Teknik hipenasi untuk karakterisasi dan kuantifikasi

dari isoform metallothionein

abstrak : Perkembangan terbaru dalam kopling sangat teknik pemisahan selektif seperti elektroforesis
kapiler (CE) dan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) untuk elemen-spesifik dan molekul-spesifik
detektor, seperti spektrometri massa plasma yang digabungkan secara induktif (ICP-MS) dan
electrospray ionization-tandem spektrometri massa (ESI-MS / MS) untuk karakterisasi dan kuantifikasi
metallothioneins (MTs) sangat penting ditinjau dan didiskusikan. Ulasan ini memberikan pembaruan
berdasarkan pada literatur selama lima tahun terakhir. Kopling dari CE ke ICP-MS terutama disorot.
Sebagai hasil dari kemajuan dalam teknologi antarmuka baru untuk CE-ICP-MS, topik penelitian yang
disajikan dalam literatur berubah dari "karakterisasi antarmuka oleh metallothioneins" ke "karakterisasi
metallothioneins oleh CE-ICP-MS ”. Aplikasi baru CE-ICP-MS ke analisis MTs dalam sampel nyata
dirangkum. Potensi dari teknik pengenceran isotop on - line untuk kuantifikasi MTs dan untuk
penentuan stoikiometrik komposisi kompleks metalloprotein dibahas. Selanjutnya, pemilihan makalah
yang relevan berurusan dengan HPLC-ICP-MS untuk analisis MT dirangkum dan dibandingkan dengan
mereka yang berurusan dengan CE-ICP-MS. Secara khusus, penggunaan size-exclusion (SE) -HPLC
sebagai langkah pemisahan awal untuk metallothioneins secara nyata sampel sebelum kromatografi
atau elektroforesis lebih lanjut pemisahan dipertimbangkan. Selain itu, aplikasi dari spektrometri massa
ionisasi electrospray-tandem (ESI-MS / MS) untuk identifikasi metallothionein isoform mengikuti
elektroforesis atau kromatografi pemisahan dibahas.

Elektroforesis kapiler digabungkan dengan ICP-MS

Isoform metallothionein dapat berbeda hanya dalam beberapa asam amino dan oleh karena itu
pemisahannya memerlukan teknik resolusi tinggi yang mampu memisahkan senyawa dengan perbedaan
kecil dalam muatan atau hidrofobisitas. Elektroforesis kapiler memiliki potensi besar untuk pemisahan
isoform metallothionein dan sub-isoform [15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25], dan sambungan CE
ke ICP-MS menjanjikan logam Deteksi-spesifik dikombinasikan dengan sensitivitas tinggi. Selain itu,
volume sampel kecil yang dibutuhkan (20–30 μL) menjadikan CE-ICP-MS teknik yang ideal untuk
menyelidiki bahan biologis, di mana seringkali hanya sedikit sampel yang tersedia. Sejumlah artikel telah
berurusan dengan analisis isoform MT menggunakan CE-ICP-MS. Ringkasan diberikan pada Tabel 1.

Masalah utama dalam tanda hubung CE ke ICP-MS adalah pembangunan antarmuka. Ada tiga
persyaratan utama yang harus dipenuhi oleh desain antarmuka [34, 41]:

• antarmuka harus menyediakan koneksi listrik dan arus listrik yang stabil untuk pemisahan
elektroforesis yang dapat direproduksi,

• antarmuka harus menyesuaikan laju aliran dari aliran elektro-osmotik (EOF) di dalam kapiler CE
dengan laju aliran nebulizer. Laju EOF tipikal adalah 0,1-0,9 μL mnt-1 tergantung pada dimensi kapiler
dan tegangan; laju aliran nebulizer kaca konsentris komersial (Meinhard®) adalah 100-1000 μL min-1
dan nebulizer mikrokonsentrik adalah 10-100 μL min-1, dan
• antarmuka harus mencegah terjadinya aliran laminar di dalam kapiler CE yang disebabkan oleh
nebulizer; ini berpotensi masalah yang sangat serius karena dapat mengganggu daya resolusi tinggi dari
elektroforesis kapiler.

CE-ICP-MS untuk karakterisasi metallothioneins

Bersama dengan sebuah makalah yang menjelaskan dua desain antarmuka mereka [31], Majidi dan
Miller-Ihli menerbitkan artikel kedua [32] yang menangani sumber kesalahan potensial pada CE-ICP-MS.
Dalam konteks ini mereka tidak hanya menggunakan MTs untuk karakterisasi antarmuka CE-ICP-MS,
tetapi juga menerapkan sistem CE-ICP-MS mereka untuk menunjukkan degradasi metallothionein hati
kelinci setelah dua minggu tanpa pendinginan.

Pekerja pertama yang benar-benar menggunakan CE-ICP-MS sebagai metode baru untuk karakterisasi
isoform metallothionein adalah Mounicou et al. [35] Tujuan dari penelitian mereka adalah investigasi
sistematis dari asal sinyal dalam elektropherogram persiapan MT yang mengandung Cd, Cu, dan Zn
menggunakan ICP-MS untuk mendeteksi kompleks logam yang ada. Mereka menyelidiki persiapan MT
dari hati kelinci dan persiapan lebih lanjut yang dimurnikan MT-1 dan MT-2, biasanya digunakan untuk
menguji antarmuka. Meskipun mereka menggunakan bahan sampel yang sama dengan kelompok
penelitian lain sebelumnya, pekerjaan ini dapat dianggap sebagai titik balik dalam penelitian MT dengan
CE-ICP-MS, karena MTs sekarang menjadi objek investigasi. Selain itu, penulis menggunakan CE-ESI-MS
sebagai metode paralel dengan tujuan mengidentifikasi isoform MT. Meskipun efisiensi pemisahan yang
lebih rendah dari CE-ESI-MS dibandingkan dengan ICP-MS, adalah mungkin untuk mendapatkan data
untuk massa molekul dari puncak dalam electropherogram, dari mana penulis mendapatkan formula
tentatif untuk kompleks metallothionein. Gambar 3 menunjukkan hasil electropherogram dan spektrum
MS, dan Tabel 3 memberikan data yang sesuai (diperoleh dari Acuan [35]).

Pekerjaan selanjutnya oleh kelompok yang sama [36] memiliki tujuan mempelajari pertukaran logam di
kompleks MT-logam menggunakan CE-ICP-MS untuk mengklarifikasi puncak yang berbeda yang diamati
dalam electropherograms MTs yang mungkin berpotensi berasal dari kompleks logam yang berbeda dari
isoform yang sama . Oleh karena itu, mereka menyelidiki persiapan hati kelinci MT-1 dan MT-2 yang
populer dan hati tikus rekombinan MT-1 melalui titrasi dengan Cu (I) dan Cd (II). Sejumlah kompleks
logam campuran dengan waktu migrasi berbeda diamati sebagai fungsi rasio Cu: Cd dalam sistem.

Kromatografi cair kinerja tinggi digabungkan dengan ICP-MS

Sebagai teknik pelengkap untuk CE, kromatografi cair kinerja tinggi juga memiliki kemampuan untuk
memisahkan isoform metallothionein. Kopling HPLC ke ICP-MS dapat dengan mudah direalisasikan,
karena laju aliran kromatografi sangat cocok dengan laju aliran nebuliser umum untuk ICP-MS. Namun,
eluen HPLC harus ditoleransi oleh plasma dan sistem inlet spektrometer massa. Ini berarti bahwa
konsentrasi pelarut organik yang tinggi atau konsentrasi garam yang tinggi harus dihindari. Untuk
metallothionein isoform separasi ukuran-pengecualian (SE) -HPLC, pertukaran ion-HPLC, dan
reversedphase (RP) -HPLC dapat digunakan. Dalam karya terbaru, Wolf [42] membandingkan tiga mode
HPLC ini untuk pemisahan MT-1 dan MT-2 dalam persiapan MT komersial dari hati kelinci, seperti yang
ditunjukkan pada Gambar. 4a-c. SE-HPLC tidak dapat memisahkan MT-1 dan MT-2 (Gbr. 4a), sedangkan
puncak MT-1 jelas diselesaikan dari puncak MT-2 (Gbr. 4b dan c) dengan penukar ion-HPLC dan RP-
HPLC. Berdasarkan data ini dan dibandingkan dengan pemisahan yang dicapai oleh CE-ICP-MS untuk
persiapan MT yang sama (bandingkan dengan Gambar. 2), dapat dinyatakan bahwa elektroforesis
kapiler menunjukkan efisiensi yang lebih baik daripada HPLC untuk pemisahan isoform MT (lihat Gambar
2). Lebih lanjut, kemungkinan interaksi MTs dengan fase diam dan bergerak dalam HPLC yang dapat
menyebabkan denaturasi protein atau kehilangan ion logam, harus dipertimbangkan. Pengecualian
ukuran - HPLC kurang penting dibandingkan pertukaran ion dan RP-HPLC di mana interaksi MTs dengan
fase stasioner dan seluler tidak dapat sepenuhnya dikecualikan. Satu keuntungan penting dari HPLC-ICP-
MS dibandingkan dengan CE-ICP-MS adalah sensitivitas yang lebih tinggi karena volume injeksi yang
lebih besar dalam HPLC (beberapa μL hingga 1 mL dalam HPLC vs beberapa nL di CE). Sensitivitas yang
lebih tinggi ini membuat teknik HPLC-ICP-MS lebih berlaku daripada CE-ICP-MS untuk analisis MT pada
tingkat yang tidak diinduksi dalam sampel nyata.

Kromatografi eksklusi ukuran preparatif sebagai langkah awal menuju pemisahan lebih lanjut

Kerugian utama SE-HPLC dalam analisis MT adalah tidak dapat membedakan antara isoform MT-1 dan
MT-2. Di sisi lain, teknik pemisahan ini (dengan deteksi ICP-MS) berguna untuk menunjukkan fraksi yang
mengandung logam dalam sitosol, cairan tubuh, atau ekstrak tumbuhan, dan untuk mengisolasi MTs
dari protein (logam) lainnya. Beberapa penulis [50, 52, 53, 54, 55, 56] telah mengusulkan penggunaan
kromatografi ukuran-eksklusi (SEC) sebagai langkah awal dalam prosedur analitis untuk analisis isoform
MT pada hewan atau jaringan manusia. Persiapan sitosol dari jaringan biasanya dilakukan dengan
metode yang dijelaskan untuk contoh dalam referensi. [44, 57, 58, 59, 60]. Metode persiapan [14]
umumnya terdiri dari langkah-langkah homogenisasi dan ultrasentrifugasi, kadang-kadang diikuti
dengan perlakuan panas. Selanjutnya, sitosol difraksinasi dengan kromatografi eksklusi ukuran
preparatif pada langkah awal sebelum pemisahan kromatografi atau elektroforetik lebih lanjut. Untuk
menghindari degenerasi MTs oleh oksidasi selama pengumpulan fraksi, reagen reduktif seperti 2-
mercaptoethanol atau dithiotreitol harus ditambahkan ke eluen.

HPLC penukar anion

Isoform MT dapat dipisahkan oleh HPLC pertukaran-anion karena muatan negatifnya dalam larutan air.
Dalam penelitian MT teknik ini telah digunakan untuk memisahkan metallothioneins ke dalam dua kelas
MT-1 dan MT-2, tetapi tidak dapat membedakan antara perbedaan kecil dalam muatan listrik yang
terjadi pada sub-isoform [61]. Bahan kemasan yang paling cocok adalah penukar anion basa lemah
dengan gugus fungsi dietilaminoetil (DEAE). Kromatografi penukar anion yang digabungkan dengan
detektor spesifik logam telah secara langsung diterapkan pada analisis MT dalam sitosol [44, 62] atau
dalam fraksi setelah pemisahan SEC preparatif [53, 54, 63]. Buffer berair dengan gradien konsentrasi
linier umumnya diterapkan untuk memisahkan MTs, tetapi sayangnya, dalam sistem kopling dengan ICP-
MS, konsentrasi akhir 250 mmol L – 1 yang biasa tidak dapat ditoleransi dengan baik oleh spektrometer
massa sehingga efisiensi pemisahan penuh tidak dapat tercapai. Goenaga et al. [62] menggunakan
sistem pembuatan hidrida antara kolom kromatografi dan ICP-MS. Dalam hal ini, konsentrasi buffer
tinggi tidak mempengaruhi ICP-MS dan sensitivitas 16 kali lipat lebih tinggi dapat dicapai. Baru-baru ini,
kromatografi penukar anion preparatif juga digunakan untuk fraksinasi sitosol otak manusia sebagai
langkah tambahan sebelum pemisahan dengan CE-ICP-MS [56].

HPLC fase terbalik

Kromatografi fase terbalik dengan kolom C4, C8, atau C18 adalah teknik yang sering digunakan untuk
pemisahan isoform MT [14, 64]. MTs dielusi oleh buffer berair dengan penurunan bertahap dalam
polaritas yang dihasilkan oleh penambahan metanol atau asetonitril. Kerugian dari RP-HPLC adalah
durasi lama dari kromatografi berjalan (40-60 menit); fase diam mikropartikulat telah dipelajari sebagai
sarana untuk mengurangi waktu analisis untuk pemisahan MTs [61]. Dengan deteksi ICP-MS, kerucut Pt
dan penambahan oksigen ke gas nebulizer direkomendasikan karena pelarut organik yang digunakan
untuk gradien elusi. Tren masa depan yang menjanjikan melibatkan penggunaan paralel detektor ICP-
MS dan ESI-MS untuk HPLC fase terbalik dengan tujuan memperoleh informasi pelengkap tentang
identitas puncak kromatografi [65].

Spektrometri massa ionisasi elektrospray

Spektrometri massa ionisasi electrospray (ESI-MS) telah menjadi alat yang berharga dalam beberapa
tahun terakhir untuk analisis besar, molekul non-volatil dari kepentingan biokimia seperti peptida,
protein, atau nukleotida. Perkembangan teknik ini telah merangsang kemajuan dalam ilmu kehidupan.
Ionisasi elektrospray (ESI) dicapai dengan memompa larutan analit yang mengandung elektrolit melalui
jarum kapiler logam yang dikenai potensial positif atau negatif relatif tinggi terhadap elektroda lawan.
Medan listrik yang kuat di ujung kapiler menghasilkan aerosol dari tetesan yang halus dan bermuatan
[80]. Sumber electrospray standar memiliki laju aliran 2–200 μL menit – 1. Untuk mengurangi konsumsi
sampel, sumber mikro-ESI telah dirancang yang beroperasi pada laju aliran 20 nL hingga 2 μL mnt-1.
Sumber-sumber Nano-ESI dengan laju aliran 2–50 nL mnt-1 memberikan konsumsi sampel dan
sensitivitas minimal hingga tingkat femtomolar. Nano-ESI juga mempengaruhi mekanisme pembentukan
ion dan dengan demikian memungkinkan aplikasi ESI-MS untuk oligosakarida, glikosida, dan glikoprotein
[80]. Dibandingkan dengan ICP, ESI adalah sumber ionisasi lunak yang menjaga struktur molekul analit
bahkan untuk protein besar, sehingga memungkinkan penentuan massa molekulnya melalui
spektrometer massa. Spektrometer massa bidang quadrupole, time-offlight, atau sektor digunakan
sebagai penganalisa massa. Dalam spektrometri massa tandem electrospray (ESI-MS / MS),
spektrometer massa triple quadrupole adalah instrumen yang sangat populer, di mana quadrupole
kedua digunakan sebagai sel tumbukan. Analit difragmentasi dalam sel tumbukan oleh gas tumbukan,
dan fragmen dianalisis oleh quadrupole ketiga untuk mendapatkan informasi struktural lebih lanjut.
Spektrometer massa triple quadrupole memiliki resolusi massa hingga 3000, tetapi bahkan analisis
metallothionein dengan massa molekul 6-7 kD (dan protein besar lainnya) dimungkinkan, karena MTs
mendapatkan muatan +4 dan +5 di ESI dan ini memperluas rentang massa setelah dekonvolusi spektrum
massa. Jika quadrupole ketiga digantikan oleh spektrometer massa waktu-mati (ESI-MS Q TOF), resolusi
massa hingga 10.000 dapat dicapai. Ini memberikan akurasi massa yang diperlukan untuk penugasan
massa definitif dan penjelasan struktural.