Mekanisme Molekuler Induksi

Tumor Crown Gall oleh

Agrobacterium tumefaciens
 I. PENDAHULUAN UMUM
TIK:
Mahasiswa memahami sifat-sifat Agrobacterium
tumefaciens.
Mahasiswa memahami penyakit Crown Gall pada
tanaman yang diinduksi oleh Agrobacterium
tumefaciens.
Mahasiswa memahami proses-proses yang terlibat
dalam induksi tumor Crown Gall.

Waktu : 2 x 50 menit
Sub Pokok Bahasan :

1.1 Pendahuluan
1.1.1 Penyakit Crown Gall
1.1.2 Sifat-sifat Agrobacterium tumefaciens
1.1.3 Induksi Crown Gall oleh Agrobacterium

1.2 Proses-proses yang Terlibat dalam Induksi Tumor

Crown Gall
1.2.1 Penempelan Agrobacterium pada Sel Tanaman
1.2.2 Induksi Gen-vir
1.2.3 Proses dan Transfer T-DNA
1.2.4 Penggabungan T-Strand ke dalam Genom Tanaman
1.1 PENDAHULUAN

1.1.1 Penyakit Crown Gall

Tumor Crown Gall adalah jaringan tanaman yang

pertumbuhannya tidak terdiferensiasi akibat adanya
interaksi antara tanaman-tanaman yang rentan dengan
strain virulen Agrobacterium tumefaciens (Gb. 1).
 Karakterisasi molekuler dari induksi Crown gall ini
menunjukkan bahwa Agrobacterium bisa dipakai untuk
mengantarkan materi genetik ke dalam tanaman dan hal
ini menjadi ketertarikan baru dalam studi Agrobacterium
tumifaciens.

Sekarang ini, sistem transfer DNA dari Agrobacterium ke

tanaman dimanfaatkan secara meluas untuk penelitian
biologi molekuler dan rekayasa genetika pada tanaman.
1.1.2 Sifat-sifat Agrobacterium tumefaciens

Agen penyebab (causative agent) penyakit Crown gall,

yaitu Agrobacterium tumifaciens, digolongkan kedalam
famili Rhizobiaceae yang dibagi seperti ditunjukkan pada
Gb.2.

Sebagian besar genus Agrobacterium menyebabkan

tumor pada tanaman dikotil. Spesies Agrobacterium
tergolong bakteri gram-negatif yang merupakan bakteri
aerob dan mampu hidup baik sebagai saprofit maupun
parasit.
 Agrobacterium berbentuk batang, berukuran 0.6-1.0 m
sampai 1.5-3.0 m, dalam bentuk tunggal atau berpasangan.

Agrobacterium merupakan bakteri yang mudah bergerak

(motile) dan memiliki 1-6 flagela peritrichous serta
merupakan bakteri tak berspora. Suhu optimal pertumbuhan
bakteri ini adalah 25-28C.

Kumpulan bakteri ini biasanya berbentuk cembung, bulat,

lembut, dan tak berpigmen. (46)
 A. tumafaciens mengandung sebuah plasmid besar yang disebut Ti-
plasmid, yang bertanggung jawab pada proses onkogenesitas A.
tumefaciens. Namun, Ti-plasmid sendiri tidak mampu menyebabkan
terjadinya transformasi pada tanaman.

Gen-gen pada kromosom A. tumifaciens juga memiliki fungsi lain yang

berguna untuk onkogenesitas in planta (57, 65).

Ti-plasmid hidup secara stabil dalam tubuh bakteri meskipun ukurannya

besar (200-900 kb) (33). Struktur dari Ti-plasmid ditunjukan oleh Gb. 3.

Wilayah virulen (vir) pada Ti-plasmid, menyediakan sebagian besar

produk trans-acting untuk transit T-DNA.
1.1.3 Induksi Crown gall oleh A. tumefaciens

Peristiwa pembentukan tumor Crown gall yang diakibatkan

oleh Agrobacterium digambarkan pada Gb. 4.
A. tumefaciens menyerang tanaman pada bagian yang
luka. Pengirim pesan kimia (chemical messengers),
biasanya senyawa fenolik seperti acetosyringone, yang
berasal dari sel tanaman yang luka, menginduksi
transkripsi gen virulen Ti plasmid-borne di dalam bakteri
(5, 72).
Produk-produk gen vir mempengaruhi transfer T-DNA ke
sel tanaman. T-DNA mengkode enzim auksin, sitokinin,
biosintesis; fitohormon ini menggangu keseimbangan
hormon pada tanaman inang, sehingga terbentuklah
tumor.
 1.2 PROSES-PROSES YANG TERLIBAT
DALAM INDUKSI TUMOR CROWN GALL

Tumorigenesis dari Crown gall merupakan

proses yang terdiri dari beberapa tahap:

penempelan Agrobacterium pada sel tanaman

proses dan transfer T-DNA ke sel tanaman
penggabungan dan pengekspresian gen-gen T-DNA di
dalam genom tanaman.
1.2.1 Penempelan Agrobacterium pada Sel
Tanaman
Tahap pertama dalam induksi tumor adalah pengikatan
Agrobacterium pada sel tanaman. Peristiwa awal ini
dimediasi oleh gen-gen yang terletak pada kromosom
bakteri.

Gen-gen kromosom, chvA, chvB, dan exoC, diperlukan

dalam sintesis dan penyaluran -1,2-glucan cyclic yang
terlibat dalam pengikatan sel tanaman.

Protein chvB terlibat dalam biosintesis glucan (67),

sementara chvA diperlukan untuk memindahkan glucan
dari sitoplasma ke periplasma dan ruang ekstraseluler.
1.2.2 Induksi Gen-vir

Daerah vir kira-kira 30 kb dan tersusun dalam 7-8

komplementasi kelompok: virA, virB, virC, virD, virE, virF,
virG, dan virH (sebelumnya pinF) (73, 86).

Gb. 5 menunjukan susunan genetik wilayah vir dari Ti-

plasmid tipe oktopin dan nopalin. Perbedaan wilayah vir
antara Ti-plasmid tipe oktopin dan nopalin adalah; virF
dan virH (pinF) tidak terdapat pada Ti-plasmid tipe
nopalin sementara tipe oktopin mengandung kedua gen
tersebut.
 Dua penginduksi potensial, acetosyringone dan hydroxy-
acetosyringone, diisolasi dari sel akar tembakau oleh
Stachel et al (72).

pH medium memiliki pengaruh yang kuat pada induksi

vir; induksi akan optimal dalam rentang pH 5.0-5.4 dan
tidak akan terjadi induksi pada pH 6.3 atau diatasnya
(74).

Regulasi gen vir juga dimediasi oleh gen-gen yang

terletak pada kromosom Agrobacterium. Gen virulen
kromosomal yang dinamai chvD, chvE, ros, miaA, chvG,
dan chvI telah dilaporkan terlibat dalam virulensi dengan
cara mempengaruhi ekspresi gen-gen vir pada Ti-
plasmid (85, 86, 89,36,28, 18, 10,51).
1.2.3 Proses dan Transfer T-DNA
Proses dan transfer dari T-DNA dimediasi oleh produk-produk
yang dikode oleh gen-gen pada wilayah vir (vir-region).
Setelah induksi vir gen, produksi transfer tingkat lanjut dimulai
dengan pembentukan T-strand, yaitu duplikat dari single
stranded (ss) T-DNA (74).

Banyak produk gen bertanggung-jawab dalam proses ini.

Produk dari loci virC dan VirD terlibat dalam pembentukan dan
pemrosesan T-strand. VirD1 dan VirD2 bersama-sama
mengenali susunan pembatas 25 bp dan memproduksi
sebuah belahan endonukleotik ss pada strand bagian bawah
dari masing-masing pembatas (25, 27). Sayatan ini digunakan
sebagai tempat inisiasi dan terminasi dalam memproduksi T-
stand.
 Setelah penyayatan, VirD2 tetap terhubung kuat dengan ujung
5 dari T-strand (35). Pengikatan VirD2 pada ujung 5 memberi
karakter polar pada T-strand yang menjamin bahwa pada
langkah berikutnya, ujung 5 merupakan leading end.

Produksi T-strand diperkirakan merupakan hasil dari

perpindahan strand bagian bawah dari T-DNA di antara
sayatan tersebut.

Studi terbaru mengungkapkan bahwa langkah awal produksi T-

strand secara evolusioner terkait dengan sistem bakteri yang
memproduksi ssDNA, seperti salah satunya selama proses
konjugasi (60).
 Dua protein lainya, VirC1 dan VirC2 kemungkinan
berinteraksi dengan VirD1 dan VirD2 selama penyayatan
berlangsung. Lokus virC, yang mengkode dua produk
yaitu VirC1 (23 kDa) dan VirC2 (26 kDa), digunakan untuk
meningkatkan proses penyayatan batas dari T-DNA (81,
82, 89).

T-strand harus bergerak melalui membran dan ruang

seluler sebelum sampai pada inti sel tanaman dan tetap
menjaga integritasnya selama proses ini. Oleh karena itu,
adalah sebuah hipotesis bahwa T-strand seolah-olah
bergerak seperti sebuah kompleks protein-ssDNA.
 VirE2 merupakan sebuah protein yang memiliki ikatan
asam nukleat ss yang dapat diinduksi (inducible ss
nucleic acid-binding protein), yang dikode oleh lokus virE
yang terikat tanpa kespesifikan susunan.

Sejumlah besar VirE2 (60 kDa) berada dalam sel dan

terikat kuat serta saling bekerja sama, yang berarti
bahwa sebuah T-strand akan terlapisi secara
keseluruhan (Gb. 7).

Satu molekul VirE2 diperkirakan melapisi sekitar 30

nukleotida, oleh karena itu 20 kb T-strand akan
membutuhkan 600 molekul VirE2 (52).
 Akibatnya, degradasi T-strand oleh nukleasi akan dicegah
dengan ikatan VirE2 dan bahkan, ikatan in vitro virE2
membuat ssDNA resisten terhadap degradasi nuckleolitik.

T-strand bersama-sama VirD2 dan virE2 membentuk T-

kompleks. T-kompleks merupakan kompleks nukleoprotein
yang sangat besar. Di beberapa strain Agrobacterium, T-
strand panjangnya mencapai 20 kb (65). T-strand ini akan
mengikat sampai sekitar 600 molekul virE2 dan memiliki
panjang terhitung 3600 nm, yaitu 60 kali ketebalan
membran inti. Termasuk sebuah VirD2, T-kompleks
memiliki massa 50x106 D (70).

Kemudian, T-komplek harus keluar dari sel bakteri,

melewati membran dalam dan luar dan juga dinding sel
bakteri (Gb. 7).
1.2.4 Integrasi T-strand ke Genom Tanaman

Integrasi T-strand ke dalam sebuah kromosom inang

merupakan tahapan akhir dalam proses transfer T-DNA
(Gb. 7).

Integrasi T-strand membutuhkan pengambilan inti

(nuclear uptake). Protein yang berukuran lebih besar
dari kira-kira 40 kDa membutuhkan NLS (nuclear
localization signal) yang memediasi pengambilan inti
(34).
 Analisis susunan VirD2 mengungkapkan bahwa pada
wilayah ini ditemukan susunan yang homolog dengan
NLS tipe bipartite (34). Jika sebuah NLS bipartite yang
tidak berpasangan dari VirD2 kurang mampu memediasi
pengambilan inti pada T-kompleks yang sangat besar,
maka diperlukan tambahan NLSs yang dapat dihasilkan
dari VirE2, komponen protein yang paling berlimpah dari
T-kompleks. Analisis sekuensing menunjukkan dua
NLSs bipartite yang potensial dalam VirE2 (12).

Jadi, VirE2 menyediakan NLSs di sepanjang T-

kompleks. NLSs ganda pada VirE2 kemungkinan
bermanfaat secara fungsional untuk impor inti T-
kompleks yang tak terputus/terganggu, seperti
contohnya, untuk menjaga sisi sitoplasma dan
nukleoplasma secara simultan dari pori-pori inti yang
terbuka.
 Mekanika integrasi T-strand ke dalam genom tanaman
sebagian besar belum diketahui. Disarankan bahwa ikatan
VirD2 dengan ujung 5 pada T-strand bergabung dengan
sayatan pada DNA tanaman. DNA tanaman akan lebih terbuka
untuk membentuk sebuah celah, dan ujung 3 dari T-strand
kemungkinan berpasangan dengan wilayah lain dari DNA
tanaman. Reaksi-reaksi ini akan menghasilkan T-strand ke
dalam satu strand dari DNA tanaman. Strain yang terpilin
kemudian akan menimbulkan sebuah sayatan pada strand
yang berlawanan dari DNA tanaman.

Reparasi celah dan sintesis DNA menggunakan T-strand

sebagai cetakan, menghasilkan produk integrasi akhir. Namun,
belum diketahui apapun tentang enzimologi proses
integrasinya. Tidak ada faktor-faktor tanaman yang terlibat
dalam proses ini.

VirD2 dan VirE2 dianggap mengkatalisasi integrasi T-strand

kedalam genom tanaman; namun, tidak ada data yang
mendukung hipotesis ini.
 DAFTAR GAMBAR

Gb. 1. Induksi Crown Gall oleh A.tumefaciens (strain A208) pada stem Kalanchoe
daigremontiana
Gb. 2. Hubungan anggota-anggota famili Rhizobiaceae (46)
Gb. 3.Organisasi genetic Ti plasmid tipe octopine.
Loci vir dan T-DNA dijelaskan pada penjelasan. Loci-loci yang lain adalah
sebagai berikut: tra, transfer konjugasi, occ, katabolisme octopine; arc, katabolisme
arginine; agc, katabolisme agropine; inc, ketidakcocokan; ori, asal pengulangan (86)
Gb. 4. Gambaran peristiwa-peristiwa induksi Crown Gall oleh A.tumefaciens.
Penjelasan lebih lengkap pada teks.
Gb. 5. Organisasi genetic wilayah vir pada Ti plasmid octopine (A) dan Ti plasmid
nopaline (B). Panah-panah di atas menunjukan unit transkripsi. Dua gen (pinF dan
virF) yang ada pada Ti plasmid octopine tidak ada pada Ti plasmid nopaline (85)
Gb. 6. Sisterm regulator gen-gen vir pada Agrobacterium. Lihat teks untuk
penjelasan lebih lengkap. OM, membrane luar; IM, membrane dalam.
Gb. 7. Tahapan dasar dalam transformasi sel-sel tanaman oleh A.tumefaciens
(91)