KROMATOGRAFI CAIR

KINERJA TINGGI
Kelompok 4:
1. Diana Indriani
2. Qisthy Laurani
Pengertian KCKT
Kromatografi adalah teknik pemisahan
campuran didasarkan atas perbedaan
distribusi dari komponen-komponen campuran
tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam
(padat atau cair) dan fase gerak (cair atau
gas). Bila fase diam berupa zat padat yang
aktif, maka dikenal istilah kromatografi
penyerapan (Adsorption Chromatography).
Bila fase diam berupa zat cair, maka teknik ini
disebut kromatografi pembagian (Partition
Chromatography).
Kelebihan KCKT
A. mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu
campuran
B. mudah melaksanakannya
C. analisis dan kepekaan yang tinggi
D. dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan
bahan yang dianalisis
E. Resolusi yang baik
F. dapat digunakan bermacam-macam detector
G. Kolom dapat digunakan kembali
H. mudah melakukan "sample recovery"
Jenis jenis HPLC
1. Kromatografi Adsorbsi
Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase
normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina,
meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai
silika sebagai fase diamnya.
2. Kromatografi fase terikat (Kromatografi Partisi)
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang
dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang
digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-
hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana,
oktasilana, atau dengan fenil. Sebagai fase gerak adalah
campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan
larutan bufer.
 3. Kromatografi penukar ion
HPLC penukar ion menggunakan fase diam yang dapat
menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada
banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun
demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren
resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan
dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya.
4. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk
pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-
masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel
ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang
berlawanan.
 5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi
permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan
atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000
dalton.
6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-
interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Kromatografi
jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein
(enzim) dari campuran yang sangat kompleks.
 Fase gerak dan Fase diam
1. Fase diam (Stationary phase) merupakan salah satu komponen yang penting dalam

proses pemisahan dengan kromatografi karena dengan adanya interaksi dengan fase
diamlah terjadi perbedaan waktu retensi (tR) dan terpisahnya komponen suatu
senyawa analit termasuk asam amino. Fase diam dapat berupa bahan padat atau
porous (berpori) dalam bentuk molekul kecil atau cairan yang umumnya dilapiskan
pada padatan pendukung.

2. Fase gerak (Mobile phase) merupakan pembawa analit (asam amino), dapat bersifat

inert maupun berinteraksi dengan analit tersebut. Fase gerak dapat berupa bahan cair
dan dapat juga berupa gas inert yang umumnya dapat dipakai sebagai carrier
gas senyawa mudah menguap (volatil).

Gambar Alat
Keterangan Alat
Tempat sampel
Injector
Detector
Pompa
Kolom
Botol pelarut
Selang penghubung
Mesin pengendali
Komputer

 Metode Penggunaan
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah
fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel
(tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung
buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator
atau perekam.
 Prinsip Dasar dari HPLC

Prinsip dasar dari HPLC yaitu didasarkan pada partisi

cair-cair Teknik ini terdiri dari suatu kolom yang berisi
zat padat penunjang halus di mana pada permukan
terdapat pelarut sebagai fase diamnya. Fase kedua,
yaitu fase bergerak yang tidak bercampur dengan
cairan dari fase diamnya akan mengalir sepanjang
kolom. Komponen-komponen yang terpartisi lebih
banyak pada fase diam akan bertahan lebih lama di
dalam kolom dibandingkan yang lebih banyak
terpartisi pada fase gerak.

 Cara kerja dari HPLC

Prinsip kerja HPLC ialah dengan bantuan pompa fase gerak
cair dialirkan melalui kolom menuju detector. Cuplikan
dimasukkan ke dalam aliran fase gerak dengan cara
penyuntikkan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-
komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi
antara solute-solut terhadap fase diam Solut-solut yang kuat
interaksinya dengan fase diam akan keluar dari kolom terlebih
dahulu. Sebalikya, solute-solut yang kuat berinteraksinya
dengan fase diam maka solute tersebut akan keluar kolom,
dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk
kromatogram kromatografi gas. Seperti pada kromatografi gas,
jumlah peak menyatakan konsentrasi komponen dalam
campuran. Komputer dapat digunakan untuk mengontrol kerja
system HPLC dan mengumpulkan serta mengolah hasil data
pengukuran HPLC.