PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI II

IDENTIFIKASI MIKROBA SECARA MOLEKULER

KELOMPOK F2

Dessy Aulia Rahma ( 20142100 )

Derian Reynaldo ( 20142100)
Dhia Nabella Gunarso ( 20142100)
Fitri Maria Agustina B ( 2014210095)

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PANCASILA JAKARTA
2017
Pendahuluan
1. Latar Belakang
Identifikasi bakteri pada saat ini masih dilakukan secara konvensional melalui
studi morfologi dan biokimia menggunakan buku sumber Bergeys Manual of
Systematic Bacteriology. Metode identifikasi konvensional hanya berhasil
mendeteksi satu atau dua jenis bakteri saja atau satu persen dari total mikroba
dalam tanah. Metode ini memperbesar kemungkinan bakteri lain yang memiliki
fenotip yang sama teridentifikasi menjadi spesies yang sama, padahal keduanya
belum tentu secara genetik memiliki kesamaan. Sementara itu, bakteri jenis
tertentu terkadang memiliki kemampuan membentuk endospora, sehingga hanya
aktif pada waktu tertentu sesuai kondisi optimum pertumbuhannya. Hal ini dapat
menghambat proses identifikasi bakteri menggunakan metode konvensional
Sistem identifikasi konvensional yang digunakan pada saat ini membatasi
proses identifikasi hanya sampai taksa genus atau sampai spesies untuk beberapa
jenis bakteri tertentu. Sementara itu, data di lapangan menunjukkan perubahan
Database spesies bakteri dari waktu ke waktu. Untuk mengidentifikasi secara pasti
pada tingkatan spesies diperlukan analisis lanjut secara molekuler. Teknik
identifikasi menggunakan metode biologi molekuler telah berhasil
mengidentifikasi kelompok mikroorganisme dari lingkungan secara spesifik
Teknik yang saat ini populer untuk mengidentifikasi dan menganalisis
komunitas mikroorganisme tanah adalah dengan menggunakan teknologi
analisis sikuen gen 16S rRNA atau 16S rDNA. Gen ini adalah gen yang
mengkode RNA ribosomal pada subunit kecil ribosom (16S untuk prokariot)
dan memiliki urutan yang khas dan berbeda pada setiap bakteri, sehingga
bisa dijadikan penanda molekuler untuk proses identifikasi. Data sikuen gen
hasil studi molekuler bakteri menggunakan penanda gen 16S rRNA dapat
dijadikan alat untuk studi evolusioner pada tingkat organism prokariotik.
Hasil analisis filogenetik bakteri berbasis gen 16S rRNA saat ini bahkan
sudah menjadi pelengkap pada buku sumber Bergeys Manual of Systematic
Bacteriology edisi kedua. Pada proses identifikasi bakteri yang bersifat
antagonis terhadap Fusarium sp., sampel DNA bakteri yang berhasil diisolasi
kemudian diamplifikasi secara in vitro dengan primer spesifik untuk gen 16S
rRNA menggunakan mesin PCR (Polymerase Chain Reaction) dan hasilnya
dielektroforesis menggunakan gel agarosa. Sampel DNA bakteri yang telah
diamplifikasi menggunakan primer gen 16S rRNAselanjutnya disikuensing
untuk memperoleh urutan sikuen gen16S rRNA. Sikuen hasil sikuensing
selanjutnya dianalisis menggunakan program komputer BLAST (Basic Local
Alignment Search Tools) dan dibandingkan dengan nukleotida yang ada
pada database GenBank(NCBI). Dari hasil analisis tersebut diharapkan
kita dapat mengetahui sampai tingkatan spesies atau subspesies isolat
bakteri
 2. Rumusan masalah

a. Bagaimana cara melakukan identifikasi mikroba

secara molekuler?
b. Bagaimana cara menentukan spesies mikroba
dengan menggunakan data yang terdapat pada
gene bank?
c. Jenis mikroba apa yang ditemukan berdasarkan
penyocokan data pada gene bank?
 3. Manfaat

a. Mampu mengetahui cara identifikasi mikroba

secara mikrobiologi molekuler
b. Mampu mengetahui cara menentukan jenis
mikroba secara bioteknologi menggunakan data
yang terdapat pada website National Center
Biotechnology information
 4. Tujuan

Melakukan analisis spesies bakteri menggunakan molekul

16S r-RNA dan mencocokkan dengan data yang terdapat
di website National Center Botechnology Information
 TINJAUAN PUSTAKA

Stapilo.
 Polymerase Chain Reaction, PCR

(Polymerase Chain Reaction, PCR) adalah suatu metode

enzimatis untuk amplifikasi DNA dengan cara in vitro. Pada proses
PCR diperlukan beberapa komponen utama, yaitu DNA cetakan,
Oligonukleotida primer, Deoksiribonukelotida trifosfat (dNTP),
Enzim DNA Polimerase, dan Komponen pendukung lain adalah
senyawa buffer. Pada proses PCR menggunakan menggunakan alat
termosiklus. Sebuah mesin yang memiliki kemampuan untuk
memanaskan sekaligus mendinginkan tabung reaksi dan mengatur
temperatur untuk tiap tahapan reaksi. Ada tiga tahapan penting
dalam proses PCR yang selalu terulang dalam 30-40 siklus dan
berlangsung dengn cepat yaitu denaturasi, anneling, dan
pemanjangan untai DNA. Produk PCR dapat diidentifikasi melalui
ukurannya dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa. Teknik
PCR dapat dimodifikasi ke dalam beberapa jenis diantaranya : PCR-
RFLP, PCR RAPD, nested- PCR,Quantitative- PCR, RT- PCR dan
inverse PCR. Keunggulan PCR dikatakan sangat tinggi. Hal ini
didasarkan atas spesifitas, efisiensi dan keakuratannya.
 Pada proses PCR diperlukan beberapa komponen utama adalah :
a. DNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan. DNA
cetakan yang digunakan sebaiknya berkisar antara 105 106
molekul. Dua hal penting tentang cetakan adalah kemurnian dan
kuantitas.
b. Oligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek
(18 28 basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali
sintesis rantai DNA. Dan mempunyai kandungan G + C sebesar 50
60%.
c. Deoksiribonukelotida trifosfat (dNTP), terdiri dari dATP, dCTP,
dGTP, dTTP. dNTP mengikat ion Mg2+ sehingga dapat mengubah
konsentrasi efektif ion. Ini yang diperlukan untuk reaksi
polimerasi.
d. Enzim DNA Polimerase, yaitu enzim yang melakukan katalisis
reaksi sintesis rantai DNA. Enzim ini diperoleh dari Eubacterium
yang disebut Thermus aquaticus, spesies ini diisolasi dari taman
Yellowstone pada tahun 1969. Enzim polimerase taq tahan
terhadap pemanasan berulang-ulang yang akan membantu
melepaskan ikatan primer yang tidak tepat dan meluruskan
wilayah yang mempunyai struktur sekunder.
e.Komponen pendukung lain adalah senyawa buffer.
Larutan buffer PCR umumnya mengandung 10
50mM Tris-HCl pH 8,3-8,8 (suhu 20o C); 50 mM
KCl; 0,1% gelatin atau BSA (Bovine Serum Albumin);
Tween 20 sebanyak 0,01% atau dapat diganti dengan
Triton X-100 sebanyak 0,1%; disamping itu perlu
ditambahkan 1,5 mM MgCl2.

Pada proses PCR menggunakan menggunakan

alat termosiklus. Sebuah mesin yang memiliki
kemampuan untuk memanaskan sekaligus
mendinginkan tabung reaksi dan mengatur
temperatur untuk tiap tahapan reaksi.
 Skema kerja

Dilakukan Diperoleh PCR

ekstraksi DNA Genom DNA
hingga molekul (menggandakan
Mikroba (16S r-RNA)
DNA lepas fragmen tertentu
dengan cara
meningkatkan
suhu )

Dilakukan analisis
Pengolahan data bioedit
data Blast-N pada Sequensing Fragmen 16S r-
website RNA
http://www.ncbi.nlm.
nih.gov
 analisis data Blast-N pada website
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
Dibuka website http://www.ncbi.nlm.nih.gov

Klik Blast
Diklik nukleotide blast
Dimasukan sequen data basa organik kedala kolom fasta

Input data
Klik BLAST
Pada bagian description dipklik hasil yang palin atas
 Hasil
Grafik
NCBI tree
viewer
example
 PEMBAHASAN
Identifikasi mikroba secara molekuler pada
percobaan dilakukan dengan menggunakan rantai DNA
yang terdiri dari basa-basa organik. maka dari itu sering
digunakan alat yang di sebut PCR karna PCR dapat
mensintesis dan amplifikasi DNA secara invitro.
Pada percobaan ini berdasarkan hasil input sequen
basa nitrogen PCR ke dalam software NCBI yang mampu
mengidentifikasi mikroba berdasarkan data nukleotida
suatu mikroba. Berdasarkan hasil input data basa nitrogen
ke dalam software maka akan diperoleh data berupa
pasangan basa secara berurutan. Berdasarkan hasil input
diketahui bahwa data yang diperoleh adalah bakteri
Pseudomonas aeruginosa.
 KESIMPULAN
Berdasarkan hasil sequen fragmen 16S r-RNA yang
dimasukkan diketahui bahwa sequen tersebut
memiliki kesamaan dengan bakteri Pseudomonas
aeruginosa berdasarkan hasil Blast pada website
http://www/ncbi.nlm.nih.gov.
 Daftar Pustaka

1. Pratiwi, S. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta :

Erlangga
2. http://www/ncbi.nlm.nih.gov.
3. https://laurentsihotang.files.wordpress.com/2014/06/m
acam-macam-pcr-dan-metode-edman-laurent.pdf