An improved HPLC-UV method for the simultaneous quantification

of triterpenic
glycosides and aglycones in leaves of Centella asiatica (L.) Urb
(APIACEAE)

FAUZIAH /
11609020011005
 Centella asi herba ethnom
PENDAHULUA atica (Apiac
N edicinal
eae) spesies

Cina, Malaysia, Australia, Subtropi

India
Amerika Selatan, Afrika, s
Madagaskar

Kusta, penyembuhan luka, sakit perut,

OBAT varises pembuluh darah, tekanan
darah tinggi dan penambahan memori
 PEGAGAN (Centella asiatica (L.) Urban)

Nama
Inggris : Spadeleaf, pohekula
Philipina : Takip kohol
China : Beng da wan, han ke cao
Indonsia : Kaki kuda, pegagan, antanan,
papagan (Sunda), pegaga, daun kaki kuda, daun
penggaga, pegago (Sumatera); antana, cowet
gompeng, gagan-gagan, penigowang, calingan
rambat (Jawa); bebele, paiduh (Nusa Tenggara);
wisu-wisu, kisu-kisu (Sulawesi); dogauke(Irian);
ji xue cao (Cina).

Botani 
Klasifikasi
Kingdom: Plantae (Tumbuhan)
     Subkingdom: Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh)
         Super Divisi: Spermatophyta (Menghasilkan biji)
             Divisi: Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga)
                 Kelas: Magnoliopsida (berkeping dua / dikotil)
                     Sub Kelas: Rosidae
                         Ordo: Apiales
                             Famili: Apiaceae 
                                 Genus: Centella
                                     Spesies: Centella asiatica (L.) Urban
Kandungan
Triterpenoid Geografi
kimia C.
s
asiatica
daerah

Asam dan
HPLC Penelitian heterosides Analisis

Fase Sistem Cassoside

Asetonitr
gerak deteksi dan
il/ari
asiaticoside

Isokratik
HIGH PERFORMANCE LIQUID CROMATOGRAPHY

HPLC adalah singkatan dari High Performance Liquid Cromatography,

yaitu alat yang berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom dari
fase diam ( yaitu sebuah tube dengan partikel bulat kecil dengan
permukaan kimia tertentu) dengan memompa cairan (fase bergerak)
pada tekanan tinggi melalui kolom. Sampel yang akan dianalisis
dijadikan dalam volume yang kecil dari fase bergerak dan diubah melalui
reaksi kimia oleh fase diam ketika sampel melalui sepanjang kolom.
Tujuan penggunaan alat ini adalah mengetahui kadar asam organik.

Langkah-langkah menganalisa menggunakan HPLC yaitu mula-mula

sampel diinjeksi dengan syringe. Kemudian sampel masuk ke injection
hall. Dari injection hall ini proses utama cara kerja HPLC dimulai, yaitu
dengan memompa sampel ke kolom oleh LC20AT dalam tekanan tinggi.
Dari kolom, sampel dijadikan fase bergerak dan diolah dengan fase diam
yaitu biasanya H2SO4 0,05 N dan CH3OH berdasarkan afinitas elektron.
Setelah terpisah, dengan berbagai perhitungan matematis, HPLC yang
sudah disambungkan dengan komputer ini memberikan pembacaan
berupa peak. Setelah itu kita mencari luasan di bawah peak untuk
mengetahui kadar analit.
 Asiaticoside (99,2%, HPLC),
Eksperime adecassoside (97,94%, HPLC),
ntal asia Asam (99%, HPLC) dan asam
madecassic (95%, HPLC) adalah dibeli
dari Extrasynthese (Genay, Perancis)

Asetonitril dan metanol HPLC

Kimia dan
berasal dari Prolabo, VWR
bahan tanaman
(Leuven, Belgia)
Daun segar C. asiatica (L.) Urban
dikumpulkan pada bulan
Desember 2007 dan Januari 2008
di daerah Dataran Tinggi Timur
dan Tinggi Madagaskar. Daun
dipisahkan dari batang,
dikeringkan pada 40 ◦ C, 
bubuk dan diayak dengan
saringan 355 mmeshes

bubuk daun disimpan di daerah

kering. Satu gram bubuk daun
kering diekstraksi oleh Soxhlet 
selama 8 jam dengan 100 ml
metanol
 HPLC Waters 2690 model pemisahan (Waters, Milford,
MA,
Apparatus USA) yang digunakan terdiri dari sebuah pompa, sebuah
autoinjector, sebuah spektrofotometri UV  detektor
Kromaton (Angers, Perancis), semuanya dikontrol oleh
Borwin perangkat lunak (Borwin, Rostock, Jerman). Untuk
penentuan spektrum massa, sebuah LCQ Keuntungan
Thermo Finnigan (Waltham, MA, USA) digunakan
pengaturan oleh X-Calibur perangkat lunak.

Pemisahan kromatografi dilakukan dengan terbalik

fase RP-18 LiChroCART ® kolom (250mm × 4mm ID;
partikel Ukuran: 5 µm). Fase Mobile gradien
asetonitril / air
 Stok larutan asiaticoside dan asam asia disiapkan di
Larutan Standar metanol pada 5.0 dan 2,5 mg / ml, masing-masing,
dan disimpan pada 0 0C. Dilakukan pengeceran
untuk setiap percobaan. Tiga konsentrasi (m = 3)
dari
asiaticoside (0,5, 2,5 dan 5,0 mg / ml) dan asam
(0,25, 1,0 dan 2,5 mg / ml) digunakan. Setiap
konsentrasi dianalisis dua kali (n = 2) untuk 3 hari (k
=3).
Ekstrak larutan diencerkan dengan metanol (1:5, v /
v) untuk penyusunan standar validasi dengan
diketahui tiga konsentrasi dari campuran stok
asiaticoside dan asam. Setiap standar validasi
dianalisis tiga kali (n = 3) untuk 3 hari (k = 3).

Kinetika ekstraksi dianalis untuk mengevaluasi

puncak daerah (HPLC analisis) masing-masing
Evaluasi ekstrak senyawa setelah 4, 6, 8 dan 10 h (n = 3). Waktu
ekstraksi Soxhlet paling tepat ditentukan
menggunakan data ini.
 Semua senyawa referensi secara komersial tersedia
Validasi
tetapi asiaticoside dan asam dipilih untuk mencapai
metode
validasi
metode dan untuk mengukur madel cassoside dan asam
madel cassic, masing-masing, karena kita mengamati
faktor respons identik untuk dua osides dan dua
aglycones dalam HPLC-UV (Tabel 2).Akibatnya, memilih
hanya dua referensi mengurangi biaya analisis.

Validasi metode dilakukan 3 hari dengan menguji kriteria

sebagai berikut: fungsi respon, linieritas,trueness, presisi
(keterulangan dan presisi intermediate), akurasi, batas
deteksi (LOD) dan kuantifikasi (LOQ), dan kuantifikasi
jangkauan.

Analisis statistik data dilakukan dengan menggunakan

e-noval V2.0 (Arlenda-Liège) perangkat lunak.
 Hasil dan Optimasi Ekstraksi 10 dan 8
Pembahasan ekstraksi soxletc jam

Gambar. 2. (a) Kromatogram dari
ekstrak kasar Pharmacopeia
dari pegagan (1: pelarut, 2: madecass Eropa
oside (TR = 5.8), 3: asiaticoside (TR =8.
1), 4: madecassic asam (TR = 17,6), 5: 
asam (TR = 21,7)),
(b) kromatogram dari ekstrak kasar
dari pegagan diperoleh di
laboratorium kami dengan
metodeFarmakope
Eropa (1: madecassoside),
(c) kromatogram dari
standar acuan dengan metode yang
dikembangkan (1:madecassoside dan 
isomer nya
(asiaticoside B), 2: asiaticoside,3:
asam madecassic, 4: asam ),
(d) kromatogram dari
mentah ekstrak pegagan dengan meto
de yang dikembangkan.
 Selektivitas dan kemurnian puncak dianalisa
Metode dengan perbandingan waktu retensi dan spektrum
validasi massa dengan senyawa referensi. Massa Spektrum
dianalisis pada tiga tingkatan (awal, tengah dan 
akhir) dari puncak masing-masing diselidiki dan
ditemukan sebanding (Gbr. 2c-d dan 4a-d)

Gambar. 4. Modus ion positif spektrum massa yang diperoleh

untuk puncak metanol ekstrak Centella asiatica. (a) madecassoside [M
+ NH4] + = 992;(b) asiaticoside [M + NH4] + = 976; (c) madecassic asam [M
+ NH4] + = 522; (d) Asam  [M + NH4] + = 506.
Kalibrasi standar asiaticoside dan asam asia yang disiapkan tanpa matriks (m
= 3, n = 2)

Berbeda model regresi diuji seperti: tertimbang (1 / X) regresi kuadrat,

tertimbang (1/X2) kuadrat regresi, regresi kuadrat, tertimbang (1 / X) linier
regresi, tertimbang (1/X2) regresi linear, regresi linier setelah transformasi
logaritma regresi, linear setelah persegi akar transformasi, tertimbang (1 / X)
regresi linear, regresi linier
Gambar. 6. Linear asiaticoside (a) dan asam (b). Garis
kontinyu adalah garis identitas (y = x), garis putus-
putus adalah batas penerimaan atas dan bawah
dalam nilai absolut dan garis putus-putus adalah atas
dan bawah-harapan batas toleransi (e ‡ = 95%).
 Tiga sampel C. asiatica dikumpulkan di Timur
dan Tinggi Plateau daerah Madagaskar. Ekstrak
Aplikasi untuk
dianalisis dan hasil yang diperoleh dengan
sampel pegagan
metode kami dan data yang dijelaskan dalam
literatur diberikan dalam Tabel 5. Hasil dalam
kisaran yang sama dari yang diperoleh dalam
karya sebelumnya
TERIMA KASIH