JURNAL PRAKTIKUM

ISOLASI PLASMID

Diajukan untuk memenuhi tugas mata kuliah Biologi Molekuler III

Dosen Mata Kuliah:

Fusvita Merdekawati, MM.,M.Si

Disusun Oleh :

Mochamad Iqbal S. K
P17334119469

Kelas :
D4-3B

POLITEKNIK KESEHATAN KEMENKES BANDUNG

JURUSAN TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS
2022
 ISOLASI PLASMID

TUJUAN
 Mengisolasi plasmid pGEM-T kosong dan plasmid pGEM-T pembawa gen pengkode
Nattokinase dari dari sel bakteri Gram negatif Eschericia coli

PENDAHULUAN
Organisme prokariot seperti bakteri memiliki materi genetik utama yang berperan dalam
mengatur proses seluler penting. Materi genetik ini disebut kromosom yang tersusun dari DNA
rantai ganda sirkuler. DNA ini terlokalisasi dalam nukleoid sel dan tidak terasosiasi dengan
protein. Kromosom berukuran besar dan mencapai jutaan pasang basa.

Bakteri juga dapat memiliki materi genetik tambahan (ekstrakromosomal) pendek berukuran
ribuan pasang basa yang dapat bereplikasi independen di dalam sel. Pada umumnya gen pada
plasmid tidak mengkodekan gen essensial dari sel. Plasmid umumnya membawa gen terkait
resistensi pada antibiotik pada lingkungan yang kompetitif atau produksi protein toksin pada
kondisi tertentu. Plasmid umumnya digunakan pada rekayasa genetik sebagai vektor. Umumnya
plasmid digunakan untuk memperbanyak atau mengekpresikan gen tertentu. Plasmid bisa
mengandung gen insert berukuran 30-40 kpb
Prosedur isolasi plasmid diawali dengan memperbanyak bakteri yang mengandung plasmid dan
kromosom. Untuk isolasi plasmid, kultur bakteri yang digunakan berada pada fase akhir
logaritma / awal fase stasioner. Sel kemudian dilisis dengan menggunakan alkalin maupun
lisozim (untuk bakteri Gram positif) kemudian makromolekul intrasel dipisahkan dengan DNA
plasmid maupun kromosom. Pada metode isolasi plasmid, pemisahan plasmid dengan DNA dari
sel inang menggunakan prinsip bahwa plasmid umumnya berada dalam bentuk covalently closed
circular (ccc) sehingga akan tahan dari denaturasi dengan alkalin.

Pada praktikum ini, dilakukan isolasi plasmid dilakukan untuk mendapatkan pGEM-T kosong
dan pGEM-T pembawa gen pengkode Nattokinase dari Escherichia coli.

METODE

I. PEMBUATAN LURIA BERTANI (LB)

Alat dan Bahan :
1. Erlenmeyer 100mL 1. Yeast extract 0,25 gram
2. Kasa steril 2. NaCl 0,25 gram
3. Autoclave 3. Trypton 0,5 gram
4. Magnetic Stirer 4. Aquades 50 mL
Cara Kerja :
1. Sebanyak 0,25 gram yeast exract (Bacto, Prancis), 0,5 gram NaCl (merck), dan 0,5 gram
trypton (Oxoid, Inggris) dimasukkan dalam erelenmeyer 100 ml
2. Ditambahkan 50 ml akuades
3. Medium LB untuk produksi ditambahkan dengan xilan sebagai inducer.
4. Erlenmeyer ditutup dengan kasa steril yang telah diisi kapas.
5. Campuran disterilkan dengan dipanaskan pada autoclave selama 30 menit.
6. Campuran dikeluarkan dan dibiarkan hingga suhu ruang untuk selanjutnya disimpan dalam
lemari pendingin.
II. CARA KERJA OPTICAL DENSITY
Pengukuran OD dilakukan dengan metode langsung berdasarkan turbiditas. Alat yang digunakan
yaitu spektrofotometer. Pengecekan OD dilakukan setiap 1 - 2 jam sekali dengan cara 1 ml
sampel dimasukkan ke dalam kuvet. Panjang gelombang yang digunakan yaitu 600 nm.

Contoh cara kerja OD dalam pemeriksaan E.coli :

Kultur E. coli umur kurang lebih 12 jam dalam medium kaldu nutrisi cair. Fase pertumbuhan ini

dapat dipertahankan dengan menyimpannya dalam lemari es

erbath shaker incubator suhu 37C

PROSEDUR KERJA

1. Masukkan (inokulasikan) 5 ml kultur E. coli menggunakan pipet ke dalam kaldu nutrisi cair
steril

2. Ukur OD dari hasil inokulasi tersebut sesegera mungkin pada panjang gelombang = 600 nm
menggunakan spektrofotometer (OD awal biasanya berkisar 0,08 – 0,1)

3. Letakkan kultur pada waterbath shaker inkubator 37C

4. Ulangi pemeriksaan OD setiap 30 menit sekali. Nilai OD pada setiap kali pemeriksaan harus
pada nilai 0,05 – 0,5. Jika terlalu pekat, cuplikan kultur yang akan diperiksa OD-nya harus
diencerkan dengan medium cair steril sesuai keperluan.

5. Hasil pengukuran OD diplot pada kurva dengan OD sebagai ordinat dan waktu sebagai absis.

6. Hitung waktu generasinya

III. CARA KERJA ISOLASI
A. Protokol Sentrifugasi

Produksi lisat yang dibersihkan

1. Pelet 1–10ml biakan semalaman selama 5 menit.

2. Resuspend pelet secara menyeluruh dengan 250µl Cell
Resuspension Solution.
3. Tambahkan 250µl Cell Lysis Solution ke setiap sampel; balikkan
4 kali untuk mencampur.
4. Tambahkan 10µl Alkaline Protease Solution; balikkan 4 kali
untuk mencampur. Inkubasi 5 menit pada suhu kamar.
5. Tambahkan 350µl Larutan Netralisasi; balikkan 4 kali untuk
mencampur.
6. Centrifuge dengan kecepatan tinggi selama 10 menit pada suhu
kamar.

Pengikatan DNA Plasmid

7. Masukkan Spin Column ke dalam Collection Tube.

8. Tuang lisat yang telah dibersihkan ke dalam Spin Column.
9. Centrifuge dengan kecepatan tinggi selama 1 menit pada suhu kamar. Buang
flowthrough, dan masukkan kembali Kolom ke dalam Collection Tube.

Pencucian

10. Tambahkan 750µl Wash Solution (tambahan etanol 95%). Centrifuge dengan kecepatan
tinggi selama 1 menit. Buang flowthrough dan masukkan kembali kolom ke Collection
Tube.
11. Ulangi Langkah 10 dengan 250µl Wash Solution.
12. Centrifuge dengan kecepatan tinggi selama 2 menit pada suhu kamar.
Elusi

13. Pindahkan Spin Column ke dalam tabung mikrosentrifugasi 1,5 ml steril, berhati-hatilah
untuk tidak memindahkan salah satu dari Column Wash Solution dengan Spin Column.
Jika Spin Column memiliki Column Wash Solution yang terkait, sentrifugasi lagi selama
1 menit dengan kecepatan tinggi, kemudian pindahkan Spin Column ke tabung
mikrosentrifugasi 1,5 ml yang baru dan steril.
14. Tambahkan 100µl Air Bebas Nuklease ke Kolom Putar. Centrifuge dengan kecepatan
tinggi selama 1 menit pada suhu kamar.
15. Buang kolom, dan simpan DNA pada –20°C atau di bawahnya. DNA stabil dalam air
tanpa penambahan buffer jika disimpan pada suhu –20°C atau di bawahnya. DNA stabil
pada suhu 4°C di TE penyangga. Untuk menyimpan DNA
dalam buffer TE, tambahkan 11µl buffer TE 10X ke 100µl
DNA yang dielusi. Jangan tambahkan TE buffer jika DNA akan
digunakan untuk pengurutan fluoresen otomatis.

B. Protokol Vakum

Produksi lisat yang dibersihkan

1. Pelet 1–10ml biakan semalaman selama 5 menit.

2. Resuspend pelet secara menyeluruh dengan 250µl Cell
Resuspension Solution.
3. Tambahkan 250µl Cell Lysis Solution ke setiap sampel;
balikkan 4 kali untuk mencampur.
4. Tambahkan 10µl Alkaline Protease Solution; balikkan 4 kali
untuk mencampur. Inkubasi 5 menit pada suhu kamar.
5. Tambahkan 350µl Larutan Netralisasi; balikkan 4 kali untuk
mencampur.
6. Centrifuge dengan kecepatan tinggi selama 10 menit pada suhu
kamar..
Pengikatan DNA Plasmid

7. Pasang Adaptor Vakum ke port manifold, dan masukkan Spin Column ke Adaptor.
8. Tuang lisat yang dibersihkan ke dalam kolom.
9. Terapkan vakum untuk menarik cairan melalui kolom. Lepaskan vakum ketika semua
cairan telah melewati kolom.

Pencucian

10. Tambahkan 750µl Wash Solution (tambahan etanol 95%). Terapkan vakum untuk
menarik solusi melalui kolom. Ketika semua cairan telah ditarik melalui Kolom
Putar,lepaskan vakum.
11. Matikan vakum, dan ulangi Langkah 10 dengan 250µl Wash Solution.
12. Keringkan dengan vakum selama 10 menit.
13. Pindahkan kolom ke Collection Tube 2 ml, dan sentrifuge dengan kecepatan tinggi
selama 2 menit.

Elusi

14. Pindahkan kolom ke tabung mikrosentrifus 1,5 ml steril.

15. Tambahkan 100µl Air Bebas Nuklease ke dalam kolom. Centrifuge dengan kecepatan
tinggi selama 1 menit pada suhu kamar.
16. Buang kolom. Simpan DNA pada -20°C atau di bawahnya. DNA stabil dalam air tanpa
penambahan buffer jika disimpan pada suhu –20°C atau di bawahnya. DNA stabil pada
suhu 4°C di TE penyangga. Untuk menyimpan DNA dalam buffer TE, tambahkan 11µl
buffer TE 10X ke 100µl DNA yang dielusi. Jangan tambahkan TE buffer jika DNA akan
digunakan untuk pengurutan fluoresen otomatis.

IV. PEMBUATAN STARTER

E. coli yang membawa plasmid pGEM-T dan pGEM-T dengan gen pengkode Nattokinase,
ditumbuhkan pada media Luria Bertani (LB) padat yang mengandung ampisilin sebanyak 100
µg/mL pada suhu 37 °C selama 18 jam. Koloni yang tumbuh pada medium padat kemudian
ditumbuhkan pada medium LB cair yang sudah mengandung ampisilin sebanyak 100 µg/mL
pada suhu 37 °C selama 18 jam. Diinkubasi selama 18 jam pada suhu 37 oC, 150 rpm.
V. ISOLASI PLASMID
Panen sel
Resuspensi
Lisis sel
Netralisasi
Pengikatan DNA plasmid pada kolom
Pencucian
Elusi DNA plasmid dari kolom

Plasmid diisolasi dengan Wizard ® Plus SV Minipreps DNA Purification dari kultur E. coli yang
ditumbuhkan pada LB cair di OD600 0,6-0,7. Langkah kerja:

https://www.youtube.com/watch?v=zPV0bhNBL5o
KARAKTERISASI

1. Pembuatan gel agarosa 1 % dilakukan dengan mencampurkan 0,5 gram serbuk agarosa ke
dalam 50 mL TAE 1x, didihkan di dalam microwave dan dicetak dalam cetakan agar+sumur.
2. Sampel hasil isolasi plasmid dan kromosom dicampurkan dengan DNA loading dye dengan
perbandingan 5:1 antara sampel dengan loading dye.
3. Sampel dimasukkan ke dalam sumur dengan mikropipet, direndam dalam TAE 1x dan
diberikan voltase serta arus tertentu selama periode waktu tertentu.
4. Gel hasil elektroforesis direndam menggunakan EtBr (Etidium Bromida)/Biotium selama 5
menit kemudian dicuci dengan aquades selama 15 menit dan divisualisasi di atas paparan
sinar UV.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Kultur terlebih dahulu diinkubasi pada media Luria Bertani (LB) cair selama 18 jam di suhu 37
°C dengan tujuan untuk memberikan waktu untuk perbanyak sel bakteri sehingga dapat diisolasi
plasmid dalam jumlah banyak. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 °C yang merupakan suhu
optimum bagi pertumbuhan bakteri. Kondisi yang optimal adalah jika sel kultur memiliki OD600
pada pada 0,6-0,7 atau saat bakteri berada diakhir fasa eksponensial atau pada awal fasa
stasioner. Pemanenan sel dilakukan dengan cara memisahkan pelet sel dari media tumbuhnya
dengan metode sentrifugasi.

Gambar 2. Kurva pertumbuhan bakteri

Keterangan kurva :
1. Fase lag : mikroorganisme sedang beradaptasi, tidak terjadi perbanyakan
2. Fase eksponensial : mikroorganisme aktif berkembang biak, jumlah bertambah
3. Fase stasioner : nutrisi mulai habis, mikroorganisme berhenti berkembang biak
4. Fase kematian : nutrisi mulai habis, mikroorganisme mati

Pada isolasi plasmid dilakukan pembuatan starter dengan menginokulasi kultur dari media LB
padat ke media LB cair yang mengandung ampisilin. Dengan penambahan ampisilin, media
berperan sebagai media selektif media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat
tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang
pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Hal ini karena sel yang diinginkan tumbuh adalah sel
yang membawa plasmid pGEM-T. Dengan penambahan ampisilin, kontaminan yang tidak
membawa gen resistensi antibiotik tidak dapat tumbuh. Media LB memiliki komposisi sebagai
berikut:
Komponen Jumlah Fungsi
NaCl 1 % b/v Menyediakan ion natrium untuk transpor dan keseimbangan
osmotik
Yeast extract 0,5 % b/v Mengandung asam amino lengkap dan vitamin B kompleks
Tripton 1 % b/v Mengandung peptida dan pepton sebagai sumber asam
amino esensial
Bacto agar 1,5 % b/v Membuat padat media (hanya digunakan untuk pembuatan
media padat)
Aquadest Add to 100% Pelarut
v/v

Prinsip isolasi plasmid Pelet sel diresuspensi dengan larutan CRA dari mengandung dapar Tris
pH 7.5, EDTA, glukosa dan RNAse. Dapar Tris di pH 7.5 merupakan nilai dapar yang optimum
digunakan untuk menjaga kestabilan DNA. EDTA berperan dalam menghambat aktivitas
nuklease yang mungkin ada untuk menjaga kestabilan DNA. Glukosa memberikan syok osmotik
pada sel untuk melemahkan dinding sel dan membran sel. RNase ditujukan untuk mendegradasi
RNA sel. Selanjutnya dilakukan lisis terhadap pelet sel untuk memperoleh plasmid yang terletak
di sitoplasma bakteri E. coli. Lisis sel dilakukan dengan penambahan NaOH dan SDS (Sodium
Deodecyl Sulfate) sementara pH alkalin/basa mendenaturasi DNA kromosom tapi tidak terhadap
ccc DNA plasmid.
Selanjutnya dilanjutkan netralisasi dengan larutan NSB yang mengandung C2H3NaO2 (sodium
asetat) pada pH 5,4. Hal ini bertujuan untuk melarutkan plasmid sementara DNA kromosom dan
protein akan berada dalam bentuk endapan. Hal ini dikarenakan plasmid DNA yang terdenaturasi
di tahapan sebelumnya akan lebih cepat terenaturasi kembali dibandingkan kromosomal DNA
dikarenakan ukuran plasmid yang jauh lebih kecil dibandingkan ukuran kromosomal
DNA.Pemisahan antara komponen terlarut dan tidak terlarut disempurnakan dengan sentrifugasi.
Protein akan mengendap dan membentuk kompleks dengan SDS dan mengendap bersama
kromosom. Selanjutnya plasmid terlarut yang diperoleh akan diikat pada matriks silika pada
kolom PD. Pengikatan ini memanfaatkan prinsip kekuatan ionik dimana
plasmid yang bermuatan negatif akan berinteraksi dengan muatan negatif pada matriks silika dan
dijembatani oleh ion garam bermuatan positif.

Pembilasan komponen lain yang tidak terikat kuat pada matriks silika dilakukan dengan
menambahkan wash solution (CWA) (mengandung etanol absolut). Dapar W1 ini mengandung
kandungan garam yang tinggi untuk menguatkan ikatan ionik plasmid dan matriks silika
sedangkan wash buffer selain mengandung kandungan garam yang tinggi juga mengandung
etanol yang dapat melarutkan pengotor. Elusi plasmid dari kolom PD dilakukan dengan
menggunakan ddH2O steril hangat yang ditambahkan ke bagian tengah matriks kolom.
Penambahan larutan eluen yang berkadar garam rendah ini akan melepas ikatan antara plasmid
dan matrik silika. Plasmid yang terelusi lalu dikarakterisasi dengan elektroforesis.

Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul seluler berdasarkan atas ukurannya,
dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel
yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang
ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan
negatif dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel agarose, kemudian dialiri arus listrik dari
satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya, maka molekul tersebut akan bergerak dari
kutub negatif ke kutub positif.
 Perangkat Elektroforesis

Plasmid pGEM -T memiliki 4 lokus gen besar yang berperan dalam pengklonan gen yaitu
fl ori, Amp, ori, dan lacZ. Sekuens origin of Replication (ori) merupakan tempat inisiasi replikasi
DNA plsmid. Plasmid tersebut juga memilih daerah retriksi yang telah dikenali dan ditandai oleh
enzim retriksi nuklese, sepertii EcoRI, Xbal, dn Sphl. Gen asing disisipkan pada daerah ori,
sehingga gen dpat dikarakterissi setelah dilakukan amplifikasi (Promega 2015: 11). Contoh
visualisasi pGEM -T

Nattokinase dikodekan oleh gen aprN , yang pertama kali dikloning dan diurutkan dari B.
subtilis (natto). Panjang parsial gen aprN adalah 0,8 kb (Gambar 5A) dan peptida matang
memiliki berat molekul 27,7 kDa (Gambr 5B).
 DAFTAR PUSTAKA

Anonim, n.d. lib.ui.ac.id. [Online]

Available at: https://lib.ui.ac.id/file?file=digital/124103-BIO.004-08-Seleksi%20bakteri-Metodologi.pdf
[Accessed 27 Januari 2022].

Anonim, n.d. Repository Unair. [Online]

Available at: http://repository.unair.ac.id/25635/15/15.%20Bab%203.pdf
[Accessed 27 Januari 2022].

Anonim, n.d. Repository UPI. [Online]

Available at: http://repository.upi.edu/15091/6/S_BIO_1006883_Chapter3.pdf
[Accessed 22 Januari 2022].

Efendy, A. H., 2015. Eksplorasi Kaldu Usus Ayam Potong dan Air Cucian Beras Sebagai Medium
Pertumbuhan (Bacillus sp) Penghasil Enzim Xilanase, Jember: Universitas Jember.

Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS
A1330, A1340, A1460, A1465 AND A1470. https://worldwide.promega.com/-
/media/files/resources/protcards/wizard-plus-sv-minipreps-dna-purification-system-quick-
protocol.pdf?rev=8293c52acfca4de495f1df90a7753d50&sc_lang=en

Nurhayati Betty, Darmawati Sri, 2017, Bahan Ajar Teknologi Laboratorium Medis (TLM) Biologi Sel
dan Molekuler, Kementrian Kesehatan Republik Indonesia, http://bppsdmk.kemkes.go.id/, diakses pada
27 Januari 2022.

Unknown, Migu Botanical Extract, Nettokinase, www.fungus--extract-com, diakses pda 27

Januari 2022