Kromatografi

 DEFINISI
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran
didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen-
komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu
fase diam dan fase gerak.
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul
berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase
gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen
(berupa molekul) yang berada pada larutan. Molekul
yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom
yang merupakan fase diam.
Kromatografi terdiri dari dua fase, fase gerak dan fase
diam, dalam proses kromatografi selalu terdapat salah satu
kecenderungan molekul-molekul komponen untuk
melarut dalam cairan, melekat pada permukaan padatan
halus, bereaksi secara kimia dan terekslusi pada pori-pori
fase diam.
Dalam beberapa hal metode pemisahan kromatografi
mempunyai kemiripan dengan metode pemisahan
ekstraksi. Kedua metode ini sama-sama menggunakan dua
fase, dimana fase satu bergerak terhadap fase lainnya,
kesetimbangan solut selalu terjadi di antara kedua fase.
 Kromatografi

Padat Pertukaran Ion fase Diam Gel

Gas Cair Cair fase Gerak Cair

Anion Kation GPC

Plat Kolom
Jenis-Jenis Kromatografi
 Berdasarkan fase gerak yang digunakan, kromatografi
dibedakan menjadi dua golongan besar yaitu gas
kromatografi dan liquid kromatografi Masing-masing
golongan dapat dibagi lagi seperti yang telah
disebutkan pada definisi di atas.
Kromatografi di dalam bentuk tempat

 Kromatografi Kolom : Kromatografi kolom

merupakan teknik pemisahan di mana tempat
stasioner dalam tabung.

 Kromatografi Planar
 Kromatografi Kertas
 Kromatografi Lapisan Tipis
 Contoh kromatografi
Liquid kromatografi
digunakan untuk identifikasi pigmen
tumbuhan atau komponen lain

Thin-Layer kromatografi
Menggunakan lapisan tipis atau gelas
kaca untuk memisahkan komponen
kimia dan bahan lainnya

Gas kromatografi
Digunakan untuk menentukan komposisi kimia Paper kromatografi
zat-zat yang tidak diketahui, seperti senyawa Dapat digunakan untuk memisahkan
berbeda dalam bensin yang ditunjukkan oleh tiap- komponen-komponen tinta,
tiap puncak dalam grafik di bawah ini. pewarna, senyawa tumbuhan
(klorofil), make-up, dan banyak zat
lain
Kromatografi Cair-Cair
 Ada dua macam sistem penggunaan dalam
kromatografi cair-cair :

1. kromatografi fase normal

fase gerak → non polar ( ex: heksana, isopropil-eter)
fase diam → sangat polar (ex: air)

digunakan untuk memisahkan senyawa polar, sebab

senyawa polar akan tertahan lebih lama didalam
kolom yang polar, sedangkan senyawa yang non-polar
akan keluar lebih awal dari dalam kolom.
 2. Kromatografi fase terbalik
fase gerak → polar ( ex: air, metanol)
fase diam → non polar (ex: hidrokarbon oktadekana)

digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa non polar.

Analisa Kualitatif
 Dasarnya adalah waktu retensi atau volume retensi suatu
senyawa.
 Membandingkan t atau V senyawa dalam sampel yang
dianalisis dengan t atau V suatu senyawa standar (yang
telah diketahui)
Analisis Kuantitatif
 Metode pengukuran tinggi puncak
Tinggi puncak suatu kromatogram akan sebanding dengan
kadar senyawa yang membentuk kromatogram tersebut.
Pengukuran tinggi puncak didasarkan pada rumus
pengukuran tinggi suatu segitiga, yaitu suatu garis tegak
lurus dari titik tengah alas kromatogram sampai dengan
perpotongan sisi segitiga kromatogram tersebut.
Analisis Kuantitatif (lanjutan)
 Metode pengukuran luas puncak
Dapat memberikan hasil yang lebih akurat jika
dibandingkan dengan cara pengukuran tinggi puncak. Luas
puncak diukur seperti menghitung luas segitiga yaitu :

Rumus tersebut memberikan hasil yang baik jika

kromatogramnya berbentuk lancip. Cara lain menggunakan
rumus :
Analisis Kuantitatif (lanjutan)
Analisis Kuantitatif (lanjutan)
 Metode gunting dan timbang
Kromatogram yang telah digambarkan pada kertas
digunting sesuai bentuknya, kemudian guntingan-guntingan
kertas kromatogram ini ditimbang. Berat dari masing-
masing guntingan kromatogram ini akan sebanding dengan
kadar senyawa yang membentuk kromatogram tersebut.
Analisis Kuantitatif (lanjutan)
 Metode Integrator
Integrator adalah peralatan elektronik yang sering dijumpai
pada peralatan kromatografi yang modern. Alat ini akan
mengubah tanda-tanda listrik dari detektor menjadi suatu
gambaran kromatogram sekaligus menghitung luas
kromatogram yang dibentuk secara elektronik.
Kromatografi Kertas
fase diam → kertas serap

Fase gerak → pelarut atau campuran pelarut yang

sesuai.

Jarak relative pada pelarut disebut sebagai nilai Rf.

Untuk setiap senyawa berlaku rumus sebagai berikut:
Rf=jarak yang ditempuh oleh senyawa
jarak yang ditempuh oleh pelarut
Kromatografi Kertas (lanjutan)
Kromatografi Kertas Dua Arah
 Digunakan dalam menyelesaikan masalah pemisahan
substansi yang memiliki nilai Rf yang sangat serupa.

 Menggunakan dua pelarut yang berbeda

Kromatografi Lapis Tipis
 Menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina
yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam
atau plastik yang keras.

 Fase diam → Jel silika (atau alumina) atau substansi

yang dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet.
 Fase gerak → pelarut atau campuran pelarut yang
sesuai.
Kromatografi Lapis
Tipis (lanjutan)
Sebuah garis menggunakan pinsil digambar dekat bagian
bawah lempengan dan setetes pelarut dari campuran
pewarna ditempatkan pada garis itu.

Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan

ditempatkan dalam sebuah gelas kimia bertutup berisi
pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak. Perlu
diperhatikan bahwa batas pelarut berada di bawah garis
dimana posisi bercak berada.

Menutup gelas kimia untuk meyakinkan bawah kondisi

dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut.
Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia
biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang
terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia
dengan uap mencegah penguapan pelarut.
Kromatografi Lapis
Tipis (lanjutan)
Perhitungan nilai Rf
Nilai Rf untuk setiap warna dihitung
dengan rumus sebagai berikut:

Sebagai contoh, jika komponen

berwarna merah bergerak dari 1.7 cm
dari garis awal, sementara pelarut
berjarak 5.0 cm, sehingga nilai Rf
untuk komponen berwarna merah
menjadi:
Analisis Sampel yang
Tidak Berwarna
1.Menggunakan pendarflour

Fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis

seringkali memiliki substansi yang ditambahkan
kedalamnya, supaya menghasilkan pendaran
flour ketika diberikan sinar ultraviolet (UV).

Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak

pada kromatogram berada, meskipun bercak-
bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat
dengan mata. Ketika sinar UV diberikan pada
lempengan, akan timbul pendaran dari posisi
yang berbeda dengan posisi bercak-bercak.
Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap.
Analisis Sampel yang
Tidak Berwarna
2. Penunjukkan bercak secara kimia

Dalam beberapa kasus, dimungkinkan untuk membuat bercak-bercak

menjadi tampak dengan jalan mereaksikannya dengan zat kimia
sehingga menghasilkan produk yang berwarna. Sebuah contoh yang
baik adalah kromatogram yang dihasilkan dari campuran asam amino.

Kromatogram dapat dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan

ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan
senyawa-senyawa berwarna, umumnya coklat atau ungu.

Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian

ditempatkan pada wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan
gelas arloji) bersama dengan kristal iodium.

Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada

kromatogram, atau dapat dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada
lempengan. Substansi yang dianalisis tampak sebagai bercak-bercak
kecoklatan.
Kromatografi Kolom
Pemisahan berdasarkan perbedaan polaritas atau afinitas zat,
dimana senyawa yang sudah dipisahkan dikarakterisasi dan
dipisahkan lagi secara kromatografi kolom.
Kolom kromatografi berkerja berdasarkan skala yang lebih
besar menggunakan material terpadatkan pada sebuah
kolom gelas vertikal.
Kromatografi Kolom
Didasarkan pada absorbsi komponen2 campuran dengan
afinitas berbeda terhadap permukaan fase diam.
Absorben bertindak sebagai fase diam dan fase geraknya
adalah cairan yang mengalir membawa komponen campuran
sepanjang kolom.
Sampel yang mempunyai afinitas besar terhadap absorben
akan secara selektif tertahan dan afinitasnya paling kecil
akan mengikuti aliran pelarut.
Metode dalam kromatografi kolom
Metode kering
Pada metode kering, kolom diisi dengan fasa diam kering,
diikuti dengan penambahan fasa gerak yang disiramkan
pada kolom sampai benar-benar basah.
Metode basah
Pada metode basah, bubur silika disiapkan dengan
mencampurkan eluen pada serbuk fasa diam dan
dimasukkan secara hati-hati pada kolom. Dalam langkah
ini harus benar-benar hati-hati supaya tidak ada
gelembung udara. Larutan senyawa organik dipipet di
bagian atas fasa diam, kemudian eluen dituangkan pelan-
pelan melewati kolom.
Penggunaan kolom
Misalnya memisahkan campuran dari dua senyawa yang berwarna,
yaitu kuning dan biru. Warna campuran yang tampak adalah hijau.
Pertama penutup kran dibuka untuk membiarkan pelarut yang
sudah berada dalam kolom mengering sehingga material
terpadatkan rata pada bagian atas, dan kemudian tambahkan
larutan secara hati-hati dari bagian atas kolom. Lalu buka kran
kembali sehingga campuran berwarna akan diserap pada bagian
atas material terpadatkan, sehingga akan tampak seperti gambar
disamping.

menamambahkan pelarut baru melalui bagian atas kolom, jangan

sampai merusak material terpadatkan dalam kolom. Lalu buka kran,
supaya pelarut dapat mengalir melalui kolom, kumpulkan dalam
satu gelas kimia atau labu dibawah kolom. Karena pelarut mengalir
kontinyu, anda tetap tambahkan pelarut baru dari bagian atas
kolom sehingga kolom tidak pernah kering.
Perubahan yang mungkin terjadi sejalan perubahan waktu