum ini adalah untuk memahami cara-cara isolasi DNA.

Kegunaan Penulisan

Adapun kegunaan dari penulisan laporan ini adalah sebagai salah satu syarat

untuk dapat memenuhi komponen penilaian di Laboratorium Genetika Molekuler

Program Studi Agroteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara dan

menjadi sumber informasi bagi pihak yang membutuhkan.

 4

TINJAUAN PUSTAKA

Isolasi DNA (Deoxyribo Nucleic Acid) merupakan teknik yang penting

dalam pengembangan ilmu ini. Derajat kemurnian dan konsentrasi dalam isolasi

DNA sangat mempengaruhi hasil yang diperoleh. Analisis tingkat molekuler

dengan DNA sebagai objeknya diawali dengan proses isolasi DNA, selanjutnya

diikuti analisis molekuler, seperti PCR (Polymerase Chain Reaction), RLFP

(Restricted Fragment Lenght Polymorphis), dan RAPD (Restricted Amplified

Polymorphisms) (Fatchiyah, 2012).

Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari

DNA.Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi.Sentrifugasi

merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul

komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di

bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung.

Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu

supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah. Presipitasi merupakan

langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran

(Albert, 2014).

Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan

lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama dalam isolasi DNA ada

tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat

seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Prinsip isolasi DNA pada

berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai organisme pada dasarnya sama

namun memiliki modifikasi dalam hal teknik dan bahan yang digunakan. Bahkan

beberapa teknik menjadi lebih mudah dengan menggunakan kit. Isolasi DNA pada
 5

tanaman dapat dilakukan dari berbagai organ baik daun, batang, akar maupun

duri, namun umumnya jaringan yang diambil adalah jaringan yang masih muda

karena belum mengandung banyak metabolit sekunder yang mengotori DNA hasil

isolasi.(Artama,2012)

Tehnik sentrifugasi dilakukan oleh mesin yaitu mesin sentrifugasi dengan

kecepatan yang bervariasi. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam

fraksi yang terpisah, yaitu supernatan di bagian atas dan pelet di bagian bawah.

Akan terlihat 3 lapisan dari hasil centrifuge. Karena DNA bersifat ringat, maka

DNA berada dilapisan paling atas (supernatant). Lapisan kedua berbentuk

padatan, berisi material padat hasil lisis sel (debris). Misalnya serpihan dinding sel

yang rusak. Sedangkan lapisan paling bawah adalah klorofil yang larut dengan

kloroform (warnanya hijau) (Yudit, 2012).

Phenol:chloroform Mengunakan senyawa Phenol-choloroformisoamyl

alcohol, Metode standard untuk ekstraksi DNA,Akhir-akhir ini ditinggalkan,

karena sifat toksik phenol. 4. SaltingOut Menggunakan garam konsentrasi tinggi

(NaCl 6 M), untuk medenaturisasi protein menggunakan Proteinase K untuk

denaturasi protein. 5. Guanidine isothiocyanate Metode ini lebih cepat dibanding

dua metode sebelumnya, Thiocyanate bersifat toksik, untuk lisis dinding sel ,

Memerlukan chloroform untuk denaturasi protein. 6. Silica Gel Silica gel dapat

mengikat DNA dengan perantaraan garam/buffer tertentu (NaI), Cepat, tetapi

recovery DNA kurang 7. PCR (Polymerase Chain Reaction) Merupakan suatu

teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah

spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida.Primer yang

digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal
 6

yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip

dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif

(Giri, 2014)
 7

BAHAN DAN METODE

Tempat dan Waktu Praktikum

Adapun kegiatan praktikum ini dilaksankan di Jalan Serdang No. 131

Perbaungan, Provinsi Sumatera Utara Hari Selasa pada 01 Maret 2022 pada pukul

12.40 WIB sampai dengan selesai.

Alat Dan Bahan Praktikum

Adapun alat yang digunakan di dalam praktikum ini adalah laptop atau

handphone sebagai alat untuk mengikuti praktikum secara online melalui aplikasi

Google Meet dan laptop sebagai alat untuk membuat laporan praktikum

Adapun bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah literatur

sebagai media belajar untuk memahami praktikum dan proses pembelajaran dan

buku sebagai media untuk menulis materi yang disampaikan.

Prosedur Praktikum
1. Dipersiapkan laptop/hp oleh praktikan sebagai media praktikum
secaravirtual
2. Diberi kode google meet kepada praktikan untuk memulai praktikum.
3. Diabsen kehadiran mahasiswa pada saat pelaksanaanpraktium.
4. Dijelaskan materi praktikum mengenai pengenalan alat dan bahan
laboratorium atau materi yang sesuai dengan judul praktikum oleh Asisten
Laboratorium.
5. Dibacakan soal kuis sebelum memulai praktikum dan kuis tersebut dibahas
bersama-sama.
6. Dicatat di buku materi dari praktikum olehpraktikan
7. Dibuat jurnal sesuai dengan materi praktikum
 8

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil

GAMBAR KETERANGAN

Disemprot alat dan bahan

menggunakan alcohol agar steril

Dibuang tulang daun

Dipotong daun secara melintang dan

dimasukkan pada mortal

Ditambahkan nitrogen cair pada mortar

yang berisi potongan daun

Digerus daun searah jarum jam sampai

halus
 9

Ditambahkan PVPP 0,1 gr sebagai

antioksidan

Dimasukkan CTAB 1 ml dan

β- mercaptoethanol 10 µl kedalam tube

2ml dan di inkubasi pada waterbath

yang bersuhu 65o C selama 30 menit

Dimasukkan daun yang telah digerus

tadi kedalam tube yang berisi CTAB

dan β- mercaptoethanol yang telah

diinkubasi

Dikocok hingga homogen

Dilakukan inkubasi selama 30 menit

 10

Dilakukan pengocokkan saat inkubasi

setiap 10 menit

Ditambahkan 1ml KIAA

Dihomogenkan menggunakan vortex

Dimasukkan kedalam centrifuge selama

10 menit

Didapatkan hasil centrifuge selama 10

menit

Dipisahkan supernatan menggunakan

mikropipet dan dimasukkan ke dalam

tube baru
 11

Ditambahkan KIAA kedalam tube yang

berisi supernatan hasil centrifuge 10

menit

Dihomogenkan menggunakan vortex

Dimasukkan kedalam centrifuge selama

7 menit

Setelah dikeluarkan dari centrifuge,

ditambahkan KIAA 1ml

Dihomogenkan menggunakan vortex

Dimasukkan kedalam centrifuge selama

5 menit dan setelah di sentrifge di

tambah isopropanol dan diinkubasi

selama 1 malam
 12

Didapatkan hasil setelah diinkubasi

selama 1 malam

Disentrifuge hasil tsb selama 7 menit

Dipisahkan supernatan (pelet yg

berwarna kuning ditinggalkan di tube

utk tetap diamati)

Dikering anginkan

Ditambah buffer TE 100 µl dan etanol

absolut 1 ml

Disentrifuge selama 5 meni

 13

Dibuang larutan bening (buffer TE dan

etanol) dan tetap ditinggalkan pelet

pada tube utk diamati

Ditambah buffer TE 100 µl dan etanol

absolut 1 ml. Disentrifuge selama 10

menit

Dibuang larutan bening (buffer TE dan

etanol) dan tetap ditinggalkan pelet

pada tube utk diamati

Ditambah buffer TE 100 µl

Disimpan di binder
 14

Pembahasan

Isolasi DNA adalah suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA

murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Hal ini sesuai

dengan literatur Fatchiyah (2012) yang menyatakan bahwa Isolasi DNA

(Deoxyribo Nucleic Acid) merupakan teknik yang penting dalam pengembangan

ilmu ini. Derajat kemurnian dan konsentrasi dalam isolasi DNA sangat

mempengaruhi hasil yang diperoleh. Analisis tingkat molekuler dengan DNA

sebagai objeknya diawali dengan proses isolasi DNA, selanjutnya diikuti analisis

molekuler, seperti PCR (Polymerase Chain Reaction), RLFP (Restricted Fragment

Lenght Polymorphis), dan RAPD (Restricted Amplified Polymorphisms).

Prinsip utama isolasi DNA adalah dengan memecah dan mengekstraksi

jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri dari DNA, RNA

dan substansi dasar lainnya. Hal ini sesuai dengan literatur Albert (2014) yang

menyatakan bahwa Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk

mempelajari DNA.Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan

presipitasi.Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran

berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat

molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan

berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam

fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian

bawah. Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu

komponen dari campuran.

Prisnsip dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi

atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta
 15

pemurnian DNA (Purifikasi). Hal ini sesuai dengan literatur Artama (2012) yang

menyatakan bahwa Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan

DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama dalam

isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA

dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Prinsip

isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai organisme pada

dasarnya sama namun memiliki modifikasi dalam hal teknik dan bahan yang

digunakan. Bahkan beberapa teknik menjadi lebih mudah dengan menggunakan

kit. Isolasi DNA pada tanaman dapat dilakukan dari berbagai organ baik daun,

batang, akar maupun duri, namun umumnya jaringan yang diambil adalah

jaringan yang masih muda karena belum mengandung banyak metabolit sekunder

yang mengotori DNA hasil isolasi.

Hasil sentrifugasi akan menunjukkan 3 lapisan yaitu DNA berada

dilapisan paling atas (supernatant), karena DNA bersifat ringat. Lapisan kedua

berbentuk padatan, berisi material padat hasil lisis sel (debris). Hal ini sesuai

dengan literatur Yudit (2012) yang menyatakan bahwa sentrifugasi merupakan

teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya.

Akan terlihat 3 lapisan dari hasil centrifuge.Karena DNA bersifat ringat, maka

DNA berada dilapisan paling atas (supernatant).Lapisan kedua berbentuk

padatan, berisi material padat hasil lisis sel (debris).Misalnya serpihan dinding sel

yang rusak.Sedangkan lapisan paling bawah adalah klorofil yang larut dengan

kloroform (warnanya hijau).

Metode-metode isolasi DNA ini ada yang bagus ada jugak yang tidak

seperti Phenol:chloroform Mengunakan senyawa Phenol-choloroformisoamyl

 16

alcohol, Metode standard untuk ekstraksi DNA,Akhir-akhir ini ditinggalkan,

karena sifat toksik phenol. Hal ini sesuai dengan literatur Giri (2014) yang

menyatakan bahwa Phenol:chloroform Mengunakan senyawa Phenol-

choloroformisoamyl alcohol, Metode standard untuk ekstraksi DNA,Akhir-akhir

ini ditinggalkan, karena sifat toksik phenol. 4. SaltingOut Menggunakan garam

konsentrasi tinggi (NaCl 6 M), untuk medenaturisasi protein menggunakan

Proteinase K untuk denaturasi protein. 5. Guanidine isothiocyanate Metode ini

lebih cepat dibanding dua metode sebelumnya, Thiocyanate bersifat toksik, untuk

lisis dinding sel , Memerlukan chloroform untuk denaturasi protein. 6. Silica Gel

Silica gel dapat mengikat DNA dengan perantaraan garam/buffer tertentu (NaI),

Cepat, tetapi recovery DNA kurang 7. PCR (Polymerase Chain Reaction)

Merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro

pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida.Primer

yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai

tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut

mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif.
 17

KESIMPULAN

1. Isolasi DNA (Deoxyribo Nucleic Acid) merupakan teknik yang

penting dalam pengembangan ilmu ini. Derajat kemurnian dan

konsentrasi dalam isolasi DNA sangat mempengaruhi hasil yang

diperoleh.

2. Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari

DNA.Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi.

3. Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis),

ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan

protein, serta pemurnian DNA.

4. Tehnik sentrifugasi dilakukan oleh mesin yaitu mesin sentrifugasi

dengan kecepatan yang bervariasi. Hasil sentrifugasi akan

menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan di

bagian atas dan pelet di bagian bawah.

5. Phenol:chloroform Mengunakan senyawa Phenol-choloroformisoamyl

alcohol, Metode standard untuk ekstraksi DNA,Akhir-akhir ini

ditinggalkan, karena sifat toksik phenol.

 18

DAFTAR PUSTAKA

Artama, W.T. 2012. Rekayasa Genetika. Pusat Antar Universitas-Bioteknologi.

UGM. Yogyakarta.

Albert, B. 2014. Biologi Molekuler Sel Edisi Kedua. PT. Gramedia Pustaka
Utama. Jakarta.

Fatchiyah, 2012. Biologi Molekular Prinsip Dasar Analisis. Erlangga. Jakarta.

Giri, Rahman EA . 2014. Regulasi Ekspresi Gen Pada Organisme Bakteri.

Bandung : KPP Bioteknologi Bandung.

Kirsman, 2010.Isolasi DNA Buah. http://kirsman83.weebl..com. Diakses pada

tanggal 17 Maret 2014, pada pukul 23.00 WITA.

Prasetyo, A. 2008. Karakterisasi virus pada tanaman jarak pagar (Jatropha

curcas L.). Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada.

Rachmat, 2012. Isolasi DNA. http://rachmatyusuf.blogspot.com. Diakses pada

tanggal 17 Maret 2014, pada pukul 23.00 WITA.

Suryo, 2004. Genetika Strata 1. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.

Yuwono, T., 2008. Biologi Molekuler. Erlangga. Jakarta.

Yudit, 2012. Biologi Molekuler Sel. Universitas Sumatera Utara. Medan