SEMINAR HASIL PENELITIAN

PERBANDINGAN KLORAMFENIKOL SECARA TUNGGAL DAN

KOMBINASI DENGAN AMOKSISILIN TERHADAP
PENGHAMBATAN DAN RESISTENSI Staphylococcus aureus

ARIEF RAHMATULLAH
2131210052

Pembimbing 1 : dr. H.R.M. Hardadi Airlangga, Sp.PD

Pembimbing 2 : Rio Risandiansyah, S.Ked, MP, PhD
Tim Kelayakan: Dr. dr. Doti Wahyuningsih, M.Kes
 Latar Belakang

Centers for Disease Control and Prevention  2 juta orang yang

terinfeksi bakteri yang resisten terhadap antibiotik dan 25 ribu
diantaranya meninggal.

WHO  setiap tahunnya selalu ada kasus baru dari multidrug-

resistant tuberculosis (MDR-TB) dan menyebabkan 150.000 kasus
kematian

Nurmala et al (2015)  Salah satu antibiotik yang diketahui tingkat

sensitifitasnya terhadap beberapa bakteri tidak tinggi adalah
kloramfenikol.

Salah satu bakteri penyebab infeksi tersering di dunia dan penyebab

infeksi nosokomial yang banyak terjadi di Indonesia adalah S.aureus.
 Latar Belakang

Resistensi • Kejadian resistensi antibiotik dapat muncul

dikarenakan oleh proses mutasi.

Mutasi • Mutasi terbagi menjadi 2

yaitu spontaneous & induced

• Senyawa pada anibiotik dapat memicu

induced terjadinya mutasi.
mutation • Tidak tepatnya dosis dan indikasi
penggunaan antibiotik.

Presentase penggunaan antibiotik yang tidak tepat atau tidak

berdasarkan indikasi yang mencapai 30%-80% di berbagai
rumah sakit (Kemenkes RI,2011)
 Latar Belakang

Bollenbach,2015  Antibiotik
kombinasi dapat mengatasi masalah
resistensi.

Suharjono (dikutip dalam

Friambodo et al 2007)
Kloramfenikol pada umumnya
dikombinasi dengan antibiotik
seperti amoksisilin yang digunakan
pada kasus demam typhoid.
 Permasalahan Penelitian
1. Bagaimana perbandingan kadar hambat minimum antibiotik kloramfenikol pada
S.aureus yang di induksi antibiotik kloremfenikol tunggal dan kombinasi dengan
amoksisilin secara subletal?
2. Bagaimana perbandingan frekuensi mutasi resistensi antibiotik kloramfenikol pada
S.aureus yang di induksi antibiotik kloremfenikol tunggal dan kombinasi dengan
amoksisilin secara subletal?

Tujuan Penelitian

1. Mengetahui perbandingan kadar hambat minimum antibiotik kloramfenikol pada

S.aureus yang di induksi antibiotik kloremfenikol tunggal dan kombinasi dengan
amoksisilin secara subletal .
2. Mengetahui perbandingan frekuensi mutasi resistensi antibiotik kloramfenikol pada
S.aureus yang di induksi antibiotik kloremfenikol tunggal dan kombinasi dengan
amoksisilin secara subletal
 Manfaat Penelitian

1. Memberikan landasan ilmiah untuk mengetahui perubahan daya

bunuh kombinasi antibiotik terhadap S.aureus.
2. Memberikan landasan ilmiah untuk mengetahui perbandingan
kemungkinan bakteri resisten terhadap antibiotik pada pemberian
antibiotik tunggal dan kombinasi subletal.
Kerangka Konsep
Penelitian
 Hipotesis

H0 :
• Tidak terdapat perbedaan KHM Kloramfenikol tunggal dan kombinasinya
dengan Amoksisilin terhadap bakteri S.aureus

• Tidak terdapat peningkatan frekuensi mutasi bakteri S.aureus dengan

pemberian Kloramfenikol tunggal dan dengan kombinasi Amoksisilin secara
subletal.

H1 :
•Terdapat perbedaan KHM Kloramfenikol tunggal dan kombinasinya dengan
Amoksisilin terhadap bakteri S.aureus.

•Terdapat peningkatan frekuensi mutasi bakteri S.aureus dengan pemberian

Kloramfenikol tunggal dan dengan kombinasi Amoksisilin secara subletal.
METODOLOGI PENELITIAN
RANCANGAN PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitia

Penelitian ini akan dilaksanakan secara Waktu:

eksperimental laboratorium secara in
September 2017–November 2017
vitro, untuk mengetahui uji resistensi
Tempat:
laju mutasi bakteri S. aureus terhadap
Laboratorium Biokimia
antibiotik Amoksisilin dan
Fakultas Kedokteran UNISMA
Kloramfenikol.
 Uji KHM Antibiotik Tunggal
Lakukan
Tambahkan 100µl
Inokulan bakteri S. mikrodilusi 100µl
bakteri ke masing-
aureus diambil NB dan 100µl
masing well
Kloramfenikol

Dimasukkan ke
Bakteri didilusi Inkubasi pada
dalam tabung
hingga kepadatan suhu 370C selama
steril berisikan
105 CFU/mL 18-24 jam
NaCl 0,9%

Kekeruhannya Diperoleh suspensi Uji hasil KHM

dibandingkan bakteri dengan menggunakan
dengan indikator kepadatan 108 spektofotometer
McFarland CFU/mL epoch OD 600
 Uji KHM Antibiotik Kombinasi

Amoksisilin yang telah didilusi diambil 25µl

dari 4 kali KHM
Kloramfenikol yang telah didilusi diambil
25µl dari 4 kali KHM

Dimasukkan ke Uji hasil KHM

dalam well ditambah menggunakan
50µl NB dan spektofotometer
didilusikan epoch OD 600

Ditambahkan 50µl
Inkubasi pada suhu
bakteri 105CFU/ml
370C selama 18-24
pada masing-masing
jam
well dan didilusikan
 Frekuensi Mutasi : Induksi Antibiotik

96-Well plate dibagi menjadi 3 kategori: tidak diinduksi, induksi antibiotik tunggal,
induksi dengan antibiotik kombinasi

Tidak diinduksi: 50µl bakteri + 50µl NB

Inkubasi pada
suhu 370C
Induksi antibiotik tunggal: 25 µl Kloramfenikol 0,5 KHM + 25µl NB + 50µl bakteri
selama 18-24
jam
Induksi antibiotik kombinasi: 25 µl antibiotik kombinasi 0,5 KHM + 25µl NB + 50µl bakteri
 Frekuensi Mutasi : Seleksi Antibiotik

Masing-masing kategori
dibagi menjadi 2
kelompok: selektif dan
non selektif

Bakteri Diamati pertumbuhannya

menggunakan spektofotometer epoch OD 600
Kelompok non selektif pada jam ke 1/2, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 16, 24
ditambahkan 100µl NB 4x didilusi hingga kepadatan 105 CFU/mL

Kelompok selektif
ditambahkan 50µl NB 4x
Inkubasi pada suhu 370C
dan 50µl antibiotik
tunggal 1x KHM
 Serial Passage

6 cawan petri diisi dengan

media NA dengan seleksi
1 kali KHM antiobiotik
amikasin

cawan petri 16 kotak yang diisi

dengan 10 µl yang diambil dari Dihitung frekuensi
masing masing well plate dan
mutasi dengan rumus
satu kotak dikosongkan sebagai
pembanding

Diamati
Inkubasi pada suhu
pertumbuhannya
370C selama 24 jam
secara visual
 Analisa Data

Data yang diperoleh dari proses pembacaan pada spektrofotometer epoch dengan
menggunakan program GEN5(TM) berupa pertumbuhan bakteri. Kemudian, data
tersebut akan dibuat diagram untuk melihat pola dan tingkat pertumbuhan
menggunakan program Microsoft Excel dengan menghitung Mean, Median, Maximum,
Minimum, Q1 dan Q3. Selanjutnya, tingkat pertumbuhan diuji statistik menggunakan
ttest antara beberapa perlakuan dengan menggunakan program Microsoft Excel.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji KHM Kloramfenikol dan Kombinasi dengan
Amoksisilin

Berdasarkan 3 tabel diatas, hasil yang didapatkan adalah kadar hambat minimum antibiotik tunggal klora
mfenikol terdapat pada konsentrasi 1/8 sebesar 0,125 mg/ml dengan tingkat pertumbuhan ±0,366 pada
absorbansi OD 600. Sedangkan antibiotik tunggal amoksisilin didapatkan nilai konsentrasi KHM sebesar
1/1024 atau 0,0004 mg/ml. Pada antibiotik kombinasi kadar hambat minimum kloramfenikol terdapat p
ada konsentrasi 1/32 atau sebesar 0.007 mg/ml dengan tingkat pertumbuhan ±0,471. Uji kadar hambat
minimum pada kloramfenikol mengalami perubahan KHM pada uji secara tunggal dan dengan kombinas
i.
 KHM Kloramfenikol Tunggal

Penelitian uji KHM pada bakteri S.aureus yang dilakukan oleh CLSI (Clinical and Laborator
y Standarts Institute) kloramfenikol menunjukkan nilai KHM ≤8 µg/ml yang termasuk katego
ri sensitif dan ≥32 µg/ml yang termasuk kategori resisten. Jika dibandingkan dengan hasil
penelitian ini, maka kloramfenikol menunjukkan nilai KHM yang termasuk kategori resisten.
 KHM Kloramfenikol dengan Kombinasi Amoksisilin
Berbeda dengan hasil uji KHM tunggal, pada uji KHM kombinasi kloramfenikol dan amoksisilin nilai K
HM menunjukkan nilai konsentrasi yang lebih rendah dibandingkan dengan kloramfenikol tungga
l.Hal ini dapat berkaitan dengan interaksi obat antara kloramfenikol dengan amoksisilin yang diketa
hui memiliki mekanisme kerja yang berbeda dimana kloramfenikol berkerja di ribosom dan amoksisilin
yang berkerja di dinding sel bakteri. Interaksi obat antara kloramfenikol dan amoksisilin diketahui bersif
at antagonistik dan menimbulkan efek yang merugikan pada interaksi farmakodinamik kombinasi ini. Si
fat antagonistik dari interaksi kombinasi obat memliki efek yang lebih rendah atau dibawah ekspektasi t
erapi.
Perbandingan Pertumbuhan tiap 4 Jam pada Media
Selektif dan Non Selektif

Laju pertumbuhan pada kelompok A (Non selektif, non induksi) dibandingkan deng
an kelompok B (Selektif, non induksi) menunjukkan perbedaan signifikan pada tiap
4 jam pemeriksaan kecuali pada jam 4-8 masa inkubasi yang menunjukkan tidak ad
a perbedaan yang signifikan antara laju pertumbuhan kelompok A dengan B
Perbandingan Pertumbuhan tiap 4 Jam pada Media
Selektif dan Non Selektif

Sedangkan perbandingan pada kelompok C (Non selektif, induksi kloramfenikol ¼ KHM)

dengan kelompok D (Selektif, induksi kloramfenikol ¼ KHM) menunjukkan perbedaan
signifikan pada jam 0,5-1, 1-4 dan 8-12 masa inkubasi (p<0,05) dan pada jam 4-8, 12-16 dan
16-24 masa inkubasi menunjukkan tidak adanya perbedaan yang signifikan.
Perbandingan Pertumbuhan tiap 4 Jam pada Media
Selektif dan Non Selektif

Pada grafik perbandingan kelompok E (Non selektif, induksi kloramfenikol + amoksisilin ¼

KHM) dengan kelompok F (Selektif, kloramfenikol + amoksisilin ¼ KHM) perbedaan yang
signifikan laju pertumbuhan bakteri ditemukan di jam 0,5-1, 1-4, 4-8, 16-24 masa inkubasi (p
<0,05) sedangkan pada jam 8-12 dan 12-16 tidak ada perbedaan yang signifikan antara kelom
pok E dengan F.
Analisa Pola
Pertumbuhan
Media Selektif &
Non Selektif
 Analisa Pola Pertumbuhan Media Selektif & Non Selektif

Berdasarkan uji t test, kelompok A (media non seleksi, non induksi) menunjukkan perbedaan
signifikan dengan kelompok B pada semua jam pemeriksaan dengan signifikansi (p<0,05). B
egitu pula antara kelompok C dengan kelompok D dan antara kelompok E dengan kelompok
F yang menunjukkan perbedaan signifikan pada setiap jam pemeriksaan.
 Analisa Pola Pertumbuhan Media Selektif & Non Selektif

• Pola pertumbuhan pada kelompok A pada penelitian ini yang merupakan kelompok
dengan media non selektif dan non induksi dianggap sebagai pola pertumbuhan
normal bakteri. Pada fase pertumbuhan lag, log dan death di semua kelompok
memiliki pola pertumbuhan yang sama dengan kelompok A. Sedangkan pada
fase stasioner hanya kelompok E yang memiliki pola berbeda yaitu pada jam ke 8-
12 masa inkubasi. Kesamaan lainnya pada semua kelompok yaitu adanya kenaikan
pertumbuhan pada jam ke 16-24 masa inkubasi.
 Analisa Pola Pertumbuhan Media Selektif & Non Selektif

• Ada beberapa alasan mengapa peningkatan pertumbuhan bisa terjadi di akhir masa
inkubasi salah satunya adalah terjadinya fase long-term stationary atau fase
stasioner jangka Panjang. Pada fase setelah death phase bakteri yang mati akan
mengeluarkan nutrien ke lingkungannya. Nutrien dan substansi yang ada di
lingkungan kultur ini akan dimanfaatkan oleh bakteri yang masih tersisa untuk
bertahan hidup. Hal inilah yang memicu terjadi fase stasioner jangka Panjang yang
bisa berlangsung selama beberapa minggu hingga bulan
Pada kelompok non selektif yaitu kelompok A,C dan E rata-rata jumlah bakteri yang tumbuh
cukup tinggi dibandingkan dengan rata-rata jumlah bakteri kelompok B,D dan F yang
merupakan kelompok selektif yang menggunakan kloramfenikol. Kloramfenikol merupa
kan antibiotik berspektrum luas diketahui bersifat bakteriostatis. Kloramfenikol memasuki
bakteri dengan proses yang bergantung pada energi. Aktivitas antibiotiknya disebabkan oleh
hambatan kompetitif untuk mengikat aminoasil tRNA ke domain peptidyltransferase subunit
50S. Sifat bakteriostatik dari kloramfenikol inilah yang memungkinkan kloramfenikol m
enghambat pertumbuhan bakteri S.aureus seperti yang terjadi pada kelompok B,D dan F
Pada hasil perhitungan frekuensi mutasi didapatkan hasil tingkat frekuensi mutasi kelompok dengan indu
ksi kloramfenikol ¼ KHM lebih tinggi (CD) dibandingkan kelompok tanpa induksi dan dengan induksi
kombinasi kloramfenikol + amoksisilin ¼ KHM. Pemberian dosis subletal diketahui dapat menimbulka
n beberapa efek terhadap bakteri seperti penurunan pembentukan biofilm, pengeluaran atau sekresi toksi
k sampai dengan peningkatan transfer gen dan frekuensi mutasi dari bakteri. Proses mekanisme resiste
nsi ini dapat berlangsung karena bakteri merespon antibiotik dan mengekspresikan gen spesifik terhada
p senyawa kloramfenikol yaitu gen CAT (Chloramphenicol Acetyltransferase).
 KESIMPULAN

1. Kloramfenikol tunggal memiliki nilai KHM (Kadar Hambat Minimum) yang lebih
tinggi yaitu 0,125 mg/ml dibandingkan dengan kombinasi amoksisilin yaitu sebesa
r 0,007 mg/ml terhadap bakteri Staphylococcus aureus.
2. Kurva pola pertumbuhan pada bakteri S.aureus menunjukkan pola pertumbuhan ya
ng rendah berdasarkan rata-rata jumlah pertumbuhan bakteri pada media selektif kl
oramfenikol 1x KHM.
3. Kelompok dengan induksi kloramfenikol ¼ KHM memiliki tingkat frekuensi muta
si yang tinggi dibandingkan dengan kelompok non induksi dan kelompok induksi
kombinasi kloramfenikol dengan amoksisilin.
 SARAN

1. Melakukan uji KHM (Kadar Hambat Minimum) dan resistensi

antibiotik kombinasi dengan variasi konsentrasi yang berbeda antar
antibiotik kloramfenikol dan amoksisilin.
2. Melakukan uji resistensi antibiotik dengan menambahkan media
selektif kombinasi kloramfenikol dan amoksisilin untuk mengetahui
perbedaan sensitifitas dan toleransi antibiotik tunggal dan kombinasi.
3. Melakukan uji konfirmasi dengan penambahan konsentrasi KBM
(Kadar Bunuh Minimum) selain menggunakan KHM.
4. Melakukan identifikasi strain Staphylococcus aureus menggunakan
sekuensi ribosom pada S.aureus.
TERIMA KASIH