REVIEW JURNAL

‘‘ ICH Guidance in Practice: Validated Reversed-Phase HPLC

Method for the Determination of Active Mangiferin from
Extracts of Mangifera indica Linn’'

Disusun oleh :

Chyntia N. M. R Rohi 168114061

Elisabeth Indriyani M. Rohi 168114062
Maria Carolina Loy Nau 168114066
Winarti Rambu Tagu Dima 168114068
Susan Ayu Lestari 168114069
HPLC/KCKT
Prinsip kerja HPLC yaitu pemisahan analit-analit
berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari
kolom (fase diam) dan larutan tertentu sebagai
fase gerak. Yang paling membedakan HPLC
dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC
digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa
gerak. Campuran analit akan terpisah
berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya
untuk sampai ke detektor (waktu retensinya)
akan berbeda, hal ini akan teramati pada
spektrum yang puncak-puncaknya terpisah.
Mangiferin
Mangiferin (1,3,6,7 tetra hydroxyl xanthone- C2- beta-D-
glucoside, MGN) diperoleh dari kulit pohon dan daun Mangifer
indica Linn. Pohon ini merupakan family Anacardiaceae, yang
ditemukan liar atau di budidaya. Literatur mengungkapkan bahwa
tidak ada metode analitik yang tersedia untuk penentuan MGN
pada ekstrak daun dan kulit pohon mangga. Validasi metode adalah
bagian terpenting dari analisis, dan itu sebabnya ada kebutuhan
untuk memvalidasi metode yang dikembangkan untuk penentuan
MGN dalam ekstrak alkohol dan bahan baku dari Mangifera
indica
 Langkah Kerja
Bahan dan Reagen
Mangiferan standar (no batch T2C036, kemurnian 95%), 3 ekstrak alkohol (MI-O5 lot 1, MI-O6
lot 1, dan PC/MI/2610) dan bahan baku (daun dan kulit pohon mangga), larutan asetonitril
dan methanol, dimetil formamid (DMF), dan asam ortosporat, potassium dihydrogen
orthophosphate. Semua larutan digunakan setelah filtrasi melewati membran ultipor N66
Nylon 66 (0,45 ɥm) filter P/N 60172 dan air.

Apparatus dan perangkat lunak

Shimadzu HPLC-LC2010A yang dilengkapi dengan pompa isokratik, autosampler dan
detektor SPD-M 10 A vp PDA atau detektor UV SPD 10AD vp. Data akuisisi dan analisis
integrasi puncak menggunakan perangkat lunak CFR-21 bagian II. Pemisahan dicapai pada
kolom Lichrospher 100 C18–ODS (octadecyl silane) (250 × 4.6 mm, 5 µm size) (Merck,
Whitehouse Station, NJ. Temperatur kolom dipertahankan pada 270C. Injeksi volume
sejumlah 20µL dan deteksi UV pada 254 nm. Total waktu run adalah 15 menit. Timbangan
analitik Sartorius-BP-211D digunakan serta pompa filter vakum DLF.
 PROSEDUR

01 Preparasi larutan buffer

Fase gerak 0,01 M potassium dihydrogen orthophosphate (pH 2.7 ± 0.2)- asetonitril (15:85,
v/v) digunakan dengan mode isokratik pada laju alir 1 mL/menit.

02 Preparasi standar kalibrasi mangiferin

Dibuat larutan stok 973,589 μg / mL menggunakan mengiferin standar dengan pelarut DMF
dan sejumlah methanol HPLC. Standar kalibrasi pada tujuh tingkat konsentrasi disiapkan
dengan pengenceran berurutan dari larutan stok dengan metanol HPLC untuk mendapatkan
973.589, 486.794, 243.397, 121.699, 60.849, 30.425, dan 15.212 μg / mL untuk rentang
analitik 15-1000 μg / mL. Suntikan 20 μL dalam 3 kali replikasi dibuat dari masing-masing
konsentrasi dan di kromatografi di bawah kondisi tertentu.

03 Preparasi Sampel
Larutan sampel untuk ekstrak
Larutan sampel dari ekstrak alkohol
(MI-O5 lot 1, MI-O6 lot 1, and
PC/MI/2610) dilakukan dengan
menimbang jumlah tertentu setiap
sampel (seperti pada tabel) dan
dilarutkan terpisah dengan DMF,
disonikasi dan dipanaskan di water
bath, didinginkan dan di add hingga
100 ml dengan methanol
Larutan sampel untuk ekstrak
Ditimbang 420,05 mg dan 631,8 mg
bagian daun untuk studi akurasi dan
kuantifikasi, serta 839,3 mg kulit pohon
mangga untuk kuantifikasi. Ekstrak
dengan 10 mL DMF dan 80 mL metanol
disonikasi selama 5 menit dengan
memanaskannya di waterbath sekitar 20
menit; buang ekstrak cair supernatan ke
500-mL gelas beaker. Ulangi prosedur ini
empat kali lagi hingga bahan mentah
sepenuhnya diekstraksi atau sampai
ekstrak tidak berwarna. Ekstrak
dikumpulkan, dicampur dengan baik,
terkonsentrasi hingga kurang dari 100
mL, dan di buat volume menjadi 100 mL
dengan metanol, dan disaring melalui
filter membran 0,45-µm.
 Hasil dan Diskusi
Validasi Metode

Respon linearitas Presisi Stabilitas larutan

Selektifitas Akurasi Robustness Kuantifikasi

 Respon linearitas

Rentang konsentrasi kerja MGN yaitu

antara 15-1000 ɥg/mL. Kurva kalibrasi
diperoleh menggunakan kotak terakhir
linear prosedur regresi, dan parameter
linear yang representatif ditunjukkan
pada tabel. Koefisien korelasi,
kemiringan (slope), intercept, dan %
relative standard deviation (RSD) sudah
memenuhi kriteria penerimaan ICH.
Kromatogram dibawah mewakili
linearitas metode
Selektifitas
Diperoleh hasil bahwa tidak ada
senyawa endogen yang mempengaruhi
pengamatan di waktu retensi MGN.
Spectrum PDA dari standar MGN dari
PC/MI/2610 and ACD/062 juga diuji, dan
spektrum 3D menunjukkan adanya
analit dalam sampel, dengan indikasi
kemurnian puncak lebih dari 98%.
 Akurasi

Akurasi ditentukan dengan metode

spiking sampel bahan baku Mangifera
inadica (ACD/062 : kulit pohon) dan
ekstrak dengan jumlah MGN standar
yang diketahui dan dibandingkan hasil
pengukurannya dengan nilai yang
sebenarnya. Injeksi 3 kali dilakukan
pada semua sampel yang di spike. Nilai
akurasi di ekspresikan sebagai
persentase recovery. Dan hasilnya
menunjukkan recovery sampel ACD/062
(kulit pohon), MI-O5 lot 1 (ekstrak
alkohol), and MI-O6 lot 1(ekstrakalkohol)
masing-masing 96,41; 99,64; dan
101,31%.
Presisi
Ditentukan dengan analisis 3 kali
replikasi standar yang di spike
dengan sampel. Lalu, repeatability
(pengulangan) did emonstrasikan
melalui spiking standar dengan 12
konsentrasi berbeda dari larutan stok
sampel (MI-O5 lot 1: ekstrak alkohol)
dan perbandingan recovery dengan
larutan standar acuan adalah
126,699 ɥg.mL dibawah kondisi yang
sama. Hasil presisi metode ini
sangat baik dengan nilai %RSD
kurang dari 1,0%.
 Robustness
Contents
Contents

Contents
Contents

Contents

Uji ini tidak memiliki efek yang signifikan pada faktor semitrik puncak dan determinasi
MGN.
Stabilitas larutan Stabilitas dari sampel MGN fresh
(MI-06 lot 01) dan larutan standar
di preparasi. Ekstrak sampel
150,9 mg dipersiapkan dengan
konsentrasi 323,07 ɥg/mL.
larutan sampel ini di spike
dengan larutan standar. Dengan
segera, standard sampel yang di
spike diinjeksikan ke sistem
HPLC pada waktu 0, 6, 12 dan
24 jam. Data yang diperoleh
dievaluasi area puncaknya. Tidak
ada ganggunan puncak atau
degradasi sampel yang diamati
pada waktu retensi analit.
Kuantifikasi
Kuantifikasi (% kemurnian) sampel (baik
ekstrak maupun bahan baku), yang
digunakan dalam proses validasi,
selanjutnya direalisasikan dengan
menerapkan metode yang dikembangkan
untuk memastikan kebenaran % kemurnian
sampel tersebut. Hasil ditunjukkan pada
tabel. Kesamaan % kemurnian semua
sampel diklaim selama validasi proses.
 Kesimpulan
Penelitian ini telah mengembangkan dan
memvalidasi metode kromatografi cair fase
terbalik yang baru dioptimasi untuk
menganalisis mangiferin yang diekstraksi dari
Mangifera indica Linn. Pengembangan metode
ini menghasilkan kemurnian sampel yang
berbeda, dengan menunjukkan tingkat akurasi,
spesifisitas dan presisi yang tinggi. oleh
karena itu, metode RP-HPLC yang
dikembangkan terbukti cocok untuk
penentuan mangiferin dalam berbagai ekstrak
alkohol dan bahan baku Mangifera indica
dalam kontrol kualitas laboratorium.
Thank You