BAB 3.

METODOLOGI

3.1 Waktu dan Tempat Pelaksanaan

Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Juli- Nopember 2017. Penelitian ini
bertempat di Laboratorium Kultur Jaringan Politeknik Negeri Jember, Jember, Jawa
Timur.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat
a) Laminar Air Flow
b) Botol kultur
c) Petridish
d) Gunting
e) Pinset
f) Bunsen
g) Water Destilator
h) Kamera
i) Timbangan analitik
j) Jangka sorong
k) Baki penanaman

3.2.2 Bahan
a) Eksplan kentang varietas Granula
b) Aquadest
c) Alkohol
d) Spiritus
e) Agar-agar
f) Gula pasir
g) Tisu

14
 h) Masker
i) Kertas label

3.3 Metode Penelitian

Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap Faktorial (RALF)
dengan dua faktor yaitu:
Faktor pertama yaitu penambahan konsentrasi Manitol pada media MS.
Penambahan konsentrasi Manitol pada media MS (M), yang terdiri dari 3 taraf yaitu:
M1 : 1g/100ml
M2 : 3g/100ml
M3 : 5g/100ml
Faktor kedua dengan penambahan Asam Salisilat dengan konsentrasi asam
salisilat yang terdiri dari 3 taraf yaitu:
A1 : 35 ppm
A2 : 40 ppm
A3 : 45 ppm
Penelitian menggunakan 2 faktor. Faktor pertama terdiri 3 taraf dan faktor ke 2
terdiri 3 taraf perlakuan. Sehingga kombinasi perlakuan dapat dihitung dengan cara
faktor 1 dipangkatkan dengan faktor 2, yaitu 32 = atau 3 x 3 = 9.
Sehingga dari faktor tersebut diperoleh 9 kombinasi perlakuan sebagai berikut:
M1A1 M1A2 M1A3
M2A1 M2A2 M2A3
M3A1 M3A2 M3A3
Masing-masing perlakuan di ulang sebanyak 5 kali. Jumlah unit perlakuan
dapat diperoleh dengan cara jumlah kombinasi perlakuan dikalikan banyak ulangan
per faktor, yaitu 9 x 5 = 45. Setiap 1 kombinasi perlakuan membutuhkan stek mikro
1-2 internodus yang ditanam sebanyak 2 eksplan dalam setiap botol. Total nodus
yang dibutuhkan dapat diketahui dengan cara jumlah kombinasi x ulangan x

14
kebutuhan nodus/ stek mikro eksplan kentang setiap 1 kombinasi, yaitu 9 x 5 x 4 =
180 nodus atau 90 stek mikro eksplan kentang.

3.4 Analisis Data Penelitian

Analisis data pengamtan yang digunakan adalah analisa ragam berdasarkan
model linier, yaitu:
Model matematis yang digunakan dalam analisa data penelitian ini yaitu:
Yijk = µ + α1 + βj + (αβ)ij + εijk
Dimana :
Yijk : Hasil pengamatan dari satuan percobaan pemberian Manitol taraf ke-I,
konsentrasi Asam Salisilat taraf ke-j dan ulangan taraf ke-k.
µ : Nilai tengah populasi
α : Pengaruh pemberian Manitol taraf ke-i
βj : Pengaruh pemberian Asam Salisilat taraf ke-j
(αβ)ijk : Pengaruh interaksi Manitol taraf ke-i dan Asam Salisilat taraf ke-j
εijk : Pengaruh galat dari suatu percobaan yang diberikan Manitol ke-i, Asam
Salisilat taraf ke-j, dan ulangan taraf ke-k
Untuk mengetahui pengaruh perlakuan terhadap parameter yang diamati maka
diakhir penelitian disusun Daftar Sidik Ragam (DSR). Terhadap perlakuan yang
berpengaruh nyata dilakukan Uji Duncan’s Multiple Range Test (DMRT) dengan
taraf eror 5%

3.5 Prosedur Penelitian

3.5.1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Melakukan Sterilisai yang dilakukan untuk pemusnahan atau eliminasi semua
mikroorganisme. Pembersihan dilakukan dengan mencuci botol kultur menggunakan
deterjen sampai bersih kemudian tiriskan sampai kering. Kemudian alat-alat yang
akan digunakan penelitian disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 60
menit, sedangkan bahan bahan penelitian disterilkan dengan autoklaf pada suhu

14
121°C selama 20 menit. Alat dan bahan dapat dikeluarkan dari autoklaf jika suhu
sudah turun hingga 60°C. Kemudian bisa dikeluarkan ketika akan digunakan.

3.5.2 Pembuatan dan Sterilisasi Media

Media dasar yang digunakan adalah media MS dengan penambahan manitol dan
asam salisilat dengan konsentrasi yang berbeda. Tahap pembuatan media perlakuan
adalah sebagai berikut:
a. Menyiapkan alat dan bahan yang dibutuhkan
b. Mengambil masing-masing larutan stok MS sesuai volume yang telah
ditentukan dan memasukkannya ke dalam 9 gelas ukur (Lampiran 1.)
c. Menambahkan manitol dan asam salisilat ke dalam masing masing gelas
ukur sesuai dengan tabel dibawah ini
Table 3.1 kombinasi manitol dan asam salisilat
Perlakuan Manitol Asam salisilat
M1A1 1g/100ml 35ppm
M1A2 1g/100ml 40ppm
M1A3 1g/100ml 45ppm
M2A1 3g/100ml 35ppm
M2A2 3g/100ml 40ppm
M2A3 3g/100ml 45ppm
M3A1 5g/100ml 35ppm
M3A2 5g/100ml 40ppm
M3A3 5g/100ml 45ppm

d. Menambahkan aquadest sampai 125ml pada masing masing gelas ukur

e. Menambahkan gula 3,75g/125ml untuk setiap gelas ukur

f. Mengatur pH dengan kisaran 5,6-5,8 dengan menambahkan beberapa tetes

NaOH untuk menaikkan pH atau HCl untuk menurunkan pH. Ketika

14
 pengukuran pH, larutan media diaduk dengan magnetik stirrer

g. Menambahkan agar agar 1g/125ml

h. Menuang media kedalam botol kultur yang telah disterilkan dan tutup
menggunakan alumunium foil
i. Memasukkan media ke dalam autoklaf untuk proses sterilisasi pada suhu
121°C dengan tekanan 17,5 psi selama 20 menit.
j. Menyimpan media pada rak penyimpanan media untuk mengantisipasi ada
tidaknya kontaminasi pada media sehingga dapat dicegah penggunaan
media yang telah terkontaminasi pada saat penanaman.

3.5.3 Penanaman Eksplan

Eksplan yang digunakan merupakan eksplan steril dari hasil subkultur stek
mikro. Proses penanaman dilakukan di Laminar Air Flow dengan kondisi aseptik.
Alat-alat inokulasi ditata didalam Laminar Air Flow. Setiap alat tersebut dicelupkan
ke dalam alkohol 70% dan dipanaskan di atas nyala api bunsen selama 1-2 menit.
Eksplan steril dikeluarkan dari botol dan diletakkan pada cawan petri steril yang telah
dilapisi kertas tissue/kertas serap steril. Kemudian eksplan dipotong-potong di atas
petridish dengan 1-2 nodus. Eksplan tersebut kemudian diinokulasikan ke dalam
botol kultur yang telah berisi media MS modifikasi dengan posisi vertikal (tegak
lurus) dan bagian batang bawah menempel pada permukaan medium.
Setiap botol kultur berisi 3 eksplan steril. Botol ditutup rapat dan diberi label
yaitu tanggal dilakukan inokulasi eksplan dan perlakuan yang digunakan. Kemudian
ditata rapi dalam rak kultur.

3.6 Parameter Pengamatan

3.6.1 Fase Vegetatif
a. Jumlah Ruas

14
 Jumlah ruas dihitung mulai 1 MST s/d 4 MST dengan menghitung jumlah ruas
yang terbentuk di setiap planlet dan di rata rata
b. Jumlah Akar
Akar disetiap planlet yang tumbuh di setiap botol,di jumlah dan dirata
rata,penghitungan dimulai sejak 1 MST s/d 4 MST
3.6.2 Fase Generatif
a. Jumlah Umbi
jumlah umbi dihitung mulai 5 MST s/d 12 MST dengan menghitung jumlah
umbi setiap planlet dan dirata rata

14