Ekstraksi Kandungan bioaktif

L.Japonica
Pelarut organik (anti-inflamasi)

Fermentasi,
mikroorganism
Toksik, mencemari
e
lingkunagn

Kandungan bioaktif
(anti-inflamasi)

B.Subtilis + 5% (w/v)
larutan L.japonica
(sebagai sumber utama inkubasi 150 rpm, 37
karbon) + 2% tambahan
sumber nitorgen
Kandungan bioaktif
dengan efek anti inflamasi
terbaik
pH awal = 6
Menurunkan produksi NO
(27,6% 5,2%) ,ROS,
C, 72 jam
fosforilasi NF-B (p65),
prostagladin E.
 Inflasmasi(peradangan) merupakan interaksi antara kompleks dan faktor
terlarut dalam merespon luka dan infeksi.

Jaringan + antigen
Stimulan imun aktif
(terluka/terinfeksi)

Merusak Makrofag
Sitokin Proinflamasi
neutrofil, monosit dan induksi
(interleukin-1 interleukin-6,
limfosit dan mastosit
dan necrosis tumor)
Laminaria japonica: Sejenis rumput laut yang dapat dimakan dan banyak
dikonsumsi di asia, yang terbukti menunjukkan efek entimikroba, anti oksidan,
antiinflamasi dan hipopolidemia.Selain itu , Laminaria telah digunakan
sebagai obat herbal untuk mengobati gejala gangguan pencernaan,
keracunan arsen, diabetes dan kanker.

8.46%28.48% manitol asam lamak tak jenuh

17.1%32.0% asam alginat asam amino
5.97%- 18.99% protein mineral
dan 19.35%45.29% abu
 Penelitian sebelumnya membuat ekstrak laminaria
menggunakan pelarut organik
Pelarut organik bersifat toksik sehingga mempengaruhi
keamanan makanan, penggunaan pelarut organik
yang berlebihan juga dapat mengakibatkan penyakit
dan masalah lingkungan
Maka fermentasi (menggunakan mikroorganisme
dalam proses bbiokonversi) menjadi solusi untuk
memproduksi senyawa bioaktif yang ramah lingkungan
Pada penelitian saat ini, digunakan rumput laut coklat,
L. Japonica sebagai sumber karbon utama untuk
fermentasi dengan Bacillus subtilis (GRAS)
Dalam penelitian ini kondisi fermentasi dioptimasi untuk
mendapatkan penghambatan produksi NO yang
paling efisien, dan mengidentifikasi mekanisme anti-
inflamasi dari produk fermentasi.
2.1. Mikroorganisme dan Rumput laut
B. subtilis N2 yang telah diisolasi oleh kelompok Prof
Tsai, kemudian dibudidayakan dalam TSB (Trypic
Soy Broth) pada suhu 37 C selama 24 jam dan
disimpan pada suhu -80 C dengan 50% gliserol.

Rumput laut coklat L.japonica sudah berupa tanah

yang telah dihaluskan dan diayak dengan ukuran
pori 1 mm kemudian disimpan pada suhu -20 C
sebelum digunakan.
2.2. Kultur sel
Sel yang digunakan sel RAW 264.7 yang
merupakan sel garis makrofag pada tikus.

Sel RAW 264.7 dikultur dalam DMEM (Dulbeccos

modified Eagle medium) kemudian ditambahkan
10% FBS (fetal bovine serum), penisilin G (100U/mL),
dan streptomisin (100 g/mL) dan dipertahankan
pada 37 C dalam suasana 5% CO2.
2.3. Pengukuran produksi NO
Konsentrasi nitrit dalam supernatant diukur dengan
reaksi Griss dengan cara setiap supernatant dicampur
dengan volume yang sama dengan reagen Griss.

Absorbansi campuran diukur pada 530nm dengan

ELISA reader, dengan menggunakan natrium nitrit
sebagai standar.

Tingkat produksi NO dalam 1 g/mL lipopolisakarida

yang diinduksi (LPS) pada sel RAW 264.7 dianggap
100%.

Relativitas NO (%) = (Tingkat produksi absence sampel

atau presence sampel / produksi di LPS-induced) x
100%.
2.4. Efek berbagai loading pada fermentasi
L.japonica untuk reduksi NO
3%, 5%, dan 8% (b/v) dari 250 mL suspensi
L.japonica diinokulasi secara individual dengan
kultur B. subtilis N2 dan diinkubasi pada 37 C dan
150 rpm selama 72 jam.

Sampel diambil setiap 12 jam dari masing-masing

loading L. japonica untuk analisis jumlah sel, pH
dan produksi NO.
2.5. Efek berbagai gula sederhana dan zat yang
mengandung nitrogen pada reduksi NO
Berbagai 1% (b/v) gula sederhana (glukosa, galaktosa
dan maltosa), dan 2% (b/v) zat yang mengandung
nitrogen (ekstrak ragi, soytone dan pepton)
ditambahkan. Kedalam 5% (b/v ) dari 250 mL suspensi
L.japonica dalam labu dan difermentasi oleh B. subtilis
N2 pada 37 C dan 150 rpm selama 72 jam.

Sampel diambil setiap 12 jam dari fermentasi pada

kondisi yang berbeda untuk analisis jumlah sel, pH dan
produksi NO.
2.6. Efek suhu dan tingkat agitasi pada reduksi NO
Untuk optimasi suhu fermentasi, B. subtilis N2
diinokulasi ke 5% (b/v) dari 250 mL suspensi L.
japonica dengan 2% (b/v) ekstrak ragi dan
diinkubasi pada 150 rpm selama 72 jam pada
25C, 30C, 37C dan 42C.

Untuk optimasi tingkat agitasi, B. subtilis N2

diinokulasi ke 5% (b/v) suspensi L. japonica yang
mengandung 2% (b/v) ekstrak ragi dan diinkubasi
pada 37 C dengan tingkat getaran 0, 100, 150
atau 200 rpm selama 72 jam.

Sampel diambil setiap 12 jam dari fermentasi pada

kondisi yang berbeda.
2.7. MTT assay untuk kelangsungan hidup sel
Sel RAW 264.7 (2 10 5) diuji dengan produk
fermentasi L. japonica dalam konsentrasi 50, 100
dan 200 g/mL pada kondisi kultur sel yang normal
selama 24 jam.

Setelah 24 jam, medium dihilangkan dan sel

diinkubasi dengan MTT (5 mg/mL) selama 4 jam
pada 37 C. Kristal formazan biru gelap dilarutkan
dengan DMSO, dan kemudian diukur absorbansi
pada 490 nm dengan microplate reader.
2.8. Pengukuran intraseluler ROS
Tingkat ROS intraseluler diperiksa dengan pewarnaan
menggunakan dikloro-dihidro-fluorescein diasetat
(DCFH-DA)
Sel RAW 264.7 (2 10 5) di uji dengan 1 g/mL LPS dan
dengan atau tanpa produk fermentasi L. japonica
selama 24 jam. Setelah masa inkubasi, medium
digantikan oleh DMEM bebas serum dengan 10 M
(DCFH-DA) selama 30 menit pada 37 C.
Kemudian, sel dicuci dengan PBS dua kali dan dipanen
dengan 0,25% tripsin. Sel disentrifugasi dan diresuspensi
dalam PBS untuk analisis FACScan oleh saluran FL1.
Sinyal ROS disajikan sebagai satuan fluorescent (FU).
Tingkat ROS dalam 1 g/mL LPSinduced RAW 264.7 sel
adalah 7142 FU, yang dianggap sebagai 1.
Hasil kuantitatif fluoresensi disajikan sebagai nilai rata-
rata dari tiga percobaan independen.
2.9. Western blotting
Sel RAW 264.7 (2 10 5) diuji dengan 1 g/mL LPS dan dengan
atau tanpa 50, 100 dan 200 g/mL selama 24 jam.
Setelah masa inkubasi, lysates RAW 264.7 disiapkan 200 L
buffer lisis dingin (pH 7,4) (50 mmol / L HEPES, 5 mmol / L EDTA,
100 mmol / L NaCl, 1% Triton X-100, protease inhibitor cocktail)
adanya inhibitor phosphatase (50 mmol / L natrium fluorida, 1
mmol / L natrium orthovanadate, 10 mmol / L natrium
pirofosfat, 1 nmol / L microcystin).

Ekstrak menjalani 10% SDS-PAGE dan kemudian dipindahkan

ke membran poliviniliden difluorida dalam sistem semidry,
yang diblokir dengan susu bebas lemak 5% di penyangga
TBST (20 mmol/L Tris-HCl, 137 mmol / L NaCl dan Tween 20
0,1%), kemudian diinkubasi dengan antibodi primer terhadap
terfosforilasi NF-B (p65) (1: 200) dan -actin (1: 1000) di TBST
penyangga semalam, kemudian dicuci dan diinkubasi
dengan antibodi sekunder untuk 120 menit.
2.10. Pengukuran prostaglandin E2 (PAGE2)
PGE2 ditentukan dengan menggunakan kit enzim
immunoassay (EIA)

Supernatan dan konjugat PGE2 EIA dimasukkan ke

piring 96-well sebelum dilapisi dengan goat anti-
mouse IgG dan dibiarkan bereaksi selama 2 jam,
dilanjutkan dengan final wash untuk
menghilangkan reagen antibody-enzyme yang
tidak terikat.

Larutan substrat ditambahkan dan intensitas warna

yang dihasilkan diukur pada 405 nm.
2.11. Analisis statistik
Data dianalisis secara statistik menggunakan SPSS
Versi 12.0. Analisis Varian Satu Arah (ANOVA)
digunakan untuk menentukan perbedaan statistik
antara mean sampel, dengan tingkat signifikansi
yang ditetapkan pada p <0,05.
Beberapa perbandingan means dilakukan
dengan uji Tukey. Semua data dinyatakan sebagai
mean SD.
Gambar 1. Pengaruh produk fermentasi L.
japonica dan ekstrak air L. japonica pada
nitric oxide (NO) produksi induksi LPS sel
RAW 264.7. Data dinyatakan sebagai
rata-rata(mean) SD (n = 3). * P <0,05
dibandingkan dengan ekstrak air L.
japonica.
Gambar 2. Pengaruh beban ganggang pada (A) pertumbuhan sel, (B) pH
dan (C)LPS menginduksi produksi NO dari fermentasi L. japonica. Data
dinyatakan sebagai rata-rata(mean) SD (n = 3) huruf. Different di bagian
atas bar yang berbeda nyata (p <0,05).
 Digunakan MTT assay (uji untuk
menilai aktivitas suatu metabolisme
sel).
Sel RAW 264.7 diberi perlakuan
dengan 50, 100, dan 200 g/ml dari
produk fermentasi L.Japanica selama
24 jam. Didapatkan hasil, tidak ada
efek yang signifikan terhadap
kelangsungan sel hidup.
 Sel RAW 264.7
diberi perlakuan
dengan LPS
selama 24 jam,
memperlihatkan
produksi ROS
meningkat

Sementara, ketika sel dikendalikan dengan LPS dan

produk fermentasi L.Japanica secara signifikan
mengurangi produksi intraseluler ROS.
 Sel diberi
perlakukan
dengan LPS
selama 24 jam
memperlihatka
n peningkatan
secara
signifikan
fosforlasi dari
NF-kB
Sel yang diinkubasi dengan produk
(p65).
fermentasi L.Japanica ekspresi Fosforilasi
NF-kB terhambat yang tergantung pada
konsentrasi.
LPS diinduksi PGE2 produksi terhambat
secara signifikan dengan produk fermentasi
L.Japanica pada konsentrasi 100 and 200
g/ml.
Dalam penelitian ini ditentukan bahwa kondisi
pertumbuhan dan senyawa tambahan yang
optimum untuk fermentasi rumput laut cokelat
(L. Japonica) dengan menggunakan GRAS
(mikroorganisme B. subtilis) adalah ketika
terjadinya inhibisi produksi ROS, inactive
fosforilasi p65, dan inhibisi produksi NO.
Fermentasi dengan mikroorganisme adalah
cara yang ramah lingkungan, mudah dan
murah.