ENHANCED BIOSURFACTANT PRODUCTION

THROUGH CLONING OF THREE GENES AND ROLE

OF ESTERASE IN BIOSURFACTANT RELEASE

Kelompok 5
Fitriani B. H311 16 011
Riska Faisal H031171508
Hernawati H031171509
Nur Alfiah Mufidha H031171515
Merlin Patabang H031171517
 Pengantar

• Biosurfaktan telah menunjukkan aktivitas antibakteri,

antijamur dan antivirus yang tidak biasa. Strain bakteri
yang digunakan adalah Bacillus SK320 diisolasi dari
endosulfan (pestisida organoklorin) yang disemprot
tanah perkebunan jambu mete. ini dilakukan kloning tiga
gen yakni gene sfp, sfp0 dan srfA.
• Gen sfp (1210 bp), Gen Spf0 (642 bp) dan Gen srfA (707 bp)
Gen-gen ini merupakan subunit domain pembawa protein
peptidil (PCP) dari dari surfaktin sintetase dengan
mentransfer sejumlah 4'-fosfopantetheinyl dari koenzim A
(CoA) ke residu serin. Diperlukan untuk sel B.subtilis untuk
menjadi produsen surfaktin antibiotik lipopeptida dan
plipastatin B1.
Teknik Isolasi dan Pemurnian DNA
• DNA kromosom dari Bacillus subtilis SK320
diisolasi menggunakan metode Rose dan
diamplifikasi menggunakan primer spesifik gen.
spesimen dihomogenisasi secara perlahan dalam
larutan 20 μL TE (10 mM Tris HCL, 1 mM EDTA,
pH 8) dan dibiarkan semalaman dalam suhu kamar.
Homogenisasi dilakukan secara menyeluruh dengan
mixer pelet steril, dalam tabung mikrofuge 0,5 μl.
Sampel disimpan pada suhu 4°C.
• Campuran reaksi yang mengandung DNA
kromosom, reverse primer, forwad primer ,
campuran dNTP, DNA Taq polimerase, buffer
Taq dan air steril diamplifikasi, dengan
program yang diatur ke kondisi denaturasi pada
suhu 94 ° C selama 5 menit, anneling pada 45 °
C selama 1 menit dan ekstensi pada 72 °C
selama 1 menit untuk total 30 siklus, dengan
ekstensi akhir pada 72 °C selama 10 menit
ProsesTransormasi

• Transformasi dilakukan dengan metode CaCl2.

Transforman dipilih pada pelat IPTG Amp + X-
gal. Urutan nukleotida gen sfp, sfp0 dan srfA
ditentukan dengan metode terminasi dideoksi
menggunakan sekuensing DNA Biosystems
Terapan.
 Seleksi

• Jika sel inang memperlihatkan dua sifat marker

vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan
kedualah yang terjadi. Seleksi sel rekombinan yang
membawa fragmen yang diinginkan dilakukan
dengan mencari fragmen tersebut menggunakan
fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya
dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi
polimerisasi berantai atau polymerase chain reaction
(PCR).
Identifikasi

• Analisis filogenik dari tiga biosurfaktan yaitu

Gen sfp (1210bp), sfp0 (642 bp), srfA (707
bp)berhasil dikloning dan diurutkan
menggunakan Sequencer Biosystems DNA
Terapan. sekuans DNA digunakan untuk
menyimpulkan hubungan fungsional dan evolusi
antara sekuens dalam database dan untuk
mengidentifikasi anggota keluarga gen
menggunakan fasilitas NCBI BLAST.
Bacillus Suptilis
 Vektor

Vektor merupakan molekul DNA yang

membawa suatu DNA asing kedalam sel inang,
dengan harapan sifat yang ada pada DNA
asing tersebut dapat terekspresi dalam sel
inang.Salah satu vektor yang bisa digunakan untuk
membawa molekul DNA asing masuk dalam sel
inang adalah plasmid
Vektor dari pGEM-T
 Proses Ekspresi Gen

• Penentuan ekspresi gen biosurfaktan untuk menguji

ekspresi gen biosurfaktan, Bacillus subtilis SK320
dan transforman positif (Rekombinan) yaitu. BioS a,
BioS b dan BioS c adalah ditanam pada media basal
yang mengandung 0,5% (v / v) minyak zaitun pada
37°C, masing-masing. Ampisilin ditambahkan dalam
media yang digunakan untuk menumbuhkan
transformasi positif mants. Pertumbuhan, aktivitas
biosurfaktan dan esterase diperkirakan pada interval
24 jam selama 5 hari
• Pemulihan dan pemurnian biosurfaktan Bacillus
subtilis SK320 dan rekombinan ditanam dalam
BHB yang mengandung 0,5% minyak zaitun (v /
v) sebagai sumber bon. Setelah 48 jam, ketika
aktivitas biosurfaktan diamati maksimum dalam
supernatan, kultur dipanen pada 7000 × g selama
30 menit pada 4 ° C. Supernatan disaring melalui
filter Whatman No. 42 kertas dan 3 volume aseton
dingin ditambahkan ke supernatan dan pada -20 °
C. Setelah 18-24 jam larutan disentrifugasi pada
7000 × g selama 30 menit pada suhu 4 ° C, udara
dikeringkan dan kemudian dilarutkan dalam air.
 Penerapan Gen Rekombinan

• Bacillus subtilis SK320 menghasilkan biosurfaktan

yang termasuk dalam kelas lipopeptida yang memiliki
sifat pengemulsi yang sangat baik. Telah ditunjukkan
bahwa produksi biosurfaktan dimediasi oleh esterase
ekstraseluler dalam media pertumbuhan Bacillus
subtilis SK320 dan turunan rekombinannya.
Biosurfaktan tanpa komponen protein atau lipid
menunjukkan aktivitas pengemulsi yang jauh lebih
rendah. Strain rekombinan menunjukkan peningkatan
dua kali lipat dalam aktivitas esterase dan hasil
biosurfaktan. Aplikasi dalam bidang industri yang
sangat baik
Terima Kasih