Metalloprotein adalah target labil dalam matriks super rumit dari sampel biologis, yang tidak

dapat menahan langkah-langkah persiapan pengambilan sampel yang berlebihan [18]. Oleh
karena itu parameter eksperimental harus dinilai secara hati-hati tergantung pada tujuan analitis
tertentu. Karena tidak ada metode pemodelan protein terkait logam yang diterbitkan
dikembangkan dan dioptimalkan dengan pembentukan kompleks protein-perak, kompatibilitas
prosedur sehubungan dengan identifikasi kompleks protein-perak memerlukan penilaian lebih
lanjut. Pekerjaan saat ini bertujuan untuk menyediakan metode yang sangat sederhana, murah,
dan kompatibel untuk karakterisasi protein terkait perak. Metode yang digunakan dalam
percobaan saat ini untuk menghindari pemurnian sampel berlebihan dan menjaga interaksi
logam-protein.
Metode untuk pemisahan metaloprotein yang memiliki resolusi pemisahan yang cukup dan dapat
mempertahankan ion logam terikat selama pemisahan protein sangat penting untuk karakterisasi
protein yang terkait logam. PAGE secara umum dapat diklasifikasikan sebagai SDS-PAGE
(denaturing PAGE) atau PAGE asli (non-denaturing PAGE) dan masing-masing memiliki sifat
pemisahan protein yang unik [29].
Karakter berbagai bentuk PAGE telah ditinjau sebelumnya [18]. Dalam kasus SDS-PAGE, itu
adalah salah satu teknik yang paling sering digunakan untuk memisahkan campuran protein
dengan resolusi tinggi [18]. Namun demikian, karakteristik pengikatan logam-protein umumnya
tidak dapat dipertahankan pada SDS-PAGE karena denaturasi campuran protein selama
pemisahan protein [30-32]. Dalam penelitian saat ini, perak dalam dua model protein hilang
setelah SDS-PAGE. Batas pendek ini membatasi penerapannya pada studi metallomic.
Sebaliknya, nativePAGE telah menjadi metode pilihan untuk menyelidiki aktivitas pro-protein,
interaksi pengikatan protein-protein, dan kofaktor logam di negara asal [29,33]
Namun, seperti yang ditunjukkan dalam pekerjaan saat ini, PAGE asli gagal dalam resolusi
pemisahan. Penarikan ini membatasi penerapannya pada analisis metalloprotein dengan matriks
kompleks. Di sini, kemajuan dalam prosedur SDS-PAGE, melalui pengurangan SDS dalam
buffer pemuatan menjadi 0,5%, penggantian merkaptoetanol dengan TCEP, bersama dengan
penghilangan langkah pemanasan campuran protein, diperkenalkan. Penelitian sebelumnya
lainnya telah menggambarkan kondisi elektroforesis protein yang dimodifikasi untuk
memperbaiki karakteristik denaturasi SDS-PAGE dan menjaga stabilitas ikatan logam-protein
[34,35
Konsentrasi tinggi SDS dan suhu tinggi tidak dianjurkan seperti yang ditunjukkan oleh penelitian
yang dilakukan pada protein yang mengikat kromium, seng, dan tembaga.
Penelitian saat ini memfokuskan modifikasi kondisi dengan penekanan pada evaluasi pengikatan
protein perak. Dengan menerapkan modifikasi yang disebutkan di atas, SDS-PAGE asli hasil
pemisahan dari protein berlabel perak model yang mendekati yang diamati dengan SDS-PAGE
normal setelah elektroforesis dalam buffer berjalan standar. Selain itu, sinyal signifikan dalam
dua model protein berlabel perak ini dapat dideteksi setelah proses elektroforesis standar
Dengan demikian, SDS-PAGE asli adalah metode pemisahan protein yang menjanjikan untuk
pembentukan protein pengikat perak, yang mempertahankan kinerja pemecahan protein SDS-
PAGE yang relatif tinggi serta karakteristik PAGE asli untuk retensi perak pada protein selama
proses elektroforetik
digunakan untuk pertama kalinya untuk mendeteksi protein yang berhubungan dengan perak.
Meskipun metode ini sebelumnya telah digunakan dalam bidang penelitian pro-teomik,
kelayakannya dalam kasus analisis metaloprotein adalah hal yang jelas. Pewarnaan perak dan
pewarnaan Coomassie Brilliant Blue (CBB) adalah dua teknik yang banyak digunakan untuk
memvisualisasikan protein dalam penelitian metalomik [36] Kedua metode ini sebelumnya
digunakan untuk menodai protein sebelum mendeteksi logam dengan specrometri massa unsur
dalam beberapa makalah [37,38]
Namun, penelitian yang didasarkan pada protein model yang mengandung seng, tembaga, dan
besi (superoksida dismu-tase, CA, dan holotransferrin) menunjukkan bahwa pewarnaan perak
dan CBB mengakibatkan hilangnya logam dari protein [39]. Seperti yang kita ketahui, tidak ada
evaluasi serupa sehubungan dengan pendeteksian perak terkait yang dilakukan. Namun
demikian, pewarnaan perak bukan aplikasi kabel untuk deteksi protein terkait perak karena
memperkenalkan sejumlah besar ion perak yang mengganggu deteksi protein yang mengandung
perak. Teknik pewarnaan protein lain yang umum digunakan, CBBstaining, tidak cukup sensitif
[36
Dengan demikian, teknologi pewarnaan gel alternatif yang sensitif dan kompatibel dengan
analisis perak diperlukan untuk pengembangan penelitian terkait perak. Prosedur pewarnaan
fluo-resen, metode visualisasi protein yang sepenuhnya divalidasi dalam penelitian proteome,
akan mengurangi batasan ini untuk tingkat tertentu [40,41]. Ini adalah pilihan yang lebih baik
dengan deteksi logam terikat protein, terutama perak, berdasarkan alasan berikut. Pertama,
deteksi fluoresen protein memiliki sensitivitas yang sama dengan yang dicapai dengan
pewarnaan perak dan jauh lebih unggul dari metode pewarnaan CBB [36].
Kedua, pewarnaan fluorescent kompatibel dengan profil protein terkait perak dengan tidak ada
solusi tambahan yang mengandung perak yang diperkenalkan selama prosedur pewarnaan.
Ketiga, metode pewarnaan fluorescent yang digunakan dalam studi saat ini cepat dan sederhana,
yang dapat dicapai dengan menggunakan prosedur satu langkah yang hanya membutuhkan 90
menit, tanpa diperlukan langkah fiksasi stepor destaining. Akhirnya, stabilitas kompleks protein-
perak selama prosedur pewarnaan fluorescent dievaluasi. Dalam penelitian ini, metode
pewarnaan fluoresen yang digunakan tidak mempengaruhi deteksi perak dalam dua modelprotein
berlabel perak. Penampilan luar biasa di atas menjadikan pewarnaan fluoresens sebagai teknik
yang menjanjikan untuk penelitian metallomic, khususnya pekerjaan metallomic yang
berhubungan dengan perak.
Prosedur pencernaan yang sederhana dan cepat untuk mengukur kandungan perak dalam pita
protein gel digunakan dalam penelitian ini. Pencernaan sampel dengan larutan asam pekat dan
H2O2 adalah prosedur pencernaan tradisional yang umum digunakan [42]. Namun, prosedur
pencernaan ini (yaitu, protokol b) menghasilkan konsentrasi HNO3 yang tinggi dalam larutan
pencernaan akhir, yang membutuhkan pengenceran berikutnya dengan air untuk memberikan
konsentrasi HNO3 akhir yang lebih rendah dari 3% sebelum deteksi IC-MS. Semakin tinggi
konsentrasi HNO3 yang digunakan selama proses pencernaan, semakin tinggi rasio pengenceran
yang dibutuhkan. Prosedur pelarutan tersebut akan membuat beberapa protein terkait perak
mengandung kadar perak rendah, misalnya CA, tidak dapat terdeteksi (Gbr. 3B)
HNO3 (3%) adalah pilihan yang lebih baik untuk menghilangkan ion perak dari pita gel protein
berlabel perak (CA dan OVA), yang cukup baik untuk secara efektif dibedakan dari pita kontrol.
Solusi pencernaan ini dapat ditentukan oleh ICP-MS secara langsung, tanpa prosedur
pengenceran lebih lanjut (Gbr. 3A). Dengan demikian, 200 L HNO3 3% digunakan untuk
menghilangkan protein dari pita protein dan solusinya langsung dikenai ICP-MS untuk deteksi
sliver secara langsung
Tidak seperti pendekatan berbasis PAGE lainnya, metode yang disediakan oleh pekerjaan saat
ini sangat disederhanakan, lebih mudah untuk ditangani, kemudahan replikasi, dan ekonomis.
Dalam penelitian pendahuluan yang dilakukan di laboratorium kami, protein pengikat perak pada
P. aeruginosa setelah paparan AgNO3 dan AgNP diselidiki
Pekerjaan ini didasarkan pada kopling on-line GE ke ICP-MS. Pendekatan ini memungkinkan
deteksi simultan logam dan isolasi protein terkait mereka. Namun demikian, GE on-line coupling
ke ICP-MS memiliki beberapa kelemahan. Pertama, sistem sambungan on-line ini membutuhkan
antarmuka spesifik dan modifikasi dari perangkat elektroforesis komersial. Kedua, instrumen
buatan ini mengandung beberapa aspek yang tidak menarik, seperti harga perangkat GE yang
relatif tinggi, perakitan tangki berjalan elec-trophoresis yang rumit, dan pengulangan yang
rendah. Terakhir, ini memakan waktu dan tidak efisien untuk karakterisasi throughput tinggi
yang akurat. Kelemahan ini membatasi replikasinya di laboratorium lain dan penggunaan praktis
lebih lanjut
Metode yang dikembangkan saat ini meminimalkan waktu yang digunakan dalam sistem
sambungan on-line. Selain itu, pekerjaan ini dilakukan pada empat konsentrasi yang berbeda dari
akrilamida, yang dapat memberikan kondisi pemisahan yang lebih cocok untuk kompleks protein
yang digunakan dalam sistem GE-ICP-MS.
Batas deteksi metode yang dikembangkan, presisi, dan stabilitas kompleks perak-protein
dievaluasi. Batas deteksi metode yang dikembangkan, didefinisikan sebagai katup rata-rata
sepuluh pita gel kosong ditambah tiga kali standar deviasi, ditemukan pada 0,05 ng / g.
Ketepatan antar-hari dari metode yang dikembangkan dilakukan pada tiga hari yang berbeda.
Ketepatan metode, dinyatakan sebagai standar deviasi relatif adalah 2,4% dan 8,7% untuk Ag-
berlabel CA dan Ag-berlabel OVA, masing-masing. Pemulihan perak untuk CA dan OVA dalam
metode saat ini dihitung masing-masing menjadi 78,6% dan 91,9%. Seperti yang diungkapkan
oleh penelitian sebelumnya, metode pemisahan protein dua dimensi memobilisasi 72,4% menjadi
87,1% dari total logam [44]. Metode SDS-PAGE asli saat ini sama dengan atau lebih tinggi dari
metode pemisahan dua dimensi.
Dengan strategi yang baru dikembangkan, protein terkait perak di P. aeruginosa dan S. aureus
setelah paparan AgNP dikarakterisasi. Dua protein terkait perak yang terkenal (GroEL dan LDH)
dan empat protein terkait perak yang baru (AhpC, NADP (+), ODH, dan dThdPase) berhasil
diidentifikasi. Dalam penelitian sebelumnya dari laboratorium kami, GroEL dideteksi sebagai
protein terkait perak di P. aeruginosa setelah paparan AgNP menggunakan lemah anion
exchangeechromatography-GE-ICP-MS
Interaksi AgNP dengan LDH juga telah diperiksa dalam penelitian sebelumnya. Salari dan
penulis-penulis mempelajari sifat kinetik dan fisikokimiaLDH di hadapan AgNPs in vitro [45].
Mereka menemukan bahwa AggNP dapat langsung mengikat LDH dan menyebabkan protein
berlangsung, akhirnya menurunkan aktivitas LDH. Eksperimen ini menunjukkan bahwa AgNP
dapat bereaksi dengan LDH intraseluler, yang konsisten dengan hasil in vitro di atas.
Karakterisasi GREL dan LDH memvalidasi keefektifan metode yang dikembangkan untuk
mengkarakterisasi protein terkait perak.