REDUKSI NITRAT DAN HIDROGEN PEROKSIDA

PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

DISUSUN OLEH :
WIDIA MANDALA/201810401044
KELAS B

LABORATORIUM EKOLOGI
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS JEMBER
2021
 I. PENDAHULUAN

Senyawa nitrogen dihasilkan dari transformasi nitrogen secara biologis

dan abiologis, secara biologis dihasilkan dari aktivitas makrobiologi dan
mikrobiologi. Senyawa nitrogen anorganik meliputi amonia, nitrit, dan nitrat
bersifat toksik bagi organisme akuatik bila ditemukan dalam jumlah yang tinggi
dalam perairan. Nitrifikasi merupakan proses oksidasi senyawa amonia yang
menghasilkan senyawa nitrit dan nitrat, seperti diketahui senyawa tersebut juga
berupa pencemar yang akan tetap berada di badan perairan Untuk dapat
menghilangkan senyawa nitrogen anorganik dapat memanfaatkan proses lainnya
yaitu denitrifikasi karena proses ini akan melepaskan senyawa-senyawa tersebut ke
udara bebas (Syahputra dkk, 2011).

Denitrifikasi merupakan proses reduksi nitrat, melalui senyawa

intermediat nitrit dan nitrik oksida, menjadi nitrous oksida atau gas dinitrogen.
Proses ini melepaskan senyawa nitrogen, di mana nitrat direduksi menjadi bentuk
gas yang dilepas ke atmosfir. Proses denitrifikasi menghasilkan gas nitrit oksida
(NO) dan nitrous oksida (N2O). Produk yang dihasilkan selama proses denitrifikasi
tersebut tergantung dari jenis bakteri yang didukung dengan kelengkapan enzim
selama aktivitasnya (Syahputra dkk, 2011).

Hidrogen peroksida (H2O2) merupakan suatu senyawa yang dihasilkan

dari proses respirasi aerob, dimana penerima elektron terakhirnya yaitu oksigen.
Bakteri pereduksi hidrogen peroksida (H2O2) dalam proses pereduksiannya dapat
menghasilkan air (H2O) dan oksigen (O2). Bakteri pereduksi hidrogen peroksida
(H2O2) memiliki enzim yang mampu mengkatalis reduksi H2O2 menjadi H2O dan
oksigen O2 yang disebut enzim katalase (Rahayu dkk, 2018). Tujuan dari praktikum
ini yaitu mengetahui karakteristik biokimia dari berbagai macam isolat bakteri
melalui kemampuan mereduksi nitrat dan hidrogen peroksida.
II. METODE
2.1 Alat
Alat yang digunakan dalam praktikum reduksi nitrat dan hidrogen peroksida
adalah sbb :
2.1.1 Kemampuan Reduksi Nitrat
- Mikrotip
- Mikropipet
- Ose bulat
- Lampu bunsen
- Tisu
2.1.2 Kemampuan Reduksi Hidrogen Peroksida
- Pipet tetes
- Ose bulat
- Bunsen
- Tisu
2.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam praktikum reduksi nitrat dan hidrogen
peroksida adalah sbb :
2.2.1 Kemampuan Reduksi Nitrat
- Biakan Streptococcus thermophilus
- Biakan Bacillus subtilis
- Biakan Escherichia coli
- Alkohol 70%
- Asam sulfanilic
- 𝛼-naphthylamine
- Media nitrat
2.2.2 Kemampuan Reduksi Hidrogen Peroksida
- Alkohol 70%
- H2O2 3%
- Media Na Miring
- Biakan Bacillus subtilis
 - Biakan Escherichia coli
- Biakan Staphylococcus aureus
2.3 Cara Kerja
Alat yang digunakan dalam praktikum reduksi nitrat dan hidrogen peroksida
adalah sbb :
2.3.1 Kemampuan Reduksi Nitrat
- Disterilkan tangan dan meja kerja dengan menggunakan alkohol
70% dan dilap dengan tisu
- Dinyalakan api bunsen
- Diambil jarum ose dan disterilkan dengan cara dibakar pada api
bunsen hingga merah menyala dan di kering anginkan
- Diambil biakan bakteri, dibuka penutupnya dan dipanaskan tabung
reaksi
- Diambil biakan satu ose dan dimasukkan ke media nitrat
- Diinkubasi pada inkubator dengan suhu 37°C selama 2 hari
- Setelah diinkubasi, ditambahkan asam sulfanilic sebanyak 1ml dan
𝛼-naphthylamine 1 ml
- Digodok dan diamati perubahan yang terjadi
2.3.2 Kemampuan Reduksi Hidrogen Peroksida
- Disterilkan tangan dan meja kerja dengan menggunakan alkohol
70% dan dilap dengan tisu
- Dinyalakan api bunsen
- Diambil jarum ose dan disterilkan dengan cara dibakar pada api
bunsen hingga merah menyala dan di kering anginkan
- Diambil biakan bakteri, dibuka penutupnya dan dipanaskan tabung
reaksi
- Diambil biakan satu ose dan digoreskan pada media
- Diinkubasi pada inkubator dengan suhu 37°C selama 2 hari
- Setelah diinkubasi ditetesi biakan dengan H2O2 3% sebanyak 3-5
tetes
- Diamati perubahan yang terjadi
 III. HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 Hasil
Hasil yang diperoleh dari praktikum ini yaitu :
Tabel 3.1 Hasil Praktikum Kemampuan Reduksi Nitrat
Hasil Praktikum
Isolat Kemampuan Reduksi Hasil Literatur
Gambar
Nitrat

Escherichia coli +

(Syahputra dkk,
2011)

Bacillus subtilis +

(Hastuti, 2011)

Streptococcus
-
thermophilus
 (Syahputra dkk,
2011)

Tabel 3.1 Hasil Praktikum Kemampuan Reduksi Hidrogen Peroksida

Hasil Praktikum
Isolat Kemampuan Reduksi Hasil Literatur
Gambar
Hidrogen Peroksida

Escherichia coli +

(Yulitaasry dkk,
2017)

Bacillus subtilis +

(Karimela dkk,
2018)

Staphylococcus
-
aureus

(Karimela dkk,
2018)
 3.2 Pembahasan

Nitrifikasi merupakan proses oksidasi senyawa amonia yang

menghasilkan senyawa nitrit dan nitrat. Untuk dapat menghilangkan senyawa
nitrogen anorganik dari dapat memanfaatkan proses lainnya yaitu denitrifikasi
karena proses ini akan melepaskan senyawa-senyawa tersebut ke udara bebas
(Syahputra dkk, 2011). Denitrifikasi merupakan proses reduksi nitrat, melalui
senyawa intermediat nitrit dan nitrik oksida, menjadi nitrous oksida atau gas
dinitrogen. Proses ini melepaskan senyawa nitrogen pada lingkungan, di mana
nitrat direduksi menjadi bentuk gas yang dilepas ke atmosfir. Produk yang
dihasilkan selama proses denitrifikasi tersebut tergantung dari jenis bakteri yang
didukung dengan kelengkapan enzim selama aktivitasnya. Proses denitrifikasi
bakteri menggunakan senyawa nitrat sebagai penerima elektron terakhir untuk
memperoleh energi pada kondisi oksigen rendah atau anaerob (Hastuti, 2011).

Menurut Triyanto dkk (2018) karakteristik dari bakteri pereduksi nitrat

menujukikan bakteri tersebut termasuk gram positif dengan bentuk koloni
bervariasi (circulair, irregular dan curled), sedangkan warna koloni krem, putih
keruh dan coklat kemerahan. Bentuk sel bervariasi antara batang panjang dan
batang pendek. Bakteri denitrifikasi adalah kelompok bakteri yang memiliki
kemampuan untuk melakukan reaksi reduksi senyawa nitrat (NO3-) menjadi
senyawa nitrogen bebas (N2). Pada beberapa kelompok bakeri denitrifikasi, dapat
ditemukan senyawa nitrogen oksida (NO) sebagai hasil sampingan metabolisme.
Proses ini pada umumnya berlangsung secara anaerobik (tanpa melibatkan molekul
oksigen, O2). Bakteri yang benar-benar bakteri pendenitrifikasi mampu mereduksi
lebih dari 90% nitrat menjadi N2. Pada kondisi anaerob, bakteri denitrifikasi
menggunakan nitrat sebagai akseptor elektron terakhir untuk menjalankan respirasi,
sehingga nitrat akan tereduksi lebih banyak dibandingkan pada kondisi mikroaerob
atau aerob. Pada kondisi aerob, oksigen digunakan sebagai akseptor elektron
terakhir sehingga nitrat yang ada tidak direduksi dalam jumlah yang banyak. Reaksi
yang diperoleh dalam proses ini yaitu sbb :
 - Reduksi Parsial

NO3- + 2H+ + 2e- Reduksi nitrat

NO2- + H2O

- Reduksi sempurna
2NO3- + 12H+ + 10e- Reduksi nitrat
O2 + 6H2O

Kemampuan isolat bakteri dalam mereduksi nitrat dilakukan dengan

menggunakan media nitrat. Setelah dilakukan proses inkubasi yaitu pada suhu 37°C
yang merupakan suhu optimal dan selama 2 hari kemudia bakteri ditetesi
menggunakan reagen yaitu asam sulfanilat dan larutan 𝛼-naphtylamine sebanyak 1
ml dalam kultur cair tersebut. Dimana dengan menambahkan 2 reagen tersebut akan
menghasilkan Sulfobenzene azo 𝛼-naphthylamine yang menyebabkan warna
merah. Sehingga apabila bakteri dapat mereduksi nitrat menjadi nitrit dapat ditandai
dengan perubahan warna menjadi merah (Sine dan Fallo, 2017). Pada hasil yang
diperoleh, bakteri Escherichia coli dan Bacillus subtilis berubah menjadi merah,
sehingga dapat disimpulkan dapat mereduksi nitrat. Sedangkan pada bakteri
Streptococcus thermophilus tidak menunjukkan perubahan, sehingga dapat
disimpulkan Streptococcus thermophilus tidakdapat mereduksi nitrat.

Hidrogen peroksida (H2O2) merupakan suatu senyawa yang dihasilkan

dari proses respirasi aerob, dimana penerima elektron terakhirnya yaitu oksigen.
Bakteri pereduksi hidrogen peroksida (H2O2) dalam proses pereduksiannya dapat
menghasilkan air (H2O) dan oksigen (O2). Bakteri pereduksi hidrogen peroksida
(H2O2) memiliki enzim yang mampu mengkatalis reduksi H2O2 menjadi H2O dan
oksigen O2 yang disebut enzim katalase (Rahayu dkk, 2018).

Enzim katalase adalah molekul yang terbentuk dari protein yang fungsi
utamanya sebagai katalisator. Katalisator adalah proses untuk mempercepat reaksi
dalam berbagai proses kimia di dalam tubuh. Enzim katalase merupakan
antioksidan endogen berjenis enzim yang bereaksi dengan molekul H2O2. Ketika
keduanya membentuk kompleks substrat-enzim, maka reaksi osidasi akan terjadi
sehingga H2O2 diuraikan menjadi O2 dan H2O (Lestari dkk, 2014). Katalase
digunakan oleh mikroorganisme untuk menguraikan H2O (hidrogen peroksida)
menjadi O2 (oksigen) (Palealu dkk, 2017) . Uji katalase positif ditandai dengan
terbentuknya gelembung oksigen. Isolat bakteri yang dapat membentuk gelembung
oksigen pada saat ditetesi hydrogen peroksida (H2O2) 3% menunjukan jika isolat
tersebut mampu menghasilkan enzim katalase (Yulitaasry dkk, 2017).

Berdasarkan hasil dari reduksi H2O2 diperoleh hasil bahwa pada biakan
bakteri Bacillus subtilis dan biakan Escherichia coli positif. Indikator yang terjadi
saat terdapar pereduksian H2O2 yaitu dengan munculnya gelembung-gelembung
udara saat isolat dicampurkan ke dalam zat H2O2. Hal ini merupakan indikasi
terjadinya pemecahan H2O2 menjadi molekul air dan oksigen yang diperantarai oleh
enzim katalase. Berikut adalah reaksi pemecahan H2O2 yang terjadi (Sine dan Fallo,
2017) :

2 H2O2 2 H2O + O
Enzim Katalase

Sedangkan pada bakteri Staphylococcus aureus tidak terdapat indikasi munculnya

gelembung-gelembung udara. Dengan pernyataan tersebut maka dapat dinyatakan
bahwa Staphylococcus aureus tidak dapat mereduksi H2O2.

Hasil yang diperoleh dari praktikum kemampuan reduksi nitrat sesuai

dengan literatur yang ada. Pada isolat bakteri Escherichia coli dan Bacillus subtilis
berubah menjadi merah, sehingga dapat disimpulkan dapat mereduksi nitrat.
Sedangkan pada bakteri Streptococcus thermophilus tidak menunjukkan
perubahan, sehingga dapat disimpulkan Streptococcus thermophilus tidak dapat
mereduksi nitrat. Sedangkan pada praktikum kemampuan reduksi hidrogen
perksida hasil yang diperoleh sesuai dengan literatur. Pada isolat bakteri Bacillus
subtilis dan biakan Escherichia coli dapat diamati indikator yang berupa
gelembung, sehingga menunjukkan bahwa isolat tersebut mampu mereduksi
hidrogen peroksida. Pada isolat bakteri Staphylococcus aureus tidak terdapat
indikasi munculnya gelembung-gelembung udara, sehingga disimpulkan isolat
tersebut tidak mampu mereduksi hidrogen peroksida (Yulitaasry dkk, 2017).
 IV. KESIMPULAN

Kesimpulan yang diperoleh dari praktikum reduksi nitrat dan hidrogen

peroksida adalah nitrifikasi merupakan proses oksidasi senyawa amonia yang
menghasilkan senyawa nitrit dan nitrat. Proses denitrifikasi bakteri menggunakan
senyawa nitrat sebagai penerima elektron terakhir untuk memperoleh energi pada
kondisi oksigen rendah atau anaerob. Proses reduksi nitrat menggunakan 2 reagen
yaitu asam sulfanilat dan larutan 𝛼-naphtylamine, dimana dengan menambahkan 2
reagen tersebut akan menghasilkan Sulfobenzene azo 𝛼-naphthylamine yang
menyebabkan warna merah. Hasil yang diperoleh berupa bakteri Escherichia coli
dan Bacillus subtilis dapat mereduksi nitrat. Sedangkan pada bakteri Streptococcus
thermophilus tidak dapat mereduksi nitrat. Hidrogen peroksida (H2O2) merupakan
suatu senyawa yang dihasilkan dari proses respirasi aerob, dimana penerima
elektron terakhirnya yaitu oksigen. Indikator yang diperoleh saat terjadi reduksi
H2O2 yaitu terdapat gemebung udara. Hasil yang diperoleh yaitu bakteri Bacillus
subtilis dan biakan Escherichia coli positif, sedangkan pada bakteri Staphylococcus
aureus negatif.
 DAFTAR PUSTAKA

Hastuti, Y. P. 2011. Nitrifikasi dan denitrifikasi di tambak. Jurnal Akuakultur

Indonesia. 10 (1): 89-98.

Karimela, E. J., F. G. Ijong., J. F. Palewe., dan J. A. andeno. 2018. Isolasi Dan

Identifikasi Bakteri Staphylococcus Epidermis Pada Ikan Asap
Pinekuhe. Jurnal Teknologi Perikanan dan Kelautan. 9(1):35-42.

Lestari, A.P., T. Murtiati., dan R. Puspitaningrum. 2014. Pengaruh Paparan Hipoksia

terhadap Aktivitas Antioksidan Katalase danKadar Malondialdehid
(MDA) pada Jaringan Hati Tikus. BIOMA. 10(2):27-33.

Pelealu, J. B., R. R. Butarbutar., dan T. E. Tallei. 2017. Isolasi dan Identifikasi

Bakteri Rizosfir Arachis pintoi setelah Inokulasi Mikoriza Arbuskular
dan Penambahan Pupuk Organik. Jurnal Bioslogos. 7 (2):37-45.

Rahayu, S., Rahmawati., dan R. Kurniatuhadi. 2018. Deteksi Bakteri Selulolitik pada
Kotoran Luwak (Paradoxurus hermaphroditus) dari Kebun Binatang
Bandung. Jurnal Protobiont. 7(2): 19-28.

Sine, Y. dan G. Fallo. 2017. Isolasi Bakteri Asam Laktat Pada Perendaman Biji Gude
(Cajanus cajan(L) Millsp.). Portal Jurnal Unimor. 21(1):8-10.

Syahputra, K., I. Rusmana., dan U. Widyastuti. 2011. Isolasi Dan Karakterisasi

Bakteri Denitrifikasi Sebagai Agen Bioremediasi Nitrogen
Anorganik. Jurnal Ris Akuakultur. 6(2): 197-209.

Triyanto., A. Isnansetyo., I. D. Prijamda., J. Widada., dan D. D. Kembaren. 2018.

Isolasi Dan Karakterisasi Bakteri Pendenitrifikasi Yang Diisolasi Dari
Lumpur Kawasan Mangrove. Jurnal Perikanan. 10(1):1-10.

Yulitaasry, A. T., I. N. Asyiah., dan M. Iqbal. 2017. Isolasi Dan Identifikasi

Azotobacter Dari Rhizosfer Tanaman Kopi (Coffea canephora) Yang
Terserang Nematoda Parasit Pratylenchus coffeae. Saintifika.
19(2):13-23.