2016

STRATEGI INSERSI GEN HE-SOD (HUMAN

EXTRACELLULAR SUPEROXIDE DISMUTASE )
TERMODIFIKASI PADA TANAMAN TEMBAKAU
Kelompok 2
Abdullah
Diah Laraswati
M. Zaki Zahirsyah
Riska Amalia
Woro Bismo
 2016

TINJAUAN PUSTAKA
Human Extracellular Superoxide
Dismutase (He-SOD)

Metalloenzyme tetramerik yang bertanggung

jawab untuk menghilangkan anion superoksida
dari ekstraselular

Variannya adalah enzimatis aktif (AEC-

SOD) dan tidak aktif (IEC-SOD)

Karena adanya aktivitas antioksidan,

HEC-SOD telah digunakan sebagai
terapi protein untuk mengobati penyakit
kulit dan radang sendi
Bakteri Agrobacterium Tumefaciens

1
Agrobacterium adalah genus
dari bakteri gram negatif yang
ditemukan oleh H.J.Conn yang
digunakan untuk transfer gen
secara horizontal yang
menyebabkan tumor

Crown gall tumor

2
A. Tumefaciens adalah bakteri
Secara alami, A. 4 pathogen pada tanaman yang
tumefaciens dapat banyak digunakan untuk
menginfeksi tanaman dikotil memasukkan gen asing ke
melalui bagian tanaman yang Bakteri yang tergolong ke 3 dalam sel tanaman untuk
terluka sehingga dalam gram negatif ini memiliki menghasilkan suatu tanaman
menyebabkan crown gall sebuah plasmid besar (lebih dari transgenik.
tumor 200 kb) yang disebut plasmid-Ti
5 yang berisi gen penyandi faktor
Tumor terjadi karena adanya virulensi penyebab infeksi bakteri
proliferasi sel-sel yang tidak ini pada tanaman
terkoordinasi
 2016

STRATEGI INSERSI GEN HE-SOD

TERMODIFIKASI KE DALAM TANAMAN
TEMBAKAU
 TEKNIK PEMINDAHAN GEN SECARA TIDAK
LANGSUNG
Sel-sel tumbuhan tidak mengandung plasmid alami
yang dapat digunakan sebagai vektor kloning Teknik pemindahan gen
secara tak langsung

Agrobacterium-mediated Transformation (AMT)

Prinsip dasar menggunakan Agrobacterium

sebagai alat untuk manipulasi genetik tanaman
adalah untuk memasukkan DNA asing ke dalam
T-DNA dari sel bakteri dan mengandalkan bakteri
untuk mentransfer atau mengintegrasikan DNA.
Plasmid Ti dalam Agrobacterium Tumefaciens

CIRI- Berukuran lebih dari 200 kb

Membawa banyak gen yang

CIRI terlibat dalam proses infeksi

Setelah infeksi, sebagian dari

molekul ini akan berintegrasi
dalam DNA kromosom.
SIFAT
10% DNA plasmid Ti dapat
berintegrasi dengan DNA nukleus

• kemampuan untuk berintegrasi ini memungkinan plasmid Ti dpt dipakai sbg vektor untuk
menyisipkan gen asing ke dalam genom tanaman
T-DNA
(Transfer
DNA)
Prinsip Dasar T-DNA
(Transferred
DNA)
Menginfeksi tanaman secara alami karena memiliki plasmid Ti.

gen yang menyandikan

sifat virulensi untuk
menyebabkan penyakit
tanaman tertentu

Gen He-SOD yang A. tumefaciens secara DNA asing menyatu sifat-sifat yang
telah dimodifikasi langsung dapat dengan DNA diinginkan dapat
dengan penambahan memindahkan gen tanaman diekspresikan
GFP dapat disisipkan pada plasmid tersebut tumbuhan.
di dalam plasmid Ti ke dalam genom
(DNA) tanaman
Diagram Alir
6 7
1
Konjugasi Bakteri
Isolasi gen He-SOD
E.Coli dengan
dengan Metode Seleksi
Agrobacterium
Fenol-Kloroform
Tumaficens

2 5 8
Pemilihan Vektor dan
Transformasi Vektor Isolasi dan Pemurnian
Host Sel (Bakteri
kedalam Host Sel Plasmid DNA
E.Coli)

3 4 9 Mekanisme
Modifikasi gen He- Agrobacterium
SOD menggunakan Ligasi gen He-SOD Mediated
PCR Transformation ke
Tanaman Tembakau
1 Strategi Pengisolasian gen He-SOD Pemisahan
Ekstraksi Fenol-Kloroform
Prinsip :
Pemisahan campuran molekul yang didasari pada perbedaan kelarutan antar molekul dalam
dua larutan yang saling tercampur. Metode ini digunakan untuk proses isolasi baik berupa RNA,
DNA, ataupun protein.

Alat dan Bahan yang digunakan dalam Pengisolasian :

Larutan fenol-kloroform (1:1)
Asam nukleat yang akan dipurifikasi
buffer TE (pH 7,8)
Kloroform
Etanol
Pipetor otomatis dengan ujung yang dapat dibuang
Tabung berisi polipropilen
Pipet
Alat sentrifugasi
1
Tahapan Pengisolasian
1 Memindahkan sampel
asam nukleat ke dalam
tabung berisi polipropilen,
selanjutnya
menambahkan volume
yang sesuai untuk larutan
fenol-kloroform
6 7
Menambah kloroform
Memulihkan asam nukleat
untuk membersihkan
melalui presipitasi standar
asam nukleat dari fenol
menggunakan etanol
yang tersisa

2 5 8
Mengulang tahap 1-4
Mencampur komponen di
hingga tidak terlihat
dalam tabung sehingga Didapatkan hasil isolasi
protein lain yang tersisa
terbentuk emulsi
pada interfasa

3 Mensetrifugasi campuran
4
pada kecepatan sebesar
Menggunakan pipet
80% kecepatan
untuk memindahkan fase
maksimum selama 1 menit
aqueous ke tabung lain.
pada temperatur kamar
Membuang bagian
hingga fase organik dan
interfasa dan fase organik
fase aqueous benar-
benar terpisah
2 Pemilihan Host Cell untuk
Modifikasi Gen He-SOD

Host Cell – E. Coli DH5α

2 Host Cell – Agrobacterium
tumefaciens
Memiliki jangkauan strain yang
sangat luas

Mampu mentransformasikan
fungi

Dapat digunakan sebagai perantara apabila

ingin memasukkan gen tertentu ke dalam
berbagai jenis tumbuhan
3 Modifikasi gen He-SOD
menggunakan PCR
Sekuens Gen He-SOD
 3
Plasmid pSiM24

◦ Memiliki promoter M24

◦ Memiliki 3 daerah MCS
◦ Terdapat gen trfA untuk
Agrobacterium, ori untuk E.
Coli, gen AmpR untuk
resistansi terhadap ampicilin
 3
Plasmid pSiM24
5’ –
AGCT

TGCA –
3’
 3
Primer PCR

FORWARD PRIMER
%GC = 11/21 = 52,38%
5’ – AAGCTT – ATG CTGGCGCT ACTG – 3’ Tm = 20 + 44 = 64°C

REVERSED-COMPLEMENT PRIMER
5’ – AAGGCCGCC TGA – CTGCAG – TAT – 3’ %GC = 12/21 = 57,14%
Tm = 18 + 48 = 66°C
5’ – ATA – CTGCAG – TCA GGCGGCCTT – 3’
3
PRODUK AKHIR PCR & LIGASI

... G GATCC Gen

GCATG C ...
pSiM24 He-SOD pSiM24
... CCTAG G C GACTGC ...

Ligasi: Enzim T4 DNA Ligase

(Kofaktor: ATP)

1. Hidrolisis ATP: Ppi

2. Kompleks enzim – adenilat AMP: Ikatan fosfodiester
3. Penutupan nick
4. Pelepasan AMP & enzim adenilat
3
MODIFIKASI PLASMID

Untuk mencegah self-ligation, gugus fosfor

pada ujung 5’ dihilangkan menjadi 5’-OH
(Defosforilasi)

Defosforilasi dilakukan oleh enzim alkalin fosfatase

yang memutus ikatan fosfodiester
4
LIGASI

• Mempertahakan Penambahan
PH • Menggunakan
• Agar DNA tidak ddH2O enzim T4 DNA
terdegradasi ligase
• Dapat
melarutkan dna
dengan baik
Penambahan • Berguna untuk
Buffer pemurnian Metode Ligasi
4 Metode Ligasi oleh T4 DNA Ligase
• 2 μl vektor + Tambahkan 6 μl
1 insert

• T4 DNA ligase 0,5 μl selama 5 menit

2

• Tambahkan 1 μl buffer ligasi +

3 Tambahkan 0.4 μl T4 ligase

• Tambahkan 0,5 μl dd H2O

4

• Inkubasikan pada 4oC

5

Sumber: slideshare.net
5 Transformasi vektor ke host sel
6
Seleksi (Blue-White Screening)
 6
Seleksi (Resistensi Antibiotik)
Prinsip : identifikasi bakteri rekombinan (keberhasilan ligasi) berdasarkan ketahanan terhadap ampicilin
yang terdapat dalam vektor yang digunakan.

Plasmid atau vektor yang mengandung segmen gen resisten mampu

tahan hidup dalam medium antibiotik yang diberikan. Apabila proses
restriksi berada pada daerah segmen gen resisten, maka ampicilin akan
membunuh bakteri (tidak resisten)
Seleksi Antibiotik

Bakteri hidup : Bakteri mati :

Daerah restriksi tidak Daerah restriksi
mengenai segmen mengenai segmen gen
gen resisten amp resisten amp sehingga
sehingga ampicilin ampicilin yang
yang diberikan akan diberikan tidak dapat
terkode oleh gen terkode dan bakteri
resisten ampicilin akan terbunuh.
7
Isolasi dan Pemurnian Plasmid
•Pemurnian ini didasarkan pada denaturasi
diferensial dari kromosom dan DNA
plasmid untuk memisahkan keduanya.
Bakteri akan lisis dengan larutan yang
mengandung sodium Dodecyl Sulfat (SDS)
dan Sodium Hidroksida.
•Kromosom serta DNA plasmid akan
terdenaturasi.
•Netralisasi berikutnya dengan kalium
asetat memungkinkan hanya plasmid DNA
kovalen tertutup untuk reanneal.
•Sebagian besar DNA kromasomal dan
protein mengendap dalam kompleks
yang terbentuk dengan kalium dan SDS,
yang dihilangkan oleh sentrifugasi.
•Plasmid DNA terkonsentrasi dari
supernatan dengan presipitasi etanol.
Alkaline
Lysis
•Prosedur boiling lysis cepat untuk
dilakukan sehingga cocok untuk
screening sejumlah besar-kecil volume
kultur Escherichia coli.
•Kualitas DNA plasmid yang terisolasi
lebih rendah dibandingkan dengan
menggunakan metode alkaline lysis.
•Bakteri akan lisis dengan pemberian
lisozim, triton, dan panas. DNA
kromosomal tetap melekat pada
membrane bakteri dan dihilangkan
oleh proses sentrifugasi. Plasmid DNA
tetap di supernatan yang kemudian
diendapkan dengan isopropanol.
Boiling
Lysis
7 5 mL medium LB yang mengandung antibiotik yang sesuai
Bakteri pellet dari kultur
diinokulasi dengan satu koloni bakteri. Tube telah diinkubasi
pada 10.000x gr selama 5 Buang supernatant.
pada 37°C semalaman dengan pengocokan yang kuat
menit pada suhu ruang.
pada 360rpm.

Tambahkan 2mL 0.2N NaOH/1.0% SDS Tambahkan 1.5 mL ice-cold solution

Resuspen bakteri pellet dalam 1 mL es
pada suspense. Campur dengan III pada lisat. Campur dengan
batu I (50 mM). Divortex seperlunya
mengulangi pada arah berlawanan mengulangi pada arah berlawanan
untuk resuspensi bakteri secara penuh.
secara halus. Jangan divortex. secara halus. Jangan divortex.

Tambahkan 2.5 volume

isopropanol untuk presipitasi
Recover plasmid DNA. Campur
Disentrifuge pada 15500 x g Disentrifuge pada 15500 x g
menghasilkan seluruhnya dengan
untuk 30 menit pada 4oC. untuk 30 menit pada 4oC.
supernatant. mengulangi pada arah
berlawanan secara halus.
Jangan divortex.

Mencuci pellet pada ice-

Penghilangan Tambahkan ddH20 atau TE untuk memecah
cold 70% EtOH dan udara
menghasilkan supernatant. pellet. Setelah penambahan 2ul RNase A (10
kering selama 10 menit
Pellet yang terbentuk mg/mL), campuran diinkubasi selama 20 menit
agar EtOH dapat
adalah plasmid DNA. pada suhu ruang untuk menghilangkan RNA.
menguap.
8
Sistem Vektor Kointegrasi → Konjugasi

Elektroforasi
dikonsentrasikan
Cointegrated
E. Coli Ti Plasmid + He-SOD
20 kali dalam
gliserol 15%
Vector intermediet sebagai bakteri termodifikasi dalam
donor
A. tumefaciens
Sentrifugasi
7,500 × g selama
3 menit

Disarmed Ti Inkubasi
selama 5 jam
Elektroforasi dalam agar
Plasmid Sentrifugasi
Luria-Bertani (LB)

Sebagai bakteri resipien diambil dari A.

tumefaciens yang berada dalam
pertengahan fase log
Inkubasi
8
Pembentukan Kointermediet

Hasil perkawinan campuran akan berupa bakteri-bakteri A. tumefaciens saja,

karena vector intermediet tidak dapat bereplikasi dalam Agrobacterium
8
Pembentukan Disarmed Ti Plasmid

Sekuens penyebab
Mengambil sebuah
proliferasi sel-sel Dimasukkan
Plasmid Ti baru
yang tidak kembali ke dalam
dalam sebuah A.
terkoordinasi A. tumefaciens
tumefaciens
dihilangkan

Penghilangan virulen dari

A. tumefaciens dilakukan
agar tumbuhan transgenik
Gen auksin dan sitokinin meninduksi proliferasi sel yang dihasilkan bersifat
tak terkendali penyebab crown gall disease sehat dan bebas penyakit
9
Mekanisme Agrobacterium Mediated Transformation ke Tanaman
Tembakau
Tabel 1. Beberapa Gen Vir dan Peranannya
Dasar dari transformasi genetik oleh Agrobacterium Operon Fungsi
adalah transfer dan integrasi T-DNA ke dalam genom di VirA Mengkodekan protein reseptor acetosyringone, juga mengaktivasi
dalam inti sel tanaman. VirG dengan fosforilasi yang menyebabkan ekspresi konstitutif pada
keseluruhan gen operon

T-DNA adalah suatu bagian pada tumor inducing (Ti) VirB
plasmid yang terdapat di dalam sel Agrobacterium. Ti-
plasmid berukuran sekitar 200-800 kbp dan T-region (T-
VirC
DNA) nya sendiri berukuran sekitar 10% nya (10-30 kbp).
VirD
T-region ini dibatasi oleh dua sekuen pembatas (border)
yaitu right border dan left border yang mengapit T-region. VirE
VirF
Bagian lain dari Ti-plasmid yang tidak kalah pentingnya VirG
adalah virregion yang mengandung sejumlah gen-gen
virulen (virA, virB, virC, virD, virE, virF, virG dan virH) yang
berfungsi didalam proses transfer T-DNA ke dalam sel VirH
tanaman.
Mengkodekan protein membran, berperan dalam pembentukan
lorong konjugasi di mana T-DNA ditransportasikan
Mengkodekan enzim helikase yang merelaksasi untaian T-DNA
Aktivitas Topoisomerase; Vir D2 adalah endonuclease yang
mentarget LB dan RB
Single strand binding protein (SSBP); menempel pada T-DNA saat
transfer
Aktivitas tidak diketahui
Protein DNA-binding master controller; VirA mengaktivasi VirG
dengan fosforilasi, VirG mendimer dan menaktivasi ekspresi
konstitutif semua operon vir
Aktivitas tidak diketahui
Transformasi Agrobacterium 9

Melekatnya integrasi T-DNA ke

agrobacterium dalam genom sel
pada sel tanaman tanaman inang

terinduksinya gen-gen pada

vir-region sehingga
dihasilkan produk dari T-strand yang
expresi gen-gen virulen ditransfer ke dalam
untuk memproses T-DNA sel tanaman
dan mentransfernya dari
dalam sel bakteri
suatu signal yang spesifik didalam sel bakteri
Tahapan
9

Proses Transformasi DNA Rekombinan ke Sel Tumbuhan

(Sumber: http://staff.uny.ac.id/sites/default/files/pendidikan/ixora-sartika-marcuriani-dr-msi/handoutbiotekrekgen.pdf)
Mekanisme Detail dari pergerakan Virulensi Selama proses Transformasi Berlangsung 8
(Sumber: http://www.ejbiotechnology.info)
10 Seleksi kalus dan Regenerasi Tanaman Tembakau
Proses penyeleksian kalus. Kalus berwarna coklat tua adalah kalus
yang tidak tertransformasi, sedangkan kalus yang berwarna putih
merupakan kalus yang telah tertransformasi
(Sumber: Makziah, 2002)
• Menurut Waluyo et al. 2013 seleksi kalus tanaman menjalani
beberapa tahapan yaitu inokulasi, kokultivasi, seleksi, dan
regenerasi.
• Inokulasi dilaksanakan dengan merendam eksplan tembakau
dalam suspensi A. tumefaciens selama 30 menit.
• Setelah inokulasi, eksplan diletakkan di atas kertas saring
hingga kering, kemudian eksplan ditanam di media kokultivasi
(MS yang mengandung 1 mg/l BAP, 0,1 mg/l IAA, dan 300 µM
asetosiringon) dan diinkubasi pada kondisi gelap selama 3 hari.
• Eksplan dari media kokultivasi dicuci dengan media MS
kemudian ditanam pada media induksi kalus yang juga
merupakan media seleksi, yaitu MS yang mengandung 1 mg/l
BAP, 0,1 mg/l IAA, 20 mg/l higromisin B, 100 mg/l vankomisin dan
400 mg/l sefotaksim.
• Kalus yang tumbuh kemudian dipindahkan ke media regenerasi,
yaitu MS yang mengandung 50 mg/l higromisin dan 250 mg/l
sefotaksim.
• Tunas yang muncul dipisahkan dari kalus dan ditanam pada
media perakaran, yaitu MS yang mengandung 50 mg/l
higromisin. Tunas yang berakar dipindahkan ke media tanah.
11 Analisis ekspresi He-SOD dengan Immunoblotting

Untuk melakukan analisis immunoblotting He-SOD maka

kalus tembakau (Nicotiana benthamiana L.) yang sudah
diinfeksi A. tumefaciens harus dikultur dalam bentuk
suspensi sel. Medium dasar MS dapat digunakan
sebagai medium suspensi sel. Setelah periode kultur
selama seminggu, pelet sel dilisis menggunakan buffer
lisis. Untuk menguji He-SOD yang disekresikan secara
ekstraseluler, medium kultur dikumpulkan, disaring, lalu
dielektroforesis dengan SDS-PAGE 12%. Protein kemudian
ditransfer dari gel ke membran nitroselulosa secara
elektrik. Protein He-SOD rekombinan dideteksi
menggunakan antibodi anti-He-SOD tikus (dilusi 1:3000)
dan antibodi sekunder anti-igG tikus kambing yang
Analisis immunoblotting gen He-SOD pada tembakau
terkonjugasi dengan peroksidase lobak (1:10.000 dilusi).
(Sumber: Ki Youl Park dkk, 2015)
45 Jumlah He-SOD yang disekresikan ditentukan secara
kuantitatif dengan ELISA Hasil analisis immuno-blot dengan antibodi anti-HEC-SOD mengungkapkan
bahwa semua enam kodon-dioptimalkan f-HEC-SOD dan m-HEC-SOD
rekombinan protein diekspresikan dalam daun tembakau dengan yang
diharapkan ukuran molekul (37-38 kDa) (Gambar di atas). Di antara enam
hECSODs yang berbeda, sitosol f-HEC-SOD didominasi mengekspresikan lebih
baik dibandingkan dengan HEC-SoDs lainnya. Hasil ini menunjukkan bahwa
ekspresi sitosol dari f-HEC-SOD adalah yang paling optimal dan efisien.
Daftar Pustaka
◦ Howe, Christopher. 2007. Gene Cloning and Manipulation. New York: Cambridge University Press.
◦ Primrose, Sandy B. et.al. –. Principle of Gen Manipulation Sixth Edition. New York: Cambridge University Press.
◦ Tri J. Santoso, dkk. 2011. Konstruksi Kandidat Gen AV1 Begomovirus pada pBI121 dan Introduksinya ke dalam Tembakau Menggunakan Vektor
Agrobacterium tumefaciens. Diakses dari http://biogen.litbang.pertanian.go.id/terbitan/pdf/agrobiogen_7_1_2011_02.pdf. Diakses pada 20
November 2016 Pukul 23.00 WIB.
◦ Santoso, Tri J, dkk. 2010. Konstruksi Kandidat Gen AV1 Begomovirus pada pBI121 dan Introduksinya ke dalam Tembakau Menggunakan Vektor
Agrobacterium tumefaciens. http://biogen.litbang.pertanian.go.id/terbitan/pdf/agrobiogen_7_1_2011_02.pdf. (diakses pada 20 November
2016)
◦ Waluyo, Seagames, dkk. (2013). Transformasi Genetik Tembakau dengan Gen Cold Shock Protein Melalui Perantara Agrobacterium
tumefaciens [online] Available at: http://biogen.litbang.pertanian.go.id/terbitan/pdf/Agrobiogen_9_2_2013_58-65.pdf[Accessed 30 Nov.2016].
◦ Park, Ki Youl, dkk. (2015). Expression, Subcelullar, Localization and Enzyme Activity Of A Recombinant Human Extra-Cellular Superoxide
Dismutase In Tobacco (Nicotiana Benthamiana L..) [online] Available at: http: www.elsevier.com/locate/yprep [Accessed 30 Nov.2016].
◦ Anonim. 2014. Pcambia5105.[online] tersedia di: mail..http://www.snapgene.com/resources/plasmid_files/plant_vectors/pCAMBIA5105/
◦ Anonim. Plasmids. [online] tersedia di: http://www.nature.com/scitable/definition/plasmid-plasmids-28
◦ Anonim. 2010.Plant transformation using Agrobacterium tumefaciens. [online] tersedia di:
http://www.nepadbiosafety.net/subjects/biotechnology/plant-transformation-agro
◦ Anonim. Binary Vector. [online] tersedia di: http://www.cambia.org/daisy/AgroTran/g1/848.html
◦ http://cdn.intechopen.com/pdfs-wm/25750.pdf
◦ http://pcp.oxfordjournals.org/content/49/2/242.full.pdf
◦ http://aem.asm.org/content/75/7/1845.full.pdf+html