PERENCANAAN STUDI PEMILIHAN KOHORT PASIEN

1. Merencanakan studi
a. Pemilihan kohort pasien
pasien dalam studi gen kandidat dan GWAS akan diobati dengan
obat onkologi tunggal sehingga efek fenotipik dapat dikaitkan
dengan obat yang diinginkan. Selain itu, dosis standar dan
penjadwalan pemberian adalah penting, karena variasi dosis
mempengaruhi fenotipe yang berhubungan dengan obat. Jadwal
pemberian dosis obat tertentu digunakan dalam uji klinis
prospektif,
memberikan data obat yang konsisten dan terpelihara dengan baik
untuk studi farmakogenomik. Namun, kelompok pengobatan pada
uji coba tersebut dapat mencakup beberapa terapi, yang mungkin
atau mungkin tidak dari kelas obat yang sama. Untuk
meningkatkan ukuran sampel untuk fenotipe tertentu, mungkin
berguna untuk menggabungkan data dari kelompok pengobatan uji
klinis dan kemudian untuk mengontrol potensi pembaur karena
perbedaan pengobatan dalam analisis statistik. Strategi ini telah
berhasil dalam GWAS toksisitas muskuloskeletal yang disebabkan
oleh inhibitor aromatase yang digunakan untuk mengobati kanker
payudara13 dan GWAS kelangsungan hidup keseluruhan pasien
kanker pankreas yang diobati dengan gemcitabine14 (MEJA 2).
Uji klinis yang membandingkan dua inhibitor aromatase adalah
contoh desain uji coba obat A versus obat B. Untuk menjelaskan
perbedaan potensial dalam hasil antara kedua obat, setiap kasus
toksisitas muskuloskeletal dicocokkan dengan dua kontrol
berdasarkan kelompok pengobatan dan variabel lain dalam desain
kasus-kontrol bersarang13. Uji coba kanker pankreas adalah
contoh desain uji coba obat A versus obat A + B. Dalam jenis
percobaan ini, agen baru sering ditambahkan ke standar perawatan
saat ini. Di sini, pasien dengan kanker pankreas stadium lanjut
diobati dengan gemcitabine plus bevacizumab atau plasebo.
Menguji kovariat kelompok pengobatan dalam model statistic
digunakan untuk mengontrol perbedaan potensial dalam hasil
ketika data digabungkan dalam GWAS untuk kelangsungan hidup
secara keseluruhan14. Dalam kasus ini, varian teratas mungkin
memiliki efek prognostik untuk kanker pankreas karena stratifikasi
oleh kelompok pengobatan tidak secara negative mempengaruhi
hubungan varian dengan kelangsungan hidup secara keseluruhan.
b. Sumber DNA
 DNA normal mudah diperoleh dari darah atau, dalam kasus pasien
dengan kanker darah, air liur. Karena sampel tumor adalah
campuran dari kanker dan sel normal, sampel biopsi yang difiksasi
formalin dan parafin (FFPE) umumnya harus
dihindari sebagai sumber DNA untuk studi germline.
c. Mengoptimalkan ukuran sampel
Ukuran sampel yang sesuai akan bergantung pada ukuran efek
yang diharapkan dari varian genetik serta jumlah varian yang akan
diuji (yaitu, apakah studi gen kandidat atau GWAS sedang
dilakukan). Dalam GWAS penemuan, ukuran efek yang
diharapkan tidak diketahui, dan dengan demikian ukuran sampel
yang besar (misalnya, ribuan individu dalam kelompok perlakuan)
diperlukan untuk mendeteksi varian umum dengan efek kecil (rasio
odds dari 1,1 hingga 2), seperti yang sering diamati pada GWAS
kerentanan penyakit21. Sementara kemajuan teknologi dalam
teknologi genotipe telah menurunkan biaya dan memungkinkan
ukuran sampel yang lebih besar, ukuran sampel GWAS
farmakogenomik biasanya berkisar dalam ratusan13 15,22. Upaya
untuk meningkatkan ukuran uji klinis akan membantu
mendeteksi asosiasi ukuran efek yang kecil, tetapi hal ini tidak
selalu memungkinkan jika frekuensi penggunaan obat tertentu
rendah. Selain itu, uji klinis saat ini didukung untuk mendeteksi
perbedaan hasil di antara perawatan, bukan hubungan genetik.
Namun, beberapa GWAS farmakogenomik yang melibatkan ~ 100
kasus telah mendeteksi hubungan yang signifikan secara statistik,
menunjukkan bahwa ukuran efek untuk beberapa fenotipe yang
diinduksi obat jauh lebih besar dan melibatkan lebih sedikit gen
daripada yang terdeteksi di GWAS untuk kerentanan penyakit
kompleks.23. Misalnya, asosiasi genom-widesignificant dari varian
genetik dalam keluarga pengangkut anion organik pembawa zat
terlarut, anggota 1B1 (SLCO1B1) dengan miopati yang diinduksi
oleh obat penurun kolesterol simvastatin
diidentifikasi dalam kohort GWAS penemuan dari 85 kasus dan 90
kontrol karena ukuran efek yang besar (rasio odds = 4,5) dari alel
risiko24. Asosiasi ini telah direplikasi dalam kohort
tambahan24,25. GWAS farmakogenomik kanker telah
menunjukkan hasil yang menjanjikan dengan ukuran sampel
ratusan, tetapi replikasi masih menjadi masalah bagi banyak
penelitian. Saat ini, tidak ada cukup banyak kumpulan data pasien
dengan fenotipe yang baik untuk sebagian besar obat kanker yang
 sedang diselidiki untuk membuat studi replikasi menjadi layak,
terutama ketika ukuran efeknya kecil.
d. Fenotipe kanker utama
Pemilihan fenotipe adalah langkah penting dalam pelaksanaan
studi farmakogenomik yang kuat. Untuk studi kanker, terutama
dalamanalisis retrospektif dari percobaan besar, pemilihan fenotipe
telah menjadi tantangan mendasar. Di sini kami menjelaskan
fenotipe yang biasanya tersedia dari uji klinis dan pengembangan
alat yang memungkinkan studi farmakogenomik kanker yang lebih
efektif dan efisien. Penilaian untuk menilai tingkat keparahan
toksisitas pengobatan menggunakan skalaordinal standar seperti
Kriteria Terminologi Umum untuk Kejadian Buruk (CTCAE) yang
dikembangkan oleh Institut Kanker Nasional AS dan digunakan
disebagain besar studi international. CTCAE telah berguna untuk
mengelola keamanan keamanan agen antikanker baru dalam uji
klinis dan memberikan penyelidikan dan dokter dengan seragam
umum.
Terlepas dari keterbatasannya, peringkat CTCAE telah berhasil
digunakan sebagai fenotipe untuk mengidentifikasi prediktor
genetik germline toksisitas pada pasien13,22. Seperti yang
dilakukan dalam studi ini, peneliti harus membiasakan diri dengan
pengamatan empiris dan tindakan dari dokter yang telah melakukan
fenotip untuk mengidentifikasi penanda farmakogenomik yang kuat
dari efek samping. Seringkali, peneliti dapat mengidentifikasi
tingkat ambang batas yang relevan secara klinis untuk menentukan
efek samping pada skala CTCAE. Kolaborasi antara ahli genetika,
farmakologis dan dokter yang terlibat dalam penelitian dengan
beberapa keakraban dengan prinsip-prinsip analitik lintas disiplin
dapat menjadi penting untuk studi toksisitas farmakogenomik
kanker. Penelitian klinis biasanya mengandalkan system kategoris
lain untuk mengevaluasi efek pengobatan pada penyakit yaitu
Kriteria Evaluasi Respon pada Tumor Padat (RECIST). RECIST
ini dikembangkan untuk menstandardisasi penilaian respon tumor
pada pasien yang terdaftar dalam uji klinis.
e. Endofenotipe Kanker Kunci
Endofenotipe adalah fenotipe perantara yang lebih kuantitatif
antara varian genetik dan fenotipe klinis yang dibahas di atas. Oleh
karena itu, menggunakan ini dapat menyebabkan asosiasi
farmakogenomik yang mungkin terlewatkan dengan pengukuran
yang kurang tepat. Endofenotipe seperti pengukuran
 fungsi enzim darah tepi6dan konsentrasi obat plasma15,32telah
menjadi sarana utama yang penanda farmakogenetik kanker telah
pertama kali diidentifikasi. Endofenotipe tambahan yang berguna
untuk menguji hubungan dengan varian genetik germline termasuk
perubahan konsentrasi protein serum dan
ukuran klinis seperti tekanan darah setelah perawatan33.In
vitroendophenotyping (misalnya, ekspresi gen global dan pola
metilasi34–36) adalah strategi penemuan lainnya. Beberapa
penelitian terbaru telah menggunakan ekspresi lokus sifat
kuantitatif (eQTLs) yang ditemukan dalam garis sel untuk
menemukan
hubungan dengan fenotipe pasien kanker37–39. Mungkin yang
paling penting, endophenotyping menawarkan kesempatan untuk
mengoptimalkan teknik pengukuran, untuk membedakan antara
calon fenotipe untuk penyelidikan lebih lanjut dan untuk
menggabungkan pengetahuan yang berasal dari populasi lain dan
studi endofenotipe terkait.
f. Analisis Statistik
g. Fenotipe yang berkorelasi
Dalam uji coba onkologi, beberapa fenotipe yang berkorelasi
(misalnya, respons tumor, kelangsungan hidup bebas
perkembangan dan kelangsungan hidup secara keseluruhan)
tersedia untuk analisis farmakogenomik. Jika analisis GWAS
dilakukan pada beberapa fenotipe, godaan untuk melaporkan hanya
fenotipe 'pemenang' (yaitu, yang memiliki signifikanPnilai) tanpa
mengoreksi beberapa pengujian harus dihindari43. Metode yang
menggabungkan fenotipe yang berkorelasi dalam GWAS telah
menunjukkan peningkatan kekuatan untuk mendeteksi asosiasi
SNP44,45. Dengan demikian, menggabungkan beberapa fenotipe
yang tersedia dapat menyebabkan asosiasi tambahan yang tidak
ditemukan ketika fenotipe dianalisis secara tunggal.
h. Heterogenitas dan meta analisis
Sumber heterogenitas spesifik untuk farmakogenomik kanker dapat
mencakup dosis obat yang diberikan, kombinasi obat yang
diterima, jenis kanker dan stadium kanker (yang merupakan
kategorisasi dari luasnya penyakit). Untuk obat kanker, penting
untuk memasukkan potensi heterogenitas pengobatan ke dalam
analisis. Misalnya, ketika tamoxifen diberikan sebagai monoterapi,
hubungan yang signifikan antara germlineCYP2D6genotipe dan
 hasil penyakit telah ditunjukkan dalam beberapa penelitian
(terutama yang tidak menggunakan tumor DNA.
i. Replikasi dan validasi
Upaya replikasi untuk farmakogenomik kanker sering terhambat
oleh kurangnya kohort replikasi pasien yang sesuai. Contohnya
adalah asosiasi (ditemukan di GWAS) antara varian fungsional
nonsynonymous di interleukin 17F (IL17F) dan kelangsungan
hidup pada kanker pankreas. Ini belum direplikasi karena
kurangnya uji coba yang ada dengan kriteria kelayakan dan
pengobatan obat yang sama dengan studi penemuan (yang
menggunakan gemcitabine dengan atau tanpa
bevacizumab)14(MEJA 2). Meskipun percobaan replikasi yang
sempurna mungkin tidak pernah ada,
asosiasi yang tidak direplikasi dari GWASs farmakogenomik harus
dilaporkan dalam literatursehingga kelompok dengan data pasien
terkait dapat menguji replikasi. Misalnya, temuan hubungan SNP
dengan izin metotreksat15sekarang telah direplikasi dalam kohort
SEMUA pasien tambahan oleh kelompok peneliti independen60
(MEJA 2).Meskipun pengujian untuk replikasi dalam kohort pasien
independen sangat ideal, jika kohort tersebut tidak tersedia, studi
fungsional tindak lanjut dalam sistem model dapat dilakukan untuk
memperkuat kepercayaan pada temuan awal.
j. Alternatif untuk GWAS Klinis
Bahkan tanpa kohort pasien yang cukup besar untuk mencoba
GWAS, memasangkan data asosiasi varian germline pasien dengan
pekerjaan fungsional yang luas dapat melibatkan gen dalam
respons obat. Sebagai contoh, sebuah penelitian baru-baru ini
menggunakan data varian struktural seluruh genom dari hanya lima
pasien leukemia myeloid kronis (CML) untuk mengidentifikasi
penghapusan umum pada BCL2-like 11 (BCL2L11; juga dikenal
sebagaiBIM) pada tiga pasien yang resisten terhadap inhibitor
tirosin kinase62(MEJA 2). Penghapusan mengubah splicing,
menghasilkan isoform BIM yang tidak memiliki domain pro-
apoptosis. Studi
fungsional ekstensif dalam CML dan garis sel kanker paru-paru
menunjukkan bahwa polimorfisme cukup untuk memberikan
resistensi terhadap inhibitor tirosin kinase dengan penurunan
aktivasi apoptosis. Setelah mendemonstrasikan mekanisme
fungsional untuk penghapusan ini, penulis menunjukkan bahwa
pasien dengan
 CML atau kanker paru-paru yang membawa penghapusan germline
mengalami respons yang secara signifikan lebih rendah terhadap
inhibitor tirosin kinase.62
k. Garis Sel
model garis sel dapat digunakan dalam studi penemuan untuk
menghasilkan hipotesis. Keterbatasan utama dari semua model
garis sel adalah bahwa sebagian besar efek yang diinduksi obat
melibatkan interaksi berbagai jenis sel dan organ; dengan
demikian, sistem model tunggal tidak dapat mewakili kompleksitas
efek obat dalam tubuh manusia. Namun, keuntungan dari model
garis sel sangat banyak, termasuk kemudahan manipulasi
eksperimental dan kurangnyain vivopembaur hadir dalam sampel
klinis. Ketersediaan data genotipe ekstensif untuk banyak panel
LCL yang berasal dari individu-individu dari keturunan yang
beragam, termasuk yang berasal dari HapMapdan 1000 Genom
proyek, memfasilitasi studi varian genetik yang memprediksi
kerentanan obat.

l. Mengurutkan Ulang untuk mendeteksi varian langka

Dalam studi tindak lanjut untuk izin metotreksat yang dibahas
sebelumnya GWAS, pengurutan ulang yang dalam dari
SLCO1B1lokus di 699 pediatrik SEMUA pasien
dilakukan.SLCO1B1varian menyumbang 10,7% dari variabilitas
populasi dalam pembersihan. Varian nonsynonymous yang langka
terdiri dari 17,8% dariSLCO1B1variasi dan memiliki ukuran efek
yang lebih besar daripada varian umum yang tidak identik. Studi
semacam itu memiliki kekuatan yang jauh lebih kecil untuk
mendeteksi efek alel langka daripada alel umum; dengan
demikian, ketika asosiasi varian langka ditemukan, ukuran efek
mungkin lebih besar daripada varian umum. Hasil ini mendukung
hipotesis bahwa kombinasi varian umum dan langka mungkin
penting untuk fenotipe farmakogenomik. Metode sekuensing
generasi berikutnya telah membuat penemuan varian genetik
langka di seluruh genom menjadi cepat dan terjangkau. Karena
ukuran sampel dalam farmakogenomik kanker seringkali ratusan
daripada ribuan, metode untuk menggabungkan beberapa varian
langk (frekuensi alel minor <0,01) dalam gen atau wilayah
menjadi tes asosiasi tunggal akan diperlukan, dan beberapa telah
diusulkan. Salah satu metode pengujian untuk asosiasi tingkat gen
dalam studi penemuan mengasumsikan bahwa gen dengan
 dominan alel frekuensi rendah pada individu dengan fenotipe
ekstrim lebih mungkin untuk memodulasi fenotipe itu.
m. Kesimpulan dan Arah masa depan
GWAS fenotipe farmakogenomik kanker yang berhasil
dimungkinkan, tetapi replikasi asosiasi varian germline sulit
dilakukan, seringkali karena tantangan yang terkait dengan uji
klinis besar dan kurangnya populasi replikasi yang terdefinisi
dengan baik dalam onkologi. Pengumpulan DNA germline dan
persetujuan untuk studi genetik dari sebanyak mungkin peserta
dalam uji klinis obat kanker di masa depan akan memungkinkan
studi asosiasi farmakogenomik seluruh genom dari kohort dengan
dosis standar dan koleksi fenotipe. Pendekatan lain yang dapat
dipertimbangkan adalah analisis berbasis jalur; seperti metode
yang menggabungkan varian langka dalam gen menjadi tes
asosiasi tunggal, varian dalam jalur juga dapat digabungkan.
Pendekatan berbasis jalur memberikan analisis yang lebih kuat
dari kumpulan data GWASdaripada analisis varian tunggal atau
gen. Seperti pendekatan mungkin sangat berguna untuk analisis
farmakogenomik uji klinis onkologi, yang sering kurang
bertenaga untuk mengungkap varian dengan ukuran efek kecil.