FAUZAN

ZASQI
ANAMAS

VITRIA DJUNIAR
NATAULY R.
HARISTY

KROMATOGRAFI
CAIRAN KINERJA
TINGGI

SYAILA
MEDIN
NURHAYA
PETRUS
TI

JEFRIADI
Pengantar
 HPLC = Perkembangan tingkat tinggi dari
kromatografi kolom.
 Selain dari pelarut yang menetes melalui
kolom dibawah grafitasi, didukung melalui
tekanan tinggi sampai dengan 400 atm (Ini
membuatnya lebih cepat)
Perkembangan yang lebih luas melalui
kromatografi kolom mempertimbangkan
metode pendeteksian yang dapat digunakan.
Metode-metode ini sangat otomatis dan
sangat peka.
 Suatu teknik kromatografi yang menggunakan
fasa gerak cair, dapat digunakan untuk
pemisahan sekaligus untuk analisis
 Kromatografi kolom modern yang merupakan
hasil dari pengembangan kromatografi kolom
 Menggunakan partikel kecil dalam kolom kecil
dengan sistem pompa bertekanan tinggi dan
detektor yg sensitif
 Keunggulannya adalah memberikan pemisahan
yang cepat, efisien dan resolusi yang tinggi
 Persamaan : Dalam hal kepekaan dan
kemampuannya menghasikan data kualitatif dan
kuantitatif dengan sekali kerja saja. Dan alat KCKT
lebih mahal daripada alat KGC.
 Perbedaan : Fase diam yang terikat pada polimer
berpori terdapat dalam kolom baja tahan karat yang
bergaris tengah kecil, dan Fase geraknya adalah
campuran pelarut yang dapat bercampur, dimana fase
gerak cair mengalir akibat tekanan yang besar.
 Berdasarkan kekuatan / kepolaran fasa
geraknya KCKT dibagi menjadi:

1. Fasa Normal : Fasa gerak kurang polar

dibandingkan fasa diam
2. Fasa Terbalik : Fasa gerak lebih polar
dibandingkan fasa diam

Prinsip Pemisahan :

Pebedaan distribusi komponen diantara fasa diam

dan fasa gerak. Semakin lama terdistribusi dalam
fasa diam semakin lama waktu retensinya
Dengan bantuan pompa fasa gerak cair
dialirkan melalui kolom ke detektor.
Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa
gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam
kolom terjadi pemisahan komponen-
komponen campuran. Karena perbedaan
kekuatan interaksi antara solut-solut
terhadap fasa diam. Solut-solut yang
kurang kuat interaksinya dengan fasa
diam akan keluar dari kolom lebih dulu.

Prinsip Kerja KCKT

Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi
dengan fasa diam maka solut-solut tersebut
akan keluar kolom dideteksi oleh detektor
kemudian direkam dalam bentuk
kromatogram kromatografi gas. Seperti pada
kromatografi gas, jumlah peak menyatakan
konsentrasi komponen dalam campuran.
Computer dapat digunakan untuk mengontrol
kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta
mengolah data hasil pengukuran HPLC.

Prinsip Kerja KCKT

 Proses Elusi

Isokratik Gradien
Proses elusi yang Proses elusi yang
eluennya menggunakan eluennya menggunakan
perbandingan komponen perbandingan komponen
yang tetap dari awal yang diubah-ubah secara
sampai dengan akhir bertahap selama analisa
pemeriksaan
• Sebagian besar pemisahan dengan KCKT
modern menggunakan kolom siap pakai, dan
berbagai jenis kolom ini disediakan oleh
pabrik.
• Tetapi, kebanyakan pemisahan dapat
dilakukan dengan menggunakan kolom
partikel silika mikropori (untuk senyawa
nonpolar) atau kolom fase-balik, yaitu fase-
ikat Cig (untuk senyawa polar) (Hamilton dan
Sewell, 1982).
 KCKT memperbolehkan penggunaan partikel
yang berukuran sangat kecil untuk material
terpadatkan dalam kolom yang mana akan
memberi luas permukaan yang lebih besar
berinteraksi antara fase diam dan molekul-
molekul yang melintasinya.
 Senyawa-senyawa polar dalam campuran
melalui kolom akan melekat lebih lama pada
silika yang polar dibanding degan senyawa-
senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa
yang non polar kemudian akan lebih cepat
melewati kolom.
 Senyawa-senyawa non polar dalam campuran
akan cenderung membentuk atraksi dengan
gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya
van der Waals.
 Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut
dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan
ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-
senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul
air atau metanol misalnya. Oleh karenanya,
senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu
dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam
kolom.
Gambar Alat KCKT
Bagian-bagian alat HPLC

Tempat Eluen : Botol yang tidak

bereaksi dengan pelarut, dilengkapi
penyaring. Eluen harus disaring
dengan saringan membran
Pompa : terbuat dari stainles steel,
seal terbuat dari grafit atau teflón,
tekanan sampai 400 bar, memberikan
laja alir sampai 5 ml/menit. Tak
memberikan pulsa dan keberulangan
pemompaan <1%
Injektor : Dapat memasukkan sampel
ke dalam kolom dalam bentuk
sesempit mungkin. mudah digunakan
Keberulangan tinggi dan dapat
bekerja walaupun ada tekanan balik.
DETEKTOR
 Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi
yang telah melewati kolom. Metode umum yang
mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu
penggunaan serapan ultra-violet.
 Interpretasi output dari detektor

Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-

puncak, dimana masing-masing puncak mewakili
satu senyawa dalam campuran yang melalui
detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang
mengontrol kondisi kolom, kita dapat menggunakan
waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi
senyawa yang diperoleh, tentunya, kita (atau orang
lain) sudah mengukur senyawa-senyawa murninya
dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.
 Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk
bergerak melalui kolom menuju detektor
disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi
diukur berdasarkan waktu dimana sampel
diinjeksikan sampai sampel menunjukkan
ketinggian puncak yang maksimum dari
senyawa itu.
 Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu
retensi yang berbeda. Untuk beberapa senyawa,
waktu retensi akan sangat bervariasi dan
bergantung pada:

a. Tekanan yang digunakan (karena itu akan

berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
b. Kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat
dari material apa, tetapi juga pada ukuran
partikel)
c. Komposisi yang tepat dari pelarut
d. Temperatur pada kolom
 Widanengsih, niknik. 2008. Kromatografi Cair
Tingkat Tinggi. (online).
(http://niknikwidanengsih.blogspot.com/200
8/12/kromatografi-cair-tingkat-tinggi.html)
di unduh tanggal 28 mei 2011)
 Clark, Jim. 2007. Kromatografi Cair Tingkat
Tinggi. (online). (http://www.chem-is-
try.org/materi_kimia/instrumen_analisis/kro
matografi1/kromatografi_cair_kinerja_tinggi_
hplc/ di unduh tanggal 28 mei 2011)