MAKALAH KROMATOGRAFI HPLC GC ELEKROFORESIS Oleh : Chrisye Dewi Puspita 058114072 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

2007 PENDAHULUAN Sekarang ini, kromatografi sangat diperlukan dalam kefarmasian dalam memisahkan suatu campuran senyawa. Dalam kromatografi, koponen-komponen terdistribusi dala dua fase. Salah satu fase adalah fase diam. Transfer massa antara fase bergerak dan fase diam terjadi bila molekul-molekul campuran serap pada permukaan partikel-partikel atau terserap di dalam pori-pori partikel atau terbagi kedalam sejumlah cairan yang terikat pada permukaan atau didalam pori. Kromatografi dibagi menjadi beberapa macam, dalam makalah ini akan dijelaskan beberapa keterangan tentang beberapa macam kroatografi, antara lain HPLC ( High Performance Liquid Chromatography), GC (Gas Chromatography) dan Elektroforesis. HPLC ( High Performance Liquid Chromatography) Dalam beberapa tahun ini teknologi HPLC dan pemakaiannya sangat berkembang da walaupun nisbi mahal, HPLC telah menjadi metode analisis rutin dan bahkan preparative pada banyak laboratorium. Alat HPLC niaga terdiri atas system pencampur pelarut yang sangat canggih yang mampu menghasilkan campuran landaian yang mengandung sampai empat linarut yang berbeda, pompa yang mampu menghasilkan tekanan sampai 6000psi atau 10.000 psi, kolom yang mengandung fase diam (atau lebih tepat penyangga), dan system pendeteki sinambung yang bermacam-macam jenisnya. Yang paling sering ditemukan, seluruh radas itu dipimpin dan dikendalikan oleh mikroprosesor. Kolom yang tersedia mempunyai banyak sekali pelat teori (lebih dari 100.000 untuk kolom 100cm), dan kromatografi dilakukan dalam kondisi yang mendekati kondisi ideal demikian rupa sehingga dapat diperoleh pemisahan yang sangat baik; seringkali, hasil dapat diperoleh dalam beberapa menit dan ditafsirkan secara kuantitatif dengan ketepatan yang lumayan. Cuplikan dapat dipisahkan secara preparative.

Sedikit banyak HPLC dan GC saling melengkapi. GC telah dilengkapi instrumen dan dikembangkan demikian rupa sehingga daya pisah yang tinggi dan hasil kuantitatif mudah diperoleh. Akan tetapi, GC mensyaratkan bahwa seyawa yang dipisahkan haruslah atsiri. HPLC mempunyai pembatas yang sebanding yaitu cuplikan harus larut didalam zat cair. Akan tetapi ini bukan pembatas yang berat., dan setidaknya HPLC dapat dipakai untuk sebagia besar senyawa tak atsiri dan senyawa berbobot molekul tinggi. Selain itu HPLC dapat dipakai untuk senyawa anorganik, yang sebagian besar tidak atsiri. HPLC biasanya dilakukan pada suhu kamar. Jadi, senyawa yang tidak tahan panas dapat diangani dengan mudah. Pada metode kromatografi cair ini digunakan kolom tabung gelas denganberacam diameter.parikel dengan dimensi yang bervariasi digunakan sebagai penunjang stasioner. Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya sedemikian rupa sehingga hanya cukup menghasilkan sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase bergerak yang seragam. Secara keseluruhan pemisahan ini memakan waktu lama. Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel penunjang stasioner tidak selalu menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau High Performance Liquid Chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang ; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi. Prinsip HPLC Luas puncak kromatografi pada kurva elusi dipengaruhi oleh tiga proses perpindahan massa yaitu difusi Eddy, difusi longitudinal dan transfer massa tidak setimbang. Sedangkanparameter-parameter yang menentukan proses berlangsungnya proses-prosess tersebut adalah : laju aliran, ukuran partikel, laju difusi dan ketebalan stasioner. Penunjang Penunjang fase diam harus tahan erhadap tekanan. Biasanya penunjang anorganik bersifat stabil dan tahan sampai tekanan 600 atm. Struktur dengan pori-pori yang besar akan rusak bila diberi tekanan tinggi. Penukar ion, mempunyai permeabilitas yang rendah bila diberi tekanan. Penunjang yang baik adalah silica gel dan alumina. Penunjang dengan bahan kimia di permukaannya (bonded phase) mempunyai kelebihan karena tidak perlu dijenuhkan lagi permukaannya oleh fase cair dan idak memerlukan prekolom. Fase diam terikat secara kovalen dengan permukaan zat padat penunjang sehingga diharapkan tidak mudah lepas dan mengkontaminasi eluen. Penunjang dengan kemampuan penukar ion pemakaiannya terbatas,karena mudah terkompresi,tetapi saat ini bermacam resin sintetis yang taha tekanan sampai 200 amosfer sudah dapat diperoleh. Resin demikian mempunyai kapasitas penukar ion antara 3 sampai 5 meq/g.

Penunjang fase diam untuk kromatografi eksklusi lebih rumit daripada resin penukar ion. Hamper semua ipe gel dalam kolom untuk jenis eksklusi tidak tahan tekanan. Penyusutan volume akan terjadi sehingga permeabilitasnya turun dan akibatnya efisiensi pemisahan menurun. Pemakaian HPLC dengan prinsip kromatografi adsorpsi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida. Zat-zat dengan kepolaran berbeda, yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair. Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapiskan zat berpori. Penukar ion gel silica yang dimodifikasi secara kimia dan penukar ion klasik. Asam-asam nukleat telah terpisahkan pada PLB, waktu analisisnya lebih pendek. Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan pada resin Zipax-SAX. Penukar ion gel silica yang dimodifikasi secara kimia mempunyai kapsitas tukar tinggi, vitamin-vitamin yang larut dalam air misalkan telah dapat dipisahkan. Pemakaian HPLC pada kromatografi eksklusi dilakukan dengan kolom panjang, tujuan utama kerjanya tetap sama yaitu penentuan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia. Pada umumnya teknik ini dapat digunakan pada setiap metode kolom kromatografi.

GC (Gas Chromatography ) Kromatografi Gas adalah metode kromatografi pertama yang dikembangkan pada jaman instrument dan elektronika yang telah merevolusikan keilmuan selama lebih dari 30 tahun. Sekarang GC dipakai secara rutin di sebagian besar laboratorium industri dan perguruan inggi. GC dapat dipakai untuk setiap campuran yang komponennya atau akan lebih baik lagi jika semua komponennya mempunyai tekanan uap yang berarti pada suhu yang dipakai untuk pemisahan. Tekanan uap atau keatsirian memungkinkan komponen menguap danbergerak bersamasama dengan fase gerak yang berupa gas. Pada kromatografi cair pembatasan yang bersesuaian ialah komponen cairan harus mempunyai kelarutan yang berarti didalam fase gerak yang berupa cairan. Secara sepintas tampaknya pembatasan tekanan uap pada Kromatografi gas lebih serius daripada pembatasan kelarutan pada kromatografi cair, secara keseluruhan memang demikian. Akan tetapi, jika kita ingat bahwa suhu sampai 4000C dapat dipakai pada kromatografi gas dan bahwa kromatografi dilakukan secara cepat untuk meminimumkan penguraian, pembatasan itu menjadi tidak begitu perlu. Disamping itu, pada KG, senyawa yang tak atsiri sering dapat dibah menjadi turunan yang lebih atsiri dan lebih stabil sebelum kromatografi. Dalam kromatografi gas, fase bergeraknya adalah gas dan zat terlarut terpisah sebagai uap. Pemisahan tercapai dengan partisi sampel antara fase gas bergerak dan fase diam berupa cairan dengan titik didih tinggi (tidak mudah menguap) yang terikat pada zat padat penunjangnya. Ada beberapa kelebihan kromatografi gas, diantaranya kita dapat menggunakan kolom lebih panjang untuk menghasilkan efisiensi pemisahan yang tinggi. Gs dan uap mempunyai viskositas yang rendah, demikian juga kesetimbangan partisi antara gas dan cairan berlangsung cepat, sehingga analisis relative cepat dan sensitifitasnya tinggi. Fase gas dibandingkan sebagian besar fase cair tidak bersifat reaktif terhadap fase diam dan zat-zat terlarut. Kelemahannya adalah tehnik ini terbatas unruk zat yang mudah menguap. Kromatografi gas merupakan metode yang tepat dan cepat untuk memisahkan campuran yang sangat rumit. Waktu yang dibutuhkan beragam, mulai dari beberapa detik utnuk campuran sederhana sampai berjam-jam untuk campuran yang mengandung 500-1000 komponen. Komponen campuran dapat diidentifikasikan dengan menggunakan waktu tambat (waktu retensi) yang khas pada kondisi yang tepat. Waktu tambat ialah waktu yang menunjukkan berapa lama suatu senyawa tertahan dalam kolom.waktu tambat diukur dari jejak pencatat pada kromatogram dan serupa dengan volumetambat dalam KCKT dan Rf dalam KLT. Dengan kalibrasi yang patut, banyaknya (kuantitas) komponen campuran dapat pula diukur secara teliti . kekurangan utama KG adalah

bahwa ia tidak mudah dipakai untuk memisahkan campuran dalam jumlah besar. Pemisahan pada tingkat mg mudah dilakukan, pemisahan campuran pada tingkat g mungkin dilakukan; tetapi pemisahan dalam tingkat pon atau ton sukar dilakukan kecuali jika tidak ada metode lain. Pada KG dan KCKT, kolom dapat dipakai kembali dan jika dirawat dengan baik dapat tahan lama. Perawatan harus dilakukan karena kolom dapat sangat mahal. Fase diam pada KG biasanya berupa cairan yang disaputkan pada bahan penyangga padat yang lembab , bukan senyawa padat yang berfungsi sebagai permukaan yang menyerap (kromatografi gas-padat). Sistem gas-padat telah dipakai secara luas dalam pemurnian gas dan penghilangan asap, tetapi kurang kegunaannya dalam kromatografi. Pemakaian fase cair memungkinkan kita memilih dari sejumlah fase diam yang sangat beragam yang akan memisahkan hampir segala macam cmapuran. Satu-satunya pembatas pada pemilihan cairan yang demikian ialah bahwa zat cair itu harus stabil dan tidak atsiri pada kondisi kromatografi. Akan tetapi, keadaan ini berubah akibat pengembangan fase terikat dan pemakaian kolo kapiler atau kolom tabung terbuka yang sangat efisien. Pada fase terikat, cairan sebenarnya terikat pada penyangga padat atau pada dinding koplom kapiler, tidak hanya disaputkan begitu saja. Pemakaian detector untuk menganalisis efluen kromatograf secara sinambung telah memungkinkan adanya KG dan KCKT. Pada KG, tersedianya berbagai detector, pemakaiannya yang umum untuk banyak jenis senyawa, dan tingkat kepekaannya yang tinggi telah memungkinkan penentuan secara teliti berbagai jenis komponen dalam kisaran yang besar, kadang-kadang dalam jumlah yang sangat kecil. Tersedianya detector selektif, misalnya detector yang hanya mendeteksi senyawa yang mengandung P, N, atau S merupakan hal yang sangat penting pula. Ini berbeda dengan KCKT yang hanya menyediakan lebih sedikit jenis detector dan kurang peka. Petunjuk cara kerja Walaupun beberapa system KG sangat rumit, pada dasarnya cara kerjanya sama. Jika KG telah dinyalakan maka dapat dilakukan beberapa langkah berikut ini ; 1. istrumen diperiksa, terutama jika tidak dipakai terus-menerus. Ini dilakukan untuk mengecek apakah telah dipasang kolom yang tepat, apakah septum injector tidak rusak (apakah ada lubang besar atau bocor karena sering dipakai), apakah sambungan saluran gas kedap, apakah tutup tanur tertutup rapat, apakah semua bagian listrik bekerja dengan baik, dan apakah detector yang terpasang sesuai. 2. aliran gas kekolom dimulai atau disesuaikan. Ini dilakukan dengan membukan katup utama pada tangki gas dan kemudian memutar katup (diafragma) sekunder kesekitar 15psi dan membuka katup jarum sedikit. Ini memungkinkan aliran gas yang lambat (2-5 ml)/menit untuk kolom kemas dan sekitar 0,5ml/menit untuk kolom kapiler melewati system dan melindungi kolom dan detector terhadap perusakan secara oksidasi. Dalam banyak instrument modern, aliran gas dapat diatur dengan rotameter atau aliran otomatis atau pengendali tekanan, atau dapat dimasukkan melalui modul pengendali berlandas

mikroprosesor. Apapun jenisnya, sambungan system (terutama sambungan kolom) harus dicek dengan larutan sabun untuk mengetahui apakah ada yang bocor, atau dengan larutan khusus untuk mendeteksi kebocoran (SNOOP),atau dapat juga dengan larutan pendeteksi kebocoran niaga. 3. kolom dipanaskan sampai suhu awal yang dikehendaki. Ini dilakukan, pada instrument buatan lama, dengan memutar transformator tegangan peubah yang mengendalikan gelungan pemanas dalam tanur kesekitar 90 V.

ELEKTROFORESIS Definisi Tehnik pemisahan komponen-komponen dengan pengaruh arus listrik sehingga terjadi laju perpindahan disebut sebagai suatu elektroforesis atau elektrokromatografi. Secara luas teknik ini diklasifikasikan dalam tiga kelompok yaitu elektroforesis free boundary, elektroforesis wilayah dan elektroforesis kontinyu. Prinsip Elektroforesis Jika suatu fase zat bermuatan, diberi beda potensial, fase tersebut akan berpindah sepanjang medium yang kontinyu kearah katoda atau anoda sesuai dengan muatan partikel. Fenomena ini adalah elektroforesis. Dasar elektroforesis adalah pembentukan suatu ketidakhomogenan atau gradasi konsentrasi sepanjang system. Koloid, protein enzim menunjukkan mobilitas elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik yang dapat digunakan untuk identifikasi zatzat spesifik. Pemisahan dapat dilakukan bila senyawa-senyawa yang telah terpisah tidak secara spontan bercampur kembali akibat sirkulasi konvektif. Keterbatasan elektroforesis free boundary dapat diatasi secara parsial dengan melakuka kromatografi pendahuluan sebelum proses elektroforesisnya sendiri. Inidilakukan dengan mencampurkan larutan buffer dan memvariasikan konsentrasi nonelektrolit yang larut, kemudian biarkan merayap vertical pada tabung elektroforesis yang akan digunakan, sehingga terbentuk gradient perbedaan kerapatan akibat gravitasi. Di pihak lain bila perpindahan elektroforesis dilakukan pada suatu medium berpori,

wilayah perpindahannya tidak dipengaruhi oleh gradient kerapatan dan temperature. Pada medium tersebut aliran cairan dalam tabung berbanding terbalik terhadap kuadrat dari jari-jari penampang melintang tabung. Kertas saring, agar, kanji, gelatin, butiran-butiran kaca umumnya digunakan karena memiliki rongga kapiler. Kertas penyaringlah yang palng sering digunakan karena pemisahan yang sempurna dapat dilakukan dan mudah dikelola. Pemisahan dapat dilakukan baik horizontal ataupun erikal dan interferensi anomaly paling kecil pada boundary. Pada umumnya istilah elektrokromatografi digunakan untuk pemisahan berdasarka perbedaan transport fisik zatterlarut yang bermuatan di dalam medium kertas akibat pengaruh gradient potensial. Perpindahan partikel bermuatan dalam kertas tergantung pada tanda dan besarnya muatan pada zat terlarut, permukaan, muatan, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kuat io, pH, temperatur, viskositas, adsortiitas zat terlarut dan sifat-sifat fisika kimia lainnya medium migrasi. Ion yang berpindah pada suatu arah juga mempengaruhi mobilitas ion-ion lain yang bergerak pada arah yang berlawanan. Peralatan dan Metodologi Secarik kertas saring dibasahi dengan suatu elektrolit dan direntangkan secara horizontal diantara dua ruang elektroda yang berbeda potensial. Sampel diletakkan ditengah-tengah lembaran kertas. Lembaran kertas diletakkan diantara dua lempeng kaca untuk mencegah penguapan elektrolit. Arus searah digunakan pada beda teganan sekitar 100-300 volt, elektroda yang digunakan karbon dari platina. Kombinasi elektromatografi dengan aliran pelarut yang simultan untuk memisahkan zat-zat inik juga telah dikembangkan. Elekroforesis Wilayah Ada berbagai factor yang mempengaruhi laju perpindahan elektroforesis wilayah. Factorfaktor yang mempengaruhi pergerakan ion adalah mobilitas ion, tipe resolusinya, macam larutan buffernya, pH yang digunakan, kuat ion zat terlarut, temperature, ada atau tidaknya fenomena elektrolisis atau elektroosmosis. Medium yang umum digunakan adalah kertas saring, selulosa, asetat, gel seperti kanji, poliakrilamida dan bubuk gel. Elektroforesis Tirai (Elektroforesis Kontinyu) Elektroforesis kontinyu yaitu suatu elektroforesis yang dilakukan secara kontinyu. Suatu tirai dari kertas saring digunakan yang mana terendam dalam larutan buffer. Suatu aplikator digunakan untuk meneteskan sampel. Sampel masuk dalam aplikator dari suatu reservoir sampel. Kedua ujung kertas saring dalam bentuk alur tercelup dalam dua ruang elektroda. Dengan pemberian tegangan, partikel zat terlarut mulai bergerak dan komponen terpisahkan dalam berbagai permukaan. Pemakaian Analitik Elektrokromatografi Homogenitas wilayah elektrokromatografi adalah suatu criteria penting untuk

memperoleh kemurnian. Teknik elektrokromatografi pada kertas telah digunakan untuk pemisahan komponen-komponen yang sulit dipisahkan. Pemisahan anorganik segera dapat dil;akukan melalui agen pengompleks. Agen ini mempengaruhi laju kromatografi sedangkan kompleks elektromigrasi mempunyai afinitas adsorbsi yang berbeda terhadap medium migrasi serta berbagai bentukion sederhana misalkan Ag, Ni berpindah kearah katoda, tetapi dengan penambahan EDTA, Ni saja yang pindah ke anoda. Logam-logam alkali dan magnesium juga dipisahkan. Pemisahan Pb, Pt, Rh, Ir, Os, Ru, dan Au secara kuantitatif pada secarik kertas diperoleh dengan elektrokromatografi dalam berbagai larutan elektrolit. Setelah kertas, medium lain yang tepat untuk percobaan elektromigrasi adalah kanji. Pemisahan pada umumnya dilaksanakan dalam kolom, dan kadangkala untuk sejumlah komponen mempunyai beberapa kelebihan disbanding dengan kertas. Teknik elektrokromatografi banyak digunakan pada pemisahan ion-ion anorganik dan diagnosis klinik. Osmosis Terbalik Teknik ini adalah teknik yang sedang berkembang. Diantara pemakaiannya adalah pengolahan air limbah. Biasanya air dibersihkan dengan mengeluarkan kotoran dari air,tetapi dengan cara ini justru air diperas keluardari limbah air. Limbah berupa air garam dimasukkan melalui bagian celah sel. Pada bagian bawah air garam akan tersekat oleh suatu membrane semipermeabel yang umumnya terbuat dari polistirena, cellophane polivinil klorida atau etil selulosa. Air segar cenderung untuk bergerak melalui membrane semi permeable menuju bagian yang konsentrasi garamnya tinggi, tetapi dengan memberikan tekanan yang cukup tinggi pada bagian air garamnya, tekanan osmosis normalinya dapat dibalik, berarti aliran dan keluar pada saluran bagian bawah. Osmosis terbalik tidak mempunyai pemakaian analitik. Elektrodialisis Metode ini merupakan metode yang masih dapat dikembangkan, yang mana ion-ion positif dan negative dalam suatu aliran air rawa-rawa dipisahkan dengan melakukannya sepanjang membrane penukar ion dibawah pengaruh medan listrik.air rawa-rawa dimasukkan melalui tiga saluran pada bagian atas sel. Suatu medan listrik dengan kutub membuat ion positif dan ion negative bergeser pada arah yang berlawanan. Dengan pemilihan membrane penukar ion yang tepat, maka dimungkinkan menjadikan membrane kation permeable terhadap kation dan penukar anion yang permeable terhadap anion. Dengan pengaturan kondisi aliran, air yang keluar sebagai efluen pada penyalur bagian tengah akan mengandung garam yang lebih rendah disbanding kedua penyalur lainnya.teknik ini sebenarnya dasar pengembangan tekik osmosis terbalik.

DAFTAR PUSTAKA Anonim, 1995, Farmakope Indonesia.Edisi IV.hal. 102. DepKes RI. Jakarta Gritter, dkk., 1991, Pengantar Kromatografi. Hal.34-35,186. ITB Press. Bandung Khopkar, S.M. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Hal.160,166, 167-168. UI Press. Jakarta Mulja, Muhammad & Suharman, 1995, Analisis Instrumental. Hal 150. Airlangga University Press. Surabaya Diposting oleh andigo di 9:25 AM Label: istilah farmasi, istilah kedokteran, KROMATOGRAFI 0 komentar: Post a Comment

Newer Post Older Post Home Subscribe to: Post Comments (Atom)

Kromatografi
Ditulis oleh Yoshito Takeuchi pada 03-01-2009 Walaupun agak tidak terlalu jelas, kontribusi kromatografi pada perkembangan kimia modern tidak dapat dipandang rendah. Tanpa teknik kromatografi, sintesis senyawa murni (atau hampir murni) akan sangat sukar , dan dalam banyak kasus, hampir tidak mungkin. Di awal abad ke-20, kimiawan Rusia Mikhail Semnovich Tsvet (1872-1919) menyiapkan kolom yang diisi dengan serbuk kalsium karbonat, dan kedalamnya dituangkan campuran pigmen tanaman yang dilarutkan dalam eter. Secara mengejutkan, pigmen memisahkan dan membentuk lapisan berwarna di sepanjang kolom. Ia menamakan kromatografi pada teknik pemisahan baru ini (1906). Kemudian kimiawan dari Swiss Richard Martin Willsttter (1872-1942) menerapkan teknik ini untuk risetnya yakni khlorofil untuk menunjukkan manfaat teknik ini, dan sejak itu banyak perhatian diberikan pada kromatografi. Kromatografi adalah teknik untuk memisahkan campuran menjadi komponennya dengan bantuan perbedaan sifat fisik masing-masing komponen. Alat yang digunakan terdiri atas kolom yang di dalamnya diisikan fasa stasioner (padatan atau cairan). Campuran ditambahkan ke kolom dari ujung satu dan campuran akan bergerak dengan bantuan pengemban yang cocok (fasa mobil). Pemisahan dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen dalam kolom, yang ditentukan oleh kekuatan adsorpsi atau koefisien partisi antara fasa mobil dan fasa diam (stationer). Komponen utama kromatografi adalah fasa stationer dan fasa mobil dan kromatografi dibagi menjadi beberapa jenis bergantung pada jenis fasa mobil dan mekanisme pemisahannya, seperti ditunjukkan di Tabel 12.1 Tabel 12.1 Klasifikasi kromatografi Kriteria Fasa mobil Mekanisme Nama Kromatografi cair, kromatografi gas Kromatografi adsorpsi, kromatografi partisi Kromatografi pertukaran ion

kromatografi gel Fasa stationer Kromatografi kolom, kromatografi lapis tipis, kromatografi kertas

Beberapa contoh kromatografi yang sering digunakan di laboratorium diberikan di bawah ini.

a. Kromatografi partisi
Prinsip kromatografi partisi dapat dijelaskan dengan hukum partisi yang dapat diterapkan pada sistem multikomponen yang dibahas di bagian sebelumnya. Dalam kromatografi partisi, ekstraksi terjadi berulang dalam satu kali proses. Dalam percobaan, zat terlarut didistribusikan antara fasa stationer dan fasa mobil. Fasa stationer dalam banyak kasus pelarut diadsorbsi pada adsorben dan fasa mobil adalah molekul pelarut yang mengisi ruang antar partikel yang ter adsorbsi. Contoh khas kromatografi partisi adalah kromatografi kolom yang digunakan luas karena merupakan sangat efisien untuk pemisahan senyawa organik (Gambar 12.3). Kolomnya (tabung gela) diisi dengan bahan seperti alumina, silika gel atau pati yang dicampur dengan adsorben, dan pastanya diisikan kedalam kolom. Larutan sampel kemudian diisikan kedalam kolom dari atas sehingga sammpel diasorbsi oleh adsorben. Kemudian pelarut (fasa mobil; pembawa) ditambahkan tetes demi tetes dari atas kolom. Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke bawah (fasa mobil) dan pelarut yang teradsorbsi oleh adsorben (fasa stationer). Selama perjalanan turun, zat terlarut akan mengalami proses adsorpsi dan partisi berulang-ulang. Laju penurunan berbeda untuk masing-masing zat terlarut dan bergantung pada koefisien partisi masing-masing zat terlarut. Akhirnya, zat terlarut akan terpisahkan membentuk beberapa lapisan. Akhirnya, masing-masing lapisan dielusi dengan pelarut yang cocok untuk memberikan spesimen murninya. Nilai R didefinisikan untuk tiap zat etralrut dengan persamaan berikut. R = (jarak yang ditempuh zat terlarut) / (jarak yang ditempuh pelarut/fasa mobil).

Gambar 12.3 Diagram skematik kromatografi

b. Kromatografi kertas
Mekanisme pemisahan dengan kromatografi kertas prinsipnya sama dengan mekanisme pada kromatografi kolom. Adsorben dalam kromatografi kertas adalah kertas saring, yakni selulosa. Sampel yang akan dianalisis ditotolkan ke ujung kertas yang kemudian digantung dalam wadah. Kemudian dasar kertas saring dicelupkan kedalam pelarut yang mengisi dasar wadah. Fasa mobil (pelarut) dapat saja beragam. Air, etanol, asam asetat atau campuran zat-zat ini dapat digunakan. Kromatografi kertas diterapkan untuk analisis campuran asam amino dengan sukses besar. Karena asam amino memiliki sifat yang sangat mirip, dan asam-asam amino larut dalam air dan tidak mudah menguap (tidak mungkin didistilasi), pemisahan asam amino adalah masalah paling sukar yang dihadapi kimiawan di akhir abad 19 dan awal abad 20. Jadi penemuan kromatografi kertas merupakan berita sangat baik bagi mereka. Kimiawan Inggris Richard Laurence Millington Synge (1914-1994) adalah orang pertama yang menggunakan metoda analisis asam amino dengan kromatografi kertas. Saat campuran asam amino menaiki lembaran kertas secara vertikal karena ada fenomena kapiler, partisi asam amino antara fasa mobil dan fasa diam (air) yang teradsorbsi pada selulosa berlangsung berulang-ulang. Ketiak pelarut mencapai ujung atas kertas proses dihentikan. Setiap asam amino bergerak dari titik awal sepanjang jarak tertentu. Dari nilai R, masing-masing asam amino diidentifikasi. Kromatografi kertas dua-dimensi (2D) menggunakan kertas yang luas bukan lembaran kecil, dan sampelnya diproses secara dua dimensi dengan dua pelarut.

Gambar 12.4 Contoh hasil kromatografi kertas pigmen dari www.indigo.com/ science-supplies/filterpaper. html

c. Kromatografi gas
Campuran gas dapat dipisahkan dengan kromatografi gas. Fasa stationer dapat berupa padatan (kromatografi gas-padat) atau cairan (kromatografi gas-cair). Umumnya, untuk kromatografi gas-padat, sejumlah kecil padatan inert misalnya karbon teraktivasi, alumina teraktivasi, silika gel atau saringan molekular diisikan ke dalam tabung logam gulung yang panjang (2-10 m) dan tipis. Fasa mobil adalah gas semacam hidrogen, nitrogen atau argon dan disebut gas pembawa. Pemisahan gas bertitik didih rendah seperti oksigen, karbon monoksida dan karbon dioksida dimungkinkan dengan teknik ini. Dalam kasus kromatografi gas-cair, ester seperti ftalil dodesilsulfat yang diadsorbsi di permukaan alumina teraktivasi, silika gel atau penyaring molekular, digunakan sebagai fasa diam dan diisikan ke dalam kolom. Campuran senyawa yang mudah menguap dicampur dengan gas pembawa disuntikkan ke dalam kolom, dan setiap senyawa akan dipartisi antara fasa gas (mobil) dan fasa cair (diam) mengikuti hukum partisi. Senyawa yang kurang larut dalam fasa diam akan keluar lebih dahulu. Metoda ini khususnya sangat baik untuk analisis senyawa organik yang mudah menguap seperti hidrokarbon dan ester. Analisis minyak mentah dan minyak atsiri dalam buah telah dengan sukses dilakukan dengan teknik ini. Efisiensi pemisahan ditentukan dengan besarnya interaksi antara sampel dan cairannya. Disarankan untuk mencoba fasa cair standar yang diketahui efektif untuk berbagai senyawa. Berdasarkan hasil ini, cairan yang lebih khusus kemudian dapat dipilih. Metoda deteksinya, akan mempengaruhi kesensitifan teknik ini. Metoda yang dipilih akan bergantung apakah tujuannya analisik atau preparatif.

d. HPLC
Akhir-akhir ini, untuk pemurnian (misalnya untuk keperluan sintesis) senyawa organik skala besar, HPLC (high precision liquid chromatography atau high performance liquid chromatography) secara ekstensif digunakan. Bi la zat melarut dengan pelarut yang cocok, zat tersebut dapat dianalisis. Ciri teknik ini adalah penggunaan tekanan tinggi untuk mengirim fasa mobil kedalam kolom. Dengan memberikan tekanan tinggi, laju dan efisiensi pemisahan dapat ditingkatkan dengan besar. Silika gel atau oktadesilsilan yang terikat pada silika gel digunakan sebagai fasa stationer. Fasa stationer cair tidak populer. Kolom yang digunakan untuk HPLC lebih pendek daripada kolom yang digunakan untuk kromatografi gas. Sebagian besar kolom lebih pendek dari 1 m. Kromatografi penukar ion menggunakan bahan penukar ion sebagai fasa diam dan telah berhasil digunakan untuk analisis kation, anion dan ion organik.

Latihan
12.1 Distilasi fraktional Tekanan uap dua cairan A dan B adalah 1,50 x 104 N m-2 dan 3,50 x 104 N m-2 pada 20C. dengan menganggap campuran A dan B mengikuti hukum Raoult, hitung fraksi mol A bila tekanan uap total adalah 2,90 x 104 N m-2 pada 20C. 12.1 Jawab Fraksi mol A, nA, dinyatakan dengan. (nA x 1,50 x 104) + (1 - nA) x 3,50 x 104 = 2,90 x 104 nA = 0,30

Dasar Analisis Vitamin C dengan Metode HPLC

ditulis oleh: 71mm0 | dalam Kategori Kimia Analisis, Kimia Farmasi Analisis Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk suatu lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat atau melalui lapisan yang stasioner. Fasa stasioner mugkin suatu zat padat atau suatu cairan, dan fasa yang bergerak mungkin suatu cairan atau suatu gas. Maka semua jenis kromatografi yang dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cairpadat, gas-padat, cair-cair, dan gas-cair (Underwood, 1986). Pembahasan teknik kromatografi modern baru lengkap bila disebut kromatografi cairan penampilan tinggi (HPLC). Kromatografi cairan kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan dalam mana fase cair yang mobil mengalir lambat-lambat lewat kolom karena gravitasi. Umumnya metode itu dicirikan oleh efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cairan hidup kembali dengan sangat menyolok karena dikembangkannya sistem tekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2 (3000 p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dengan partikel pendukung berukuran sekitar 30 m dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm 3m-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi cairan yang biasa. Meskipun peralatan yang tersedia di pasar dewasa ini agak mahal. HPLC telah terbukti luas penggunaannya dalam dalam anorganik kimia organik. mungkin, Pengembangan misalnya penerapan bidang menjadi dalam

kromatografi pertukaran ion di mana telah tersedia di pasar dengan nama dagang Zipax resin peliklar, yakni resin yang dihasilkan dalam bentuk saluran tipis pada permukaan manik kaca yang blat (diameter 2050 mikrometer). Manik-manik itu mempunyai permukaan berpori yang tebalnya 2 mikrometer yang berperan sebagai pengikat saluran resin itu (Bassett et. all., 1994). Umumnya metode kromatografi seperti adsorpsi, partisi, dan penukar ion adalah contoh-contoh dari kromatografi kolom. Pada metode kromatografi cair ini digunakan kolom tabung gelas dengan bermacam diameter. Partikel dengan dimensi yang bervariasi digunakan sebagai penunjang stasioner. Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya sedemikian rupa sehingga hanya cukup menghasilkan sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase bergerak yang seragam. Secara keseluruhan pemisahan ini memakan waktu lama. Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel penunjang stasioner tidak selalu menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50 m; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi (Khopkar, 2003). Bila dibandingkan terhadap kromatografi gas-cair/ gas-liquid chromatography (GLC), maka HPLC lebih bermanfaat untuk isolasi zat tidak mudah menguap, demikian juga zat yang secara termal tidak stabil. Tetapi ditinjau dari kecepatan dan kesederhanaan, GC lebih baik. Kedua teknik ini komplementer satu sama lainnya, keduanya efisien, sangat selektif hanya memerlukan sampel berjumlah sedikit

serta keduanya dapat digunakan untuk analisis kuantitatif (Khopkar, 2003).

Susunan kimia vitamin C ditemukan pada tahun 1933 oleh ilmuwan Inggris dan Swiss. Isolasi asam askorbat mula-mula ditemukan oleh King dari USA dan Szent-Gyorgy dari Hungaria. Vitamin ini mempunyai dua bentuk, yaitu bentuk oksidasi (bentuk dehydro) dan bentuk reduksi. Kedua bentuk ini mempunyai aktivitas biologi. Dalam makanan bentuk reduksi yang terbanyak. Banyak dehydro dapat terus teroksidasi menjadi diketogulonic acid yang inaktif. Keadaan vitamin C inaktif ini sering terjadi pada proses pemanasan (bila sayur-sayuran dimasak). Di dalam suasana asam vitamin ini lebih stabil daripada dalam basa yang menjadi inaktif (diketogulonic acid) (Prawirokusumo, 1991). *SUMBER:

Bassett, J., R.C. Denney, G.H. Jeffery, dan J. Mendham, 1994, Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta. Day, R.A dan Underwood, A.L., 1986, Analisis Kimia Kuantitatif, Erlangga, Jakarta. Khopkar, S.M., 2003, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI Press, Jakarta. Prawirokusumo, Soeharto, Prof. Dr. M.Sc., 1991, Biokimia Nutrisi dan Vitamin, BPFE, Yogyakarta.