Penyimpanan Gamet

Penyimpanan Embrio
BIOTEKNOLOGI REPRODUKSI HEWAN
 Tujuan Khusus: mahasiswa
dapat
melakukan teknik bioteknologi
penyimpanan pengawetan gamet
menjelaskan teknik bioteknologi
penyimpanan pengawetan embrio
hewan
 PENYIMPANAN GAMET /
EMBRIO IN VITRO
Jangka pendek : penyimpanan (storage);
jangka panjang : pembekuan =
cryopreservation = penyimpanan beku
Tujuan penyimpanan
Manfaat
Alasan dilakukannya pengawetan embrio:

Embrio/sel gamet mempunyai

daya tahan hidup relatif singkat
Aman
Bisa dimanfaatkan di masa
datang untuk keperluan
mendadak (bank sperma)
Pada manusia: Salah satu
prosedur Program bayi tabung
 Simpan beku = Pengawetan
Teknik simpan beku (cryoperservation) pada awalnya
lazim digunakan di klinik-klinik bayi tabung untuk
penyimpanan sel telur wanita hingga mencapai fase
blastosis.

Menurut Mulyoto, teknik simpan beku pada dasarnya

adalah proses pengawetan material biologis pada suhu
freezer (-20 C), deep freezer (-80 C), -150 C dan 196
C.

Teknik simpan beku dapat digunakan untuk

penyimpanan sel tunggal seperti sel telur dan embryo
atau fibroblast, koloni sel maupun organ atau jaringan
tubuh.

Labolatorium cryo
 Kebutuhan penyimpanan /
pengawetan gamet / embryo

Media = ekstender = pengencer

Krioprotektan = Pelindung selama
pembekuan = cryopreservatives :
melindungi sel dari bahaya kerusakan
pada temperatur rendah
Wadah penyimpanan
Temperatur penyimpanan
Alat / peralatan penyimpanan
 Komponen (material/alat) yang
diperlukan
Krioprotektan
Zat kimia pelindung terhadap terjadinya kerusakan
saat pembekuan
Tempat/vessel
Alat yang digunakan untuk menyimpan material
biologis
Perubahan temperatur
Kecepatan penurunan temperatur
Temperatur penyimpanan
Umumnya pada -196oC, namun ada juga yang
disimpan pada -80oC atau -20oC
 Komponen (material/alat) yang diperlukan
(lanjutan)
Alat pengatur perubahan/penurunan
temperatur/suhu
Freezing machine
Freezing block
Zat pendingin
Nitrogen cair
Dry ice
Alat pelindung/keselamatan kerja
Masker, sarung tangan, penjepit
 Krioprotektan
Merupakan zat beracun!!
Fungsi
Melindungi sel dari pengaruh suhu rendah dan
tekanan osmotik dengan cara menggantikan posisi
molekul air di dalam sel (penetrasi) atau
mengeluarkan molekul air dari dalam sel (non-
penetrasi)..
Cara kerjanya
Menembus dinding sel/penetrating
Tidak menembus dinding sel/non penetrating dan
tetap berada di luar sel.
 Macam Krioprotektan
Menembus Tidak menembus
membrane sel gamet membran sel gamet /
/ embrio embrio
Masuk menembus Melindungi sel
membran untuk selama penyimpanan
menggantikan posisi dari luar sel
air agar tidak menjadi Contoh : kuning telur
kristal es dalam sel
Contoh : Gliserol;
DMSO
 Kendala dalam kriopreservasi : kerusakan / kematian
embrio / sel gamet karena:
Terbentuknya intracellular ice crystal (pd rapid
freezing)
Peningkatan konsentrasi cairan sitoplasma (pd
slow freezing)
Dehidrasi sel

Utk menanggulangi hal tsb:

Penambahan krioprotektan (utk menghambat
dehidrasi sel) gliserol, dimethylsulfoxide
(DMSO), etilen glikol, sukrosa, rafinosa
Slow freezing mencegah pembentukan kristal
es
 Teknik pembekuan/Perubahan
temperatur
Slow Cooling (Pembekuan lambat)
Menggunakan krioprotektan dengan
konsentrasi rendah (10%)
Rapid Cooling
Krioprotektan dengan konsentrasi sedang
Vitrifikasi
Krioprotektan dengan konsentrasi tinggi
(40%) bahkan ditambah macromolecules.
Tahapan Pengawetan:

Koleksi sel gamet/embrio

Penambahan
krioprotektan dalam
media
Precooling
Cooling
Plunging, freezing,
storage
Thawing/warming
Cryoprotectant removal

Lab. Freezing
Cryologic
Planner
 KRIOPRESERVASI EMBRIO

Penyimpanan embrio/sel gamet dalam

bentuk beku (-196oC)

Dua alasan utama menyimpan beku

embrio, yaitu pertimbangan medik dan
pertimbangan etika

Embrio berlebih : tidak disimpan beku

dapat diberikan kepada donor menjadi
bahan riset atau bahkan dimusnahkan.
Namun, tindakan terakhir bisa
mendatangkan problem etika.
 Proses Simpan Beku Embrio

Embrio berlebih

Embrio disimpan di dalam straw

yang berisi medium khusus
(cryoprotectant, biasanya
mengandung propanediol dan
sukrosa)

straw yang berisi embrio dimasukkan ke dalam

mesin pembeku (cryo machine)

Mesin pembeku dinyalakan dan temperatur

awal dimulai pada suhu 20o C .
Secara bertahap suhu embrio diturunkan
hingga pada 14 menit pertama mencapai
suhu -7o C kemudian dilakukan seeding

Setelah sekitar dua jam proses

pembekuan diakhiri pada suhu
sekitar -90o C.

Selanjutnya straw yang

berisi embrio dipindahkan Embrio dapat
ke dalam tanki disimpan.
penyimpanan embrio
yang beris nitrogen cair
dengan suhu -196o C.
 TEKNIK PEMBEKUAN EMBRIO
BAHAN-BAHAN: Mikropipet atau mouth
Larutan PBS piece
BS Mikropipet (5, 10, 50 ml)
Sukrosa Straw bening
Aquades Syringe tuberculine
Gunting straw
N2Cair
PERALATAN: Freezer prommable
Alat-alat Gelas UTF(-150oC)
Cawan Petri Penangas air
Filter millipore Stopwatch
Mikroskop stereo Straw label
 TEKNIK PEMBEKUAN EMBRIO

1. Larutan A (20 % BS + PBS)

Ambil 40 ml PBS, lalu + kan 10 ml BS
(hangat)
2. Larutan (B) yaitu gliserol 10 %
Ambil larutan (A) 18 ml +kan 2 ml gliserol
3. Larutan (C) yaitu sucrose 0.3 M
Timbang 10 mg sucrose, +kan 80 ml
aquadest
4. Tambahkan ke dalam 3 larutan antibiotik ,
lalu filtrasi dengan filter 0.22 m
1. Untuk membuat larutan gliserol 6.7 % =
3 ml larutan A + 6 ml larutan B
2. Untuk membuat larutan gliserol 3.3 % =
6 ml larutan A + 3 ml larutan B
3. Untuk membuat 0.3 M sucrose =
4 ml larutan C + 1 ml BS
4. Campur larutan A + B (1+2) homogen,
lalu saring dengan filter 0.22 m
(sterilisasi)
Medium Pengawet (Ekstender +
krioprotektan)
C1 X VOL 1 = C2 X VOL 2
40 ml 0% BS =
40 ml PBS + 10 ml BS = 50 ml PBS 20%
BS
100% x = 70% alk vol 100ml
Aquadest 30 ml + 100%alk 70ml = 100ml
70% alk
 Medium pengawet/penyimpan
1 bag gamet + 1 bag medium penyimpan=
1:2
1 bag gamet + 9 bag medium = 1:10
2 bag gamet+3 bag medium = 2:5 (40%)
 LARUTAN A

40 ml PBS +10
ml BS
40 ml PBS 10 ml BS

LARUTAN B

18 ml LAR. A +
18 ml LAR. A 2 ml GLISEROL 2 ml GLISEROL

LARUTAN C
10 g 80 ml AQUADEST
SUKROSA SUKROSA 0.3 M
 LARUTAN
GLISEROL
6.7 %

3 ml LAR. A 6 ml LAR. B

LARUTAN
GLISEROL
3.3 %

6 ml LAR. A 3 ml LAR. B

LARUTAN
0.3 M
SUKROSA

4 ml LAR. C 1 ml LAR. BS
 . Pada one step method digunakan 0.3 M
larutan sucrose (hilangkan cryoprotectan)
. Larutan C dapat disimpan selama 1 bulan
dalam refrigerator
. Masukkan larutan C ke dalam 4 tabung
dengan volume masing-masing 4 ml
. Sebelum digunakan, encerkan terlebih
dahulu larutan C dengan menambahkan 1
ml BS, campur homogen, lalu saring dengan
filter 0.22 m
 CUCI
EMBRIO
dlm. PBS +
BS 20 % 5 ml GLISEROL 5 ml GLISEROL 5 ml GLISEROL
3.3 % (5 menit) 6.7 % (5 menit) 10 % (10 menit)

EQUILIBRASI LARUTAN GLISEROL

 Praktikum
Medium untuk gamet jantan ikan
Bila medium untuk ayam atau hewan
mamalia tersedia bisa praktikum ke 3 jenis
hewan
 Medium
Pengawet
1% Gliserol
dlm Ringer
0,01 ml 9,9 ml MEDIUM RINGER
GLISEROL

Medium
Pengawet
1,5 %
Gliserol
0,15 ml GLISEROL 9,9 ml MEDIUM RINGER dlm Ringer

Medium
Pengawet
2% Gliserol
dlm Ringer
0,02 ml GLISEROL 9,9 ml MEDIUM RINGER
 PENYIMPANAN GAMET (atau
EMBRIO) IN VITRO
Jangka pendek : penyimpanan (storage);
jangka panjang : pembekuan =
cryopreservation = penyimpanan beku
Tujuan : ?
Manfaat : ?
 Kebutuhan penyimpanan /
pengawetan gamet / embryo

Media = ekstender = pengencer

Krioprotektan = Pelindung selama
pembekuan = cryopreservatives :
melindungi sel dari bahaya kerusakan
pada temperatur rendah
Wadah penyimpanan
Temperatur penyimpanan
Alat / peralatan penyimpanan
 Komponen (material/alat) yang
diperlukan
Krioprotektan
Zat kimia pelindung terhadap terjadinya kerusakan
saat pembekuan
Tempat/vessel
Alat yang digunakan untuk menyimpan material
biologis
Perubahan temperatur
Kecepatan penurunan temperatur
Temperatur penyimpanan
Umumnya pada -196oC, namun ada juga yang
disimpan pada -80oC atau -20oC
 Komponen (material/alat) yang diperlukan
(lanjutan)
Alat pengatur perubahan/penurunan
temperatur/suhu
Freezing machine
Freezing block
Zat pendingin
Nitrogen cair
Dry ice
Alat pelindung/keselamatan kerja
Masker, sarung tangan, penjepit
 Krioprotektan
Merupakan zat beracun!!
Fungsi
Melindungi sel dari pengaruh suhu rendah dan
tekanan osmotik dengan cara menggantikan posisi
molekul air di dalam sel (penetrasi) atau
mengeluarkan molekul air dari dalam sel (non-
penetrasi)..
Cara kerjanya
Menembus dinding sel/penetrating
Tidak menembus dinding sel/non penetrating dan
tetap berada di luar sel.
 Macam Krioprotektan
Menembus Tidak menembus
membrane sel gamet membran sel gamet /
/ embrio embrio
Masuk menembus Melindungi sel
membran untuk selama penyimpanan
menggantikan posisi dari luar sel
air agar tidak menjadi Contoh : kuning telur
kristal es dalam sel
Contoh : Gliserol;
DMSO
 Praktikum
Medium untuk gamet jantan ikan
Bila medium untuk ayam ayau hewan
mamalia tersedia bisa praktikum ke 3 jenis
hewan
 Teknik pembekuan/Perubahan
temperatur
Slow Cooling (Pembekuan lambat)
Menggunakan krioprotektan dengan
konsentrasi rendah (10%)
Rapid Cooling
Krioprotektan dengan konsentrasi sedang
Vitrifikasi
Krioprotektan dengan konsentrasi tinggi
(40%) bahkan ditambah macromolecules.
Cryologic
Planner