Pendahuluan
• DNA: polimer untai ganda yg tersusun dari
deoksiribonukleotida (dari basa purin atau
pirimidin, gula pentosa,dan fosfat).
Resuspensi:
DNA yang bersih diresuspensi dalam buffer untuk
meyakinkan stabilitas dan penyimpanan jangka panjang.
Buffer yang umum digunakan untuk resuspensi yaitu
1xTE.
Overview Ekstraksi DNA
Sentrifugasi
untuk
memisahkan
DNA dari garam
dan gula terlarut
Larutkan DNA Cuci pelet DNA
dalam buffer dengan etanol dan
(resuspensi) keringkan pelet
Ekstraksi DNA pada Prokariot
• Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau
pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan
baik dengan cara mekanis seperti sonikasi,
tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara
enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah
berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel
yang relatif lunak dapat dengan mudah
diresuspensi di dalam medium bufer
nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang
lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen
yang kuat seperti triton X-100 atau dengan
sodium dodesil sulfat (SDS).
Ekstraksi DNA pada Eukariot
• Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan
perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis,
remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya
pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi.
Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau
pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian
disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan
proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan
remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga
perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari
RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian
dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan
alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan
CaCl .
• Isolasi DNA kromosom
• DNA kromosom diisolasi menggunakan metode lisis berbasis enzimatis yang
merupakan modifikasi dari metode yang dikemukakan oleh Klijn et al.(1991). Pelet sel
disuspensi dalam 200 μL bufer Tris Cl (pH 8,0) yang mengandung 8 mg/mL lisozim dan
diinkubasi pada temperature 37°C selama 1 jam. Sel kemudian dilisis dengan
penambahan 200 μL bufer lisis yang mengandung SDS 2%, 0,8mg/mL proteinase K,
dan 200 mM EDTA pH 8,0. Proses lisis dilakukan pada temperatur 50°C selama 30
menit. Selanjutnya ditambahkan 150 μL larutan C dingin (60 mL CH3COOK 5M; 11,5
mL asam asetat glasial; 28,65 mL H2O) dan divorteks selama 10 detik. Campuran
kemudian diinkubasi dalam es selama 5 menit dan selanjutnya disentrifugasi pada
12.000 x g, 4°C selama 20 menit. Supernatant dipindahkan ke dalam tabung
mikrosentrifuga baru. Selanjutnya, DNA diendapkan dengan penambahan 0,6 volum
isopropanol dan diinkubasi pada temperatur ruang selama 1 jam. Setelah dilakukan
sentrifuga selama 15 menit pada 12.000 x g, pellet DNA dicuci dengan 70% etanol,
dikeringkan, dan akhirnya dilarutkan dalam ddH2O.