BAB 4

METODE PENELITIAN

4.1 Jenis Penelitian

Jenis penelitian yang digunakan adalah penelitian true experimental karena peneliti dapat

mengontrol munculnya semua variabel luar yang dapat mempengaruhi proses dan hasil

penelitian (Sudibyo, 2013). Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan hewan coba tikus

Wistar (Rattus novergicus).

4.2 Rancangan Penelitian

Rancangan ini menggunakan rancangan penelitian the post test only group design.

Rancangan penelitian tersebut dapat digambarkan sebagai berikut:

P0
K0 O0

P1
K1 O1
P-R-S
P2
K2 O2

P3
K3 O3

P4
K4 O4

P5
K5 O5

Keterangan:
P : Populasi
R : Random
S : Sampling
K0 : Kelompok kontrol
K1 : Kelompok 1
K2 : Kelompok 2
K3 : Kelompok 3
K4 : Kelompok 4
K5 : Kelompok 5
P0 : Tanpa perlakuan (CMC-Na)
P1 : Perlakuan 1 (CMC-Na dan streptozotocin 65 mg/kgBB)
P2 : Perlakuan 2 (CMC-Na, streptozotocin 65 mg/kgBB, bakteri P.g 2 ml)
P3 : Perlakuan 3 (streptozotocin 65 mg/kgBB, bakteri P.g 2 ml dan ekstrak Stichopus
hermanii 0,09 mg/grBB)
P4 : Perlakuan 4 (CMC-Na, streptozotocin 65 mg/kgBB, bakteri P.g 2 ml dan terapi oksigen
hiperbarik 100% tekanan 2,4 ATA)
P5 : Perlakuan 5 (streptozotocin 65 mg/kgBB, bakteri P.g 2 ml, terapi Stichopus hermanii
0,09 mg/grBB, dan terapi oksigen hiperbarik 100% tekanan 2,4 ATA)
O0 : Kadar gula darah pada kelompok kontrol
O1 : Kadar gula darah pada kelompok 1
O2 : Kadar gula darah pada kelompok 2
O3 : Kadar gula darah pada kelompok 3
O4 : Kadar gula darah pada kelompok 4
O5 : Kadar gula darah pada kelompok 5

4.3 Unit Eksperimen dan Replikasi

4.3.1 Unit Eksperimen

Unit eksperimen pada penelitian ini menggunakan Rattus Norvegicus Strain Wistar yang

memiliki kriteria sebagai berikut:

1. Jenis hewan coba adalah tikus Rattus Norvegicus Strain Wistar, jenis kelamin jantan

dengan berat badan 150-200 gram dan umur 3-4 bulan.

2. Kesehatan fisik ditandai dengan bermata jernih, bulu yang mengkilap, memiliki gerak

aktif/lincah, serta faecesnya baik dan tidak lembek.

3. Faktor lingkungan laboratorium untuk pemeriksaan adalah faktor yang mempengaruhi

keadaan lingkungan laboratorium untuk pemeriksaan tikus yang diberi penyinaran cukup

dan sirkulasi udara keluar dan masuk yang bebas. Makanan dan minuman diberikan pada

tikus Wistar dalam bentuk pelet dan aquadest.

4.3.2 Replikasi

Besar minimal sampel ditentukan berdasarkan penelitian pendahuluan. Simpangan baku

gabungan menurut Dahlan (2010):

2
2 [S ¿¿ x x ( n x −1 ) + S y x (n y −1)]
2

(Sg) = ¿
n x +n y −2

Keterangan:

Sg : simpang baku gabungan

(Sg)2 : varian gabungan
sx : simpang baku kelompok x pada penelitian pendahuluan
nx : besar sampel kelompok x pada penelitian pendahuluan
sy : simpang baku kelompok x pada penelitian pendahuluan
ny : besar sampek kelompok y pada penelitian pendahuluan

Untuk penelitian eksperimental dengan rancangan acak lengkap, acak kelompok, atau

faktorial secara sederhana dapat dirumuskan (Dahlan, 2010) :

[ ]
2
( Zα +Zβ ) Sc
n=2
Xt −Xc

Keterangan :
n : Besar Sampel
Zα : Deviat baku alfa
Zβ : Deviat baku beta
Sc : Standar deviasi kelompok kontrol
Xt : Rerata kelompok perlakuan yang bermakna
Xc : Rerata kelompok kontrol
 Kemungkinan hewan coba mati (f) kurang dari 10%, sehingga besar sampel

dikalikan dengan 1/1-f (Dahlan, 2010):

( 1)
n=[r ]
1−f

Keterangan:
n : Banyaknya sampel
r : Replikasi
f : Kemungkinan hewan coba mati (10%)

Maka besar sampel yang mewakili adalah 4 sampel/kelompok perlakuan.

(Lampiran 2)

4.3.3 Teknik Pembagian Kelompok

Pemilihan sampel menggunakan simple random sampling karena pengambilan sampel

anggota populasi dilakukan secara acak tanpa memperhatikan strata yang ada di dalam populasi

tersebut. Teknik ini dapat dilakukan dalam penelitian bila anggota populasi dianggap homogen

(Sudibyo, 2013).

4.4 Variabel Penelitian: Klasifikasi Variabel dan Definisi Operasional Variabel

4.4.1 Klasifikasi Variabel Penelitian

1. Variable bebas (independent)
a. Bubuk teripang emas (Stichopus hermanii)
b. Oksigen hiperbarik

2. Variable tergantung (dependent)

a. Kadar gula darah pada tikus Wistar

3. Variabel terkendali

a. Teknik induksi Streptozotocin (untuk kondisi diabetes mellitus)

 b. Dosis streptozotocin

c. Frekuensi induksi streptozotocin

d. Premedikasi Rongga Mulut

e. Teknik Induksi bakteri Porphyromonas gingivalis

f. Konsentrasi Porphyromonas gingivalis

g. Frekuensi induksi Porphyromonas gingivalis

h. Teknik pemberian bubuk teripang emas (Stichopus hermanii)

i. Dosis bubuk teripang emas (Stichopus hermanii)

j. Lama pemberian bubuk teripang emas (Stichopus hermanii)

k. Teknik terapi oksigen hiperbarik

l. Lama pemberian terapi oksigen hiperbarik

4.4.2 Definisi Operasional Variabel

Variabel yang digunakan pada penelitian dapat didefinisikan sebagai berikut:

1. Bubuk teripang emas (Stichopus hermanii) adalah teripang emas dari pulau Madura

(Sumenep) yang dikeringkan dengan metode freeze dry dan diblender kemudian dibuat

bubuk. Bubuk teripang emas dibuat menjadi dosis 0,09 mg/grBB dengan menggunakan

larutan pengencer CMC-NA.

2. Oksigen hiperbarik adalah ruang udara bertekanan tinggi berisi oksigen 100% dengan

tekanan 2,4 ATA (Harnanik, 2008).

3. Kadar gula darah adalah kadar gula darah pada pembuluh darah vena tikus Wistar yang

diukur dengan alat glucometer “On Call® EZ II” Blood Glucose Monitoring System

dalam satuan mg/dL melalui metode biosensor.

4. Teknik induksi streptozotocin adalah teknik pemberian streptozotocin pada tikus Wistar

secara intravena dengan dosis sebanyak 65 mg/kgBB yang sebelumnya diberikan

nicotinamide (NAD) sebagai premedikasi sekitar 230 mg/kgBB yang dilarutkan dalam

cairan phosphate buffered saline (PBS) (Srinivasan & Ramarao, 2007).

5. Dosis streptozotocin adalah dosis sebesar 65 mg/kgBB pada tikus putih jantan yang

sudah dipuasakan semalam antara 8-12 jam.

6. Frekuensi induksi streptozotocin adalah selama 4 hari berturut-turut, selanjutnya tikus

diinkubasi selama 7 hari. Tikus dinyatakan DM jika kadar gula darah >220 mg/dL.

7. Premedikasi rongga mulut adalah tindakan yang dilakukan untuk pengkondisian flora

normal yang sama pada rongga mulut tikus Wistar dengan memberikan kanamycin (20

mg) ampicilyn (20 mg) dan chlorhexidine glukonat kumur 0,12% untuk menekan

mikrobiota mulut asli.

8. Teknik induksi bakteri Porphyromonas gingivalis adalah induksi periodontitis dengan

menggunakan Porphyromonas gingivalis dengan nomor ATCC (American Type Culture

Cell) 33277 sebanyak 2 ml dari 1 x 109 sel/ml bakteri. Teknik induksi P. gingivalis

dilakukan secara peroral, topikal dan anal pada tikus Wistar.

9. Konsentrasi Porphyromonas gingivalis adalah 1 x 109 sel/ml bakteri yang dilarutkan

dalam PBS (Praptiwi, 2008).

10. Frekuensi induksi Porphyromonas gingivalis adalah sebanyak 3 kali dalam 4 hari.

Setelah 3 minggu terhitung dari pemberian pertama hasil pemeriksaan Patologi Anatomi

menunjukkan tanda-tanda periodontitis (Praptiwi, 2008).

 11. Teknik pemberian bubuk teripang emas (Stichopus hermanii) diberikan secara sistemik

(per sonde) dengan menggunakan syringe yang dimasukkan ke dalam mulut hingga

lambung tikus Wistar (Sari dan Revianti, 2011).

12. Dosis bubuk teripang emas (Stichopus hermanii) adalah banyaknya bubuk teripang emas

yang diberikan pada tikus Wistar dengan dosis 0,09 mg/grBB (Lampiran 3).

13. Lama pemberian ekstrak teripang emas (Stichopus hermanii) pada tikus Wistar adalah 2

kali sehari selama 7 hari.

14. Teknik terapi oksigen hiperbarik adalah pemberian oksigen 100% 2,4 ATA 3x30 menit

sehari dengan jeda 5 menit selama 5 hari berturut-turut pada chamber hewan coba

(Harnanik, 2008).

15. Lama pemberian terapi oksigen hiperbarik pada tikus Wistar adalah selama 5 hari

berturut-turut, 3x30 menit sehari.

4.5 Alat dan Bahan Penelitian

4.5.1 Alat yang Digunakan

Alat yang digunakan pada penelitian ini, meliputi:

1. Alat yang digunakan untuk menimbang berat badan hewan coba adalah timbangan berat

badan.

2. Alat yang digunakan untuk perawatan dan pemeliharaan hewan coba adalah kandang,

tempat makanan dan minuman tikus.

3. Alat yang digunakan untuk induksi streptozotocin adalah spuit insulin 1 mL.

4. Alat yang digunakan untuk obat premedikasi adalah spuit 5 cc.

5. Alat untuk induksi bakteri Porphyromonas gingivalis adalah spuit berkanula, spuit 3 cc

dan cotton bud.

6. Alat yang digunakan untuk membuat ekstrak teripang emas (Stichopus hermanii) adalah

freezy dryer, laboratory blender, syringe, timbangan, gelas ukur, kertas saring, labu

erlenmeyer, spatula.

7. Alat yang digunakan untuk pemberian ekstrak teripang emas (Stichopus hermanii) adalah

feeding tube.

8. Alat yang digunakan untuk pengambilan sampel pembuluh darah vena tikus Wistar untuk

melihat kadar gula darah adalah gunting bedah.

9. Alat yang digunakan untuk pemeriksaan kadar gula darah adalah glucometer “On

Call® EZ II” dan strip glucometer “On Call® Plus”.

4.5.2 Bahan yang Digunakan

Bahan yang digunakan pada penelitian ini, meliputi:

1. Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rattus Norvegicus Strain

Wistar.

2. Streptozotozin untuk menjadikan tikus dalam kondisi diabetes mellitus.

3. Nicotinamide (NAD) 230mg/kg BB untuk premedikasi tikus diabetes mellitus agar gula

darah tetap stabil.

4. Bahan untuk menjadikan tikus periodontitis adalah bakteri Porphyromonas gingivalis

ATCC 33277.
5. Kanamisin 20 mg, ampisilin 20 mg berupa sirup kering 125 mg/5ml dan chlorhexidin

glukonaten 0,12% untuk premedikasi tikus yang diinduksi bakteri P. gingivalis agar

pertumbuhan bakteri tetap stabil.

6. Bahan yang digunakan untuk membuat bubuk teripang emas (Stichopus hermanii) adalah

aquadest, bahan pelarut adalah PBS, CMC-NA.

7. Bahan yang digunakan untuk mengukur kadar gula darah tikus Wistar adalah sampel

darah yang diambil dari vena ekor tikus Wistar.

8. Air PDAM biasa yang digunakan untuk minuman tikus Wistar.

4.6 Lokasi dan Waktu Penelitian

4.6.1 Lokasi Penelitian

Lokasi penelitian dilakukan di beberapa tempat, meliputi:

1. Penelitian pemberian streptozotocin dan bakteri Porphyromonas gingivalis pada tikus

Wistar dilakukan di Laboratorium Ilmu Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas

Airlangga.

2. Pemeriksaan kadar gula darah dilakukan di Laboratorium Ilmu Biokimia Fakultas

Kedokteran Universitas Airlangga.

3. Ekstraksi teripang emas (Stichopus hermanii) dilakukan di Laboratorium Teknologi dan

Bahan Alam Fakultas Farmasi Widya Mandala.

4. Pemberian terapi oksigen hiperbarik dilakukan di LAKESLA RSAL Surabaya.

4.6.2 Waktu Penelitian

 Penelitian ini dimulai pada bulan Maret 2015 sampai Desember 2015 (Lampiran 1).

4.7 Cara Kerja dan Prosedur Pengambilan Data

4.7.1 Cara Kerja

1. Persiapan hewan coba

a. Penimbangan dan pencatatan pada hewan coba

b. Prosedur adaptasi dan pemeliharaan hewan coba

Sebelum perlakuan, tikus Wistar diadaptasi (aklimatisasi) pada laboratorium percobaan

dengan kandang yang cukup udara dan cahaya. Aklimatisasi pada hewan coba dilakukan

selama 7 hari. Tikus Wistar diberi makanan dan minuman setiap hari dengan pakan

ternak standar untuk tikus Wistar dan minum dengan air aquadest yang diberikan secara

ad libitum melalui oral.

c. Pembagian kelompok hewan coba

6 kelompok dari tikus Wistar mendapatkan pembagian kelompok sebagai berikut:

1. Kelompok 0 : kelompok kontrol tanpa terapi diberi CMC-Na.

2. Kelompok 1 : kelompok perlakuan 1 (diinduksi streptozotozin tanpa terapi)

diberi CMC-Na.

3. Kelompok 2 : kelompok perlakuan 2 (diinduksi streptozotozin dan bakteri P.

gingivalis tanpa terapi) diberi CMC-Na.

4. Kelompok 3 : kelompok perlakuan 3 (diinduksi streptozotozin dan bakteri P.

gingivalis dengan terapi bubuk Stichopus hermanii 0,09 mg/grBB)

 5. Kelompok 4 : kelompok perlakuan 4 (diinduksi streptozotozin dan bakteri P.

gingivalis dengan terapi oksigen hiperbarik) diberi CMC-Na

6. Kelompok 6 : kelompok perlakuan 5 (diinduksi streptozotozin dan bakteri P.

gingivalis dengan terapi bubuk Stichopus hermanii 0,09 mg/grBB dan oksigen

hiperbarik)

2. Pembuatan Bubuk Teripang Emas (Stichopus hermanii)

Teripang emas yang telah dibeli dari pulau Madura (Sumenep) dalam kondisi basah

dikeluarkan isi perutnya hingga bersih dan dicuci dibawah air mengalir sehingga yang digunakan

adalah bodywall (dinding tubuh) dari teripang emas, kemudian dipotong kecil-kecil dimasukkan

ke dalam kantong plastik dan ditimbang berat basahnya. Selanjutnya diblender dengan

menggunakan laboratory blender hingga menjadi halus dan dimasukkan ke dalam labu

Erlenmeyer dengan spatula dan dilakukan pengeringan dengan freeze dryer (Winarni et al.,

2013) pada suhu 2 - 8ºC dengan tekanan 5 m Torr.

Teripang emas yang telah kering kemudian ditimbang dan diblender kembali dengan

menggunakan laboratory blender hingga menjadi bubuk. Pembuatan bubuk teripang emas

(Stichopus hermanii) dengan menggunakan CMC-NA sebagai pelarut.

3. Prosedur tikus diabetes

Hari ke 8 setelah adaptasi, dilakukan induksi streptozotocin (STZ) pada semua

kelompok kecuali kelompok 0 yang merupakan kelompok kontrol. Induksi DM pada tikus putih

jantan yang sudah dipuasakan semalam antara 8-12 jam. dilakukan dengan cara memberikan

nicotinamide (NAD) sekitar 230 mg/kg BB yang dilarutkan dalam cairan PBS selama 10 menit
kemudian diberikan streptozotocin (STZ) sebanyak 65 mg/kg BB pada tikus putih jantan yang

sudah dipuasakan selama 8-12 jam. Induksi pada tikus dilakukan selama 4 hari berturut-turut,

selanjutnya tikus diinkubasi selama 7 hari. Tikus dinyatakan DM jika kadar glukosa darah lebih

dari 220 mg/dL (Srinivasan K & Ramarao P, 2007).

4. Persiapan dan induksi bakteri

Sebelum dilakukan induksi bakteri P. gingivalis, semua tikus diberikan perlakuan

premedikasi rongga mulut untuk menekan mikrobiota mulut asli. Dalam masa inkubasi selama 7

hari, air minum tikus diberi kanamycin (20 mg) dan ampicilin (20 mg) setiap hari selama 4 hari,

dan rongga mulut tikus diusap dengan chlorhexidine glukonat kumur 0,12% sebagai antiseptik.

Teknik induksi bakteri Porphyromonas gingivalis adalah induksi periodontitis dengan

menggunakan Porphyromonas gingivalis dengan nomor ATCC (American Type Culture Cell)

33277. Inokulasi dilakukan dengan mencekokkan 2 ml dari 1 x 109 sel/ml bakteri hidup dalam

PBS ke dalam lambung menggunakan spuit berkanula. Selain itu, dengan cotton bud campuran

bakteri dioleskan di sepanjang tepi gingiva buko-palatal/lingual region molar atas dan bawah,

kiri dan kanan. Bakteri juga dimasukkan lewat anus ke daerah kolorektal dengan spuit berkanula

atau cotton bud. Frekuensi induksi Porphyromonas gingivalis adalah sebanyak 3 kali dalam 4

hari. Setelah 3 minggu terhitung dari pemberian pertama bakteri, hasil pemeriksaan Patologi

Anatomi menunjukkan tanda-tanda periodontitis (Praptiwi, 2008).

5. Perlakuan Terapi
 Setelah tikus pada kelompok perlakuan telah selesai diinduksi streptozotocin dan bakteri

P. gingivalis, kemudian diberikan terapi ekstrak teripang emas (Stichopus hermanii) dan terapi

HBO.

Teknik pemberian ekstrak teripang emas (Stichopus hermanii) diberikan secara sistemik

(per sonde) dengan menggunakan syringe yang dimasukkan ke dalam mulut hingga lambung

tikus wistar (Sari and Revianti., 2011) dengan dosis 0,09 mg/grBB selama 7 hari. Terapi HBO

adalah pemberian oksigen 100% 2.4 ATA 3 x 30 menit sehari dengan jeda 5 menit selama 5 hari

(Harnanik, 2008).

6. Pengukuran kadar glukosa darah

Masing-masing tikus pada semua kelompok diambil sampel darah dari vena ekor dengan

cara darah diambil melalui ujung ekor tikus kemudian ujung ekor dipotong kira-kira 5mm

menggunakan gunting bedah. Setelah dipotong, ekor diurut-urut sehingga darah keluar. Darah

yang keluar kemudian diteteskan pada strip glucometer “On Call® Plus” sebanyak ±1µl. Setelah

10 detik, kadar glukosa darah akan terbaca pada layar glukometer dan dinyatakan dalam satuan

mg/dL (Lampiran 4).

4.8 Alur Penelitian
Tikus wistar ditimbang

Tikus di aklitimasi 7 hari

Pembagian kelompok
(6 kelompok) Hari ke 8

K0 K1 K2 K3 K4 K5

Cek Gula Darah

Tanpa Diberi NAD Diberi NAD Diberi NAD Diberi NAD Diberi NAD
Perlakuan 230 mg/kg 230 mg/kg 230 mg/kg 230 mg/kg 230 mg/kg
BB dan Di BB dan Di BB dan Di BB dan Di BB dan Di
induksi STZ induksi STZ induksi STZ induksi STZ induksi STZ
65 mg/kgBB 65 mg/kgBB 65 mg/kgBB 65 mg/kgBB 65 mg/kgBB

Premedikasi Hari
Kanamycin 20mg, Ampicilyn 20mg, Chlorhexidine Glukonate 0,12% ke 11

Hari
Cek Gula Darah
ke 14

Induksi Induksi Induksi Induksi

Tanpa Tanpa Hari ke
bakteri PG bakteri PG bakteri PG bakteri PG
perlakuan perlakuan 15 - 36
1x109 sel/ml 1x109 sel/ml 1x109 sel/ml 1x109 sel/ml

Diberi Diberi Terapi Terapi

Diberi CMC-NA CMC-NA Bubuk Bubuk
CMC-NA 0,2% 0,2% Teripang Terapi Teripang Hari ke
0,2% secara secara Emas HBO 2,4 Emas dan 37 - 41
secara topikal topikal ATA Terapi
topikal HBO 2,4
ATA
 Seluruh tikus diambil sampel darah dari vena ekor tikus
Hari ke
42
4.9 Analisis DataPengukuran kadar glukosa darah dan Analisis Data

Data diperoleh dari kelompok kontrol dan kelompok perlakuan dianalisis menggunakan

statistik deskriptif untuk melihat rata-rata dan standar deviasi yang bertujuan untuk memperoleh

gambaran distribusi dan peringkasan data guna memperjelas penyajian hasil. Selanjutnya

dilakukan uji hipotesis dengan menggunakan uji statistik parametrik oleh karena skala data rasio.

Syarat uji statistik parametrik adalah uji normalitas dimana data harus normal dan uji

homogenitas dimana data harus homogen. Uji normalitas yang dilakukan yaitu uji Shapiro-Wilk

karena jumlah sampel kurang dari 50. Kemudian dilanjutkan dengan uji homogenitas dengan

menggunakan uji Levene statistic. Jadi, jika syarat ini terpenuhi, maka dilanjutkan uji one way

ANOVA karena kelompok sampel pada penelitian ini labih dari 2 dan tidak berpasangan. Jika

hasil one way ANOVA adalah p < 0.05, maka Ho ditolak dan dilanjutkan dengan uji LSD.

Sedangkan bila syarat uji statistik parametrik tidak terpenuhi, maka dilakukan uji non parametrik

menggunakan uji Kruskal-Wallis (Dahlan, 2010).