Immunohistochemistry

“CD4”

Umi Rosidah G1C215008

Windya Nazmatur R G1C215019
Galang Mahardika G1C215020
Rinda Nurlela G1C215051
 CD4
Salah satu dari beberpa jenis sel darah putih adalah
yang disebut limfosit (lymphocyte). Sel CD4 adalah
salah satu bentuk dari limfosit ini. Sel tersebut
adalah bagian yang penting dari sistem kekebalan
tubuh kita. Sel CD4 kadang disebut sebagai sel-T.
Antibodi CD4 berguna utk identifikasi T helper/sel
inducer, memeriksa limfosit reaktif (karena terdapat
pada 45% limfosit darah perifer), kelainan
limfoproliferatif dan monosit.
Pewarnaan CD4 imunohistokimia metode
Mayer’s Hematoxylin
 Prinsip: Perpaduan antara reaksi imunologi dan
kimiawi, dimana reaksi imunologi ditandai
adanya reaksi antara antigen dengan antibodi,
dan reaksi kimiawi ditandai adanya reaksi antara
enzim dengan substrat.
 Metode Direct
 Pada metode ini antibody monoclonal yang
digunakan untuk mendeteksi suatu marker
pada sel, langsung di label dengan suatu
enzim. Adapun cara pewarnaannya adalah
sebagai berikut :
Persiapan reagen :
 H2O2 3% (digunakan untuk menghilangkan
aktifitas endogenous peroksidase).
 Trypsin 0,025% dalam PBS (digunakan untuk
membersihkan debris protein yang
kemungkinan menutup epitope dari bahan yang
akan dideteksi).
 Larutan kerja DAB (digunakan sebagai indicator
warna pada reaksi enzimatik).
 R/ Aquadestilata 1 ml
 Buffer substrat H2O2 50 tetes
 Larutan DAB stok 1 tetes
Cara kerja :
 Lakukan deparafinisasi, caranya adalah dengan memasukkan
sayatan jaringan berturut-turut kedalam :
1. xylol : 2 menit
2. xylol : 2 menit
3. etanol absolute : 1 Menit
4. etanol absolute : 1 menit
5. etanol 95% : 1 menit
6. etanol 95% : 1 menit
7. etanol 80% : 1 menit
8. etanol 70% : 1 menit
9. air mengalir : 10-15 menit
10. asukkan kedalam larutan H2O2 30% : 30 menit
11. Cuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit)
12. Trypsin 0,025% selama 6 menit pada 370C
13. Cuci dengan PBS (a : 2 menit)
14. Masukkan kedalam antibodi monoklonal dilabel enzim (misalnya
untuk mendeteksi IgG pada mencit, maka monoklonal antibodi
yang dilabel dengan enzim adalah IgG anti mencit) : 30 menit
15. Cuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit)
16. Masukkan kedalam substrat kromogen : 5 menit
17. Cuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit)
18. Cuci dengan aquadestilata
19. Masukkan ke dalam Mayer’s Haematoksilin : 6 menit
20. Cuci dengan air mengalir, sampai bersih
21. Dehidrasi – Clearing – Mounting
 Metode Indirect
 Pada metode imunohistokimia indirect,
antibodi monoklonal yang digunakan untuk
mendeteksi suatu marker pada sel, tidak
dilabel dengan suatu enzim.
Persiapan reagen :
 H2O2 3%
 Trypsin 0,025% dalam PBS
 Larutan kerja DAB
 R/ Aquadestilata 1 ml
 Buffer substrat H2O2 50 tetes
 Larutan DAB stok 1 tetes
Cara kerja :
Lakukan deparafinisasi, caranya adalah dengan memasukkan sayatan
jaringan berturut-turut kedalam :
1. xylol : 2 menit
2. xylol : 2 menit
3. etanol absolute : 1 menit
4. etanol absolute : 1 menit
5. etanol 95% : 1 menit
6. etanol 95% : 1 menit
7. etanol 80% : 1 menit
8. etanol 70% : 1 menit
9. air mengalir : 10-15 menit
10. Masukkan kedalam larutan H2O2 3% : 30 menit
11. Cuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit)
12. Trypsin 0,025% selama 6 menit pada 370C
13. Cuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit)
14. Masukkan kedalam monoclonal antibodi / antibodi primer.
15. Cuci dengan PBS 3 kali (a: 2 menit)
16. Masukkan kedalam sekunder antibodi : 30 menit.
17. Cuci dengan PBS 3 kali (a: 2 menit)
18. Masukkan kedalam substrat kromogen : 5 menit
 Metode Combine Indirect
Persiapan reagen :
 H2O2 3 %
 Trypsin 0,02% dalam PBS
 Larutan kerja DAB
 R/ Aquadestilata 1 ml
 Buffer substrat H2O 2 50 tetes
 Larutan DAB stok
Cara kerja :
 Lakukan deparafinisasi, caranya adalah dengan memasukkan
sayatan jaringan berturut-turut kedalam :
1. xylol : 2 menit
2. xylol : 2 menit
3. etanol absolute : 1 menit
4. etanol absolute : 1 menit
5. etanol 95% : 1 menit
6. etanol 95% : 1 menit
7. etanol 80% : 1 menit
8. etanol 70% : 1 menit
9. air mengalir : 10-15 menit
10. Masukkan kedalam larutan H2O2 3% : 30 menit
11. Cuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit)
12. Trypsin 0,025% selama 6 menit pada 370C
13. Cuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit)
14. Masukkan ke dalam monklonal antibodi/antibodi primer. Apabila ingin
mendeteksi IgG pada mencit, maka antibodi primer yang digunakan adalah
IgG anti mencit (misalnya rat anti mous = 1:50) : 30 menit
15. Cuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit)
16. Masukkan kedalam sekunder antibodi (oleh karena contoh tulisan ini
menggunakan primer antibodi berupa rat anti mous, maka antibodi
sekunder yang digunakan dapat berupa rabbit anti rat biotinilated label) : 30
menit
17. Cuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit)
18. Masukkan kedalam streptavidin/avidin HRP label : 30 menit
19. Cuci dengan PBS 3 kali (a: 2 menit)
20. Masukkan kedalam substrat kromogen : 5 menit
21. Cuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit), kemudian bilas dengan aquadestilata
22. Masukkan kedalam Mayer’sHematoxylin : 6 menit
23. Cuci dengan air mengalir
24. Dehidrasi – Clearing – Mounting
 Jaringan yang Digunakan sebagai
Petanda CD4
 Virus HIV secara langsung dan tidak langsung
merusak sel T CD4, padahal sel T CD4 di butuhkan
agar sistem kekebalan tubuh berfungsi dengan baik.
 Virus HIV berada terutama dalam cairan tubuh
manusia. Cairan yang berpotensial mengandung
virus HIV adalah darah, cairan sperma, cairan vagina
dan air susu ibu.
 Sesudah infeksi, kurang lebih 25% dari sel-sel
kelenjar limfe akan terinfeksi oleh HIV pula. Replikasi
virus akan berlangsung terus sepanjang perjalanan
infeksi HIV, tempat primernya adalah jaringan
limfoid.
Gambaran Hasil Pengecatan
Wassalamualaikum