Ismi Nurrakhmawati (1113096000019)

Andri Hermawan (1113096000020)

Amalia Rahmawati (1113096000021)

Liquid Chromatography Mass Spectrometer

(Kromatografi Cair Spektroskopi Massa)

LC-MS

LCMS : kombinasi metode analisis yang lebih

spesifik antara kromatografi dan spektroskopi
massa

LC-MS memadukan daya pemisahan HPLC

untuk bahan berat molekul besar dengan
kemampuan MS untuk mendeteksi dan
mengonfirmasikan identitas molekul secara
selektif. Aplikasi utamanya adalah di bidang
penelitian farmasi, analisis lingkungan,
pengujian makanan, dan kedokteran forensik.

 LC dengan detektor indeks

bias, elektrokimia, fluoresensi,
dan detektor UV-Vis akan
menghasilkan dua dimensi
data; yaitu, data yang mewakili
kekuatan sinyal sebagai fungsi
waktu.
Bila digabungkan dengan MS,
Selain
kekuatan
sinyal,
gabungan keduanya akan
menghasilkan data spektral
massa
yang
dapat
memberikan
informasi
berharga
tentang
berat
molekul, struktur, identitas,
kuantitas, dan kemurnian dari
sampel.

Sejarah
Goldstein (1886): Keberadaan partikel bermuatan
positif
Wein (1898): ion bermuatan positif dapat
dibelokkan dalam medan listrik dan magnet
JJ Thomson (1913): isotop Menunjukkan
Neon "Bapak spektrometri massa"
1960: GC-MS antarmuka pertama
1969: Antarmuka pertama LC-MS dikembangkan
(1UL / min aliran ke sumber EI).
1970: Perangkat transportasi diterapkan untuk LC
/ MS

Prinsip HPLC
Kerja HPLC pada prinsipnya adalah
pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom
(sebagai fasa diam) dan larutan tertentu
sebagai fasa geraknya. Yang paling
membedakan
HPLC
dengan
kromatografi lainnya adalah pada HPLC
digunakan
tekanan
tinggi
untuk
mendorong fasa gerak. Campuran
analit akan terpisah berdasarkan
kepolarannya, dan kecepatannya untuk
sampai ke detektor (waktu retensinya)
akan berbeda, hal ini akan teramati
pada spektrum yang puncak-puncaknya
terpisah

Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon <

senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton <
golongan alkohol < golongan asam

PRINSIP MS
Dalam spektrometri massa, molekul sampel dalam fase uap
dibombardir dengan elektron berenergi tinggi (70 eV) yang
menyebabkan lepasnya satu elektron dari kulit valensi molekul
tersebut.
Molekul yang kehilangan satu electron akan menjadi suatu kation
radikal
(M) + e(M+.) + 2e Kation radikal tersebut mengandung semua atom-atom dari
molekul asal, minus satu elektron, dan disebut ion molekul
/molecular ion, dan dinyatakan dengan M+. .
Sebagai hasil dari tabrakan dengan elektron berenergi tinggi, ion
molekul akan mempunyai energi yang tinggi dan dapat pecah
menjadi fragmen yang lebih kecil (kation, radikal atau molekul
netral).
M+.
m1+ + m.2 atau M+.
m1+. + m2

Prinsip LCMS
LC / MS adalah teknik analisa instrumen yang
menggabungkan kekuatan pemisahan HPLC, dengan
kekuatan deteksi spektrometri massa
Menggunakan antarmuka (interface) yang akan
menghilangkan pelarut dan menghasilkan ion fasa
gas, ditransfer ke optik dari spektrometri massa.
mendapatkan spektrum dan identifikasi massa
molekul untuk setiap puncak dielusi dari kolom
kromatografi.
Spektrum massa langsung dari sampel langsung
diinfus tidak akan membedakan antara, komponen
penyangga, kontaminan dan komponen lain dari
campuran sampel.

INSTRUMENTASI

BAGAN SISTEM HPLC-MS

detektor
kolom
injektor

pompa

oven

Wadah
solven
integrator

WADAH FASE GERAK

Merupakan tandon berisi fase gerak
Mempunyai sistem penyaring

Fasa Gerak
Fasa gerak dalam HPLC adalah
berupa zat cair dan disebut juga eluen atau
pelarut. Selain berfungsi sebagai pembawa
komponen-komponen campuran campuran
menuju detector, fasa gerak dapat
berinteraksi dengan solut-solut. Oleh
karena itu, fasa gerak dalam HPLC
merupakan salah satu faktor penentu
keberhasilan proses pemisahan.

Persyaratan fasa gerak HPLC:

o Zat cair harus bertindak
sebagai pelarut yang baik
untuk cuplikan yang akan
dianalisis.
o Zat cair harus murni sekali
untuk menghindarkan
masuknya kotoran yang
dapat mengganggu
interpretasi kromatografi.
o Zat air harus jernih sekali
untuk menghindarkan
penyumbatan pada kolom.
o Zat cair harus mudah
diperoleh, murah, tidak
mudah terbakar, dan tidak
beracun.
o Zat air tidak kental.
Umumnya kekentalan tidak
melebihi 0,5 cP (centi Poise).
o Sesuai dengan detector.

POMPA
Merupakan sistem agar fase gerak mengalir.
Kinerja pompa yang diinginkan :

Tekanan yang dihasilkan tinggi

Fluktuasi tekanan rendah

Kecepatan aliran fase gerak tepat

INJEKTOR: Alat untuk pemasukan sampel ke dalam

sistem HPLC

Pump

Pump

Column
Column

[INJECT]

[LOAD]

Sistem sample loop injektor

posisi load
pompa

Posisi inject

kolom pompa

sample loop

kolom

OVEN KOLOM instrumen pemanas

Syarat :
1. Keseragaman temperatur yang baik
2. Kestabilan temperatur yang baik
3. Ketepatan kontrol temperatur yang
baik

Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya

suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi
percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua
kelompok :
Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom
tergantung pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan
pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 -100 cm. Untuk
kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada
yang 5 cm.
Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau
lebih besar dan panjang kolom 25 -100 cm.

DETEKTOR HPLC
Yang umum dipakai
Detektor Ultraviolet / Visible (UV/VIS)
Detektor Photodiode Array (PDA)
Detektor Fluorescence (RF)
Detektor Konduktivitas (CDD)
Detektor Refraktive Indeks (RID)
Detektor Elektrokimia (ECD)
Detektor spektrometer massa
LCMS

Detektor Spektroskopi Massa

Sumber Ion
Sistem LC/MS terdahulu menggunakan antarmuka yang
tidak
baik
memisahkan
molekul
fase
gerak
dari molekul analit (langsung masuk cairan, thermospray)
Pengenalan teknik atmospheric pressure ionization (API)
sangat memperluas jumlah senyawa yang dapat berhasil
dianalisis dengan LC / MS.
Dalam
ionisasi
tekanan
atmosfer
(API)
, molekul analit diionisasi terlebih dahulu pada tekanan
atmosfer, ion analit kemudian dipisahkan dari molekul
netral.

IONISASI SPEKTROMETRI
MASSA
Berdasarkan pola ionisasinya, spektrometer
massa dibagi menjadi
1. EI-MS: Elektron Impact - Mass Spectrometer
2. CI-MS:Chemical Ionization-Mass Spektrometer
3. FAB-MS :Fast Atom Bombardment - Mass
Spectrometer
4. FD-MS : Field Desorption - Mass Spectrometer
No 1. disebut hard ionization, No. 2, 3, 4
disebut soft ionization

EI-MS: Elektron Impact - Mass

Spectrometer
Pola ionisasi sampel dengan berkas
elektron
berenergi
tinggi
(electron
bombardment).
Karena
energinya
tinggi,
maka
fragmentasi banyak dan kelimpahan M+.
relatif kecil. Intensitas puncak ion molekul
kecil, bahkan sering tidak nampak,
sehingga kadang menyulitkan interpretasi
spektra.

EI Interface

Electron impact ionization

CI-MS:Chemical IonizationMass Spektro-meter

Pola ionisasinya menggunakan gas (mis: metan,
isobutan atau ammonia) yang diionkan.
Energi ionisasi lebih kecil dibanding EI-MS,
sehingga fragmentasinya lebih kecil dan
kelimpahan relatif M+. tinggi.
Dalam spectra CI, informasi mengenai BM
molekul sample diperoleh dari protonasi molekul
sample, dan harga m/z yang diperoleh adalah
satu unit lebih besar dibanding BM yang
sesungguhnya.

 R + e ---> R+. + 2e
R+. + RH ---> RH+ + R.
RH+ + S ---> SH+ + R
(R = reagent, S = sample, e = electron, . = radical
electron , H = hydrogen)

chemical ionization

FAB-MS :Fast Atom

Bombardment - Mass
Spectrometer
Pola ionisasinya menggunakan
'fast atoms', misalnya He, Ne,
Ar. Biasanya sample dilarutkan
dulu dalam suatu matrix,
misalnya gliserol kemudian
dibombardment dengan fast
atom mis Ne

Particle beam interface

FD-MS : Field Desorption Mass Spectro-meter

Pola ionisasinya menggunakan medan magnet.
sample diletakkan pada filament dan
dipanaskan secara gradual menggunakan
medan listrik (electric field).
Sample ionise by electron tunneling. Ions are
M+ and [M+Na]+

Analisa Massa
Ada banyak analisa massa yang dapat
digunakan dalam LC / MS.
Quadrupole
Time-of-flight
Ion trap
Fourier transform-ion cyclotron resonance

Detectors
3 tipe detektor yang digunakan
untuk analisis
Electron multipliers,
Dynolyte photomultiplier,
Microchannel plates.

Keuntungan
Keuntungan utama yang dimiliki MS adalah penggunaan tandem MSMS. Detektor dapat diprogram untuk memilih ion tertentu pada
fragmen. Proses ini pada dasarnya adalah teknik seleksi, namun
sebenarnya lebih kompleks. Kuantitas yang diukur adalah jumlah
molekul fragmen dipilih oleh operator. Selama tidak ada gangguan atau
penindasan ion, pemisahan LC bisa sangat cepat. Hal ini biasa saat
sekarang untuk memiliki waktu analisis 1 menit atau kurang oleh-MS
deteksi MS, dibandingkan dengan lebih dari 10 menit dengan deteksi
UV.

Aplikasi

Farmakokinetika
LC-MS sangat umum digunakan dalam studi farmakokinetik tentang
obat-obatan dan dengan demikian merupakan teknik yang paling
sering digunakan di bidang bioanalysis . Studi ini memberikan
informasi tentang seberapa cepat obat akan dibersihkan dari aliran
darah hati, dan organ tubuh. MS digunakan untuk hal tersebut karena
sensitivitas tinggi dan spesifisitas yang luar biasa dibandingkan dengan
UV (selama analit dapat sesuai terionisasi), dan waktu analisis yang
singkat.

Proteomika
LC-MS juga digunakan dalam studi proteomik mana lagi komponen
dari campuran kompleks harus dapat dideteksi dan diidentifikasi dalam
beberapa cara. LC-MS bottom-up proteomik untuk pendekatan
proteomik umumnya melibatkan pencernaan protease dan denaturasi
(biasanya tripsin sebagai sebuah protease, urea untuk denaturasi
struktur tersier dan iodoacetamide untuk topi residu sistein) diikuti oleh
LC-MS dengan massa peptida sidik jari atau LC-MS/MS (tandem MS)
untuk menurunkan urutan peptida individu. LC-MS/MS paling umum
digunakan untuk analisis sampel massa proteomic peptida kompleks
mana mungkin tumpang tindih bahkan dengan spektrometer massa
resolusi tinggi. Contoh cairan serum biologis yang kompleks seperti
manusia dapat dijalankan dalam sistem LC-MS/MS modern dan
menghasilkan lebih dari 1000 protein yang diidentifikasi, asalkan
sampel pertama kali dipisahkan pada gel SDS-PAGE atau HPLC-SCX.

Perkembangan Obat
LC-MS
sering
digunakan
dalam
pengembangan obat pada berbagai tahapan
termasuk Pemetaan Peptida, Pemetaan
Penyandi Glikoprotein, Produk Dereplication
Alam, Pemutaran Bioaffinity, Dalam Vivo Drug
Screening, Stabilitas Pemutaran metabolic,
Identifikasi metabolit, Identifikasi Pengotor,
Identifikasi Degradant, Kuantitatif Bioanalysis ,
dan Kualitas Kontrol.

DETERMINATION OF SIMVASTATIN IN HUMAN PLASMA USING

LIQUID CHROMATOGRAPHY-MASS SPECTROMETRY
OLEH: KHALED. M. ALAKHALI

ABSTRAK
Sederhana, sensitif dan selektif kromatografi cair dengan spektrometri massa digunakan
untuk penentuan simvastatin dalam plasma manusia telah dikembangkan, setelah
simvastatin diekstraksi oleh etil asetat dan heksan (90: 10%, v / v) menggunakan lovastatin
sebagai internal standar. Zat terlarut dipisahkan pada kolom C18 dengan fase gerak yang
terdiri dari campuran asetonitril dan air (75: 25%, v / v) 500 L / min. Ion produk adisi telah
terdeteksi oleh pemantauan reaksi yang dipilih dalam mode ion positif (m / z: 436 dan m / z:
422 untuk simvastatin dan lovastatin masing-masing). Kurva kalibrasi linier 0,5-20 ng / mL.
Seluruh waktu run untuk analisis hanya 5 menit. Batas bawah kuantisasi 0.5ng / mL telah
dicapai. Presisi dan akurasi untuk pengujian yang ditentukan dalam satu hari dan variasi
antar-hari pada tiga konsentrasi 3, 6 dan 12 ng / mL. Intraday koefisien variasi yang
ditemukan menjadi kurang dari 10% dan akurasi yang antara 97,50% dan 109,50%. Antarhari koefisien variasi yang ditemukan kurang dari 10% dan akurasi yang ditemukan antara
98,30% dan 106,60%. kromatografi cair dengan metode spektrometri massa untuk
penentuan simvastatin dalam plasma manusia menawarkan beberapa aspek yang unik.
Pemisahan ini sederhana dan cepat. Volume sampel plasma yang digunakan dalam uji ini
hanya 200 L.
KATA KUNCI: kromatografi cair; spektrometri massa; simvastatin; plasma manusia

PENDAHULUAN

APA ITU SIMVASTATIN ?

Simvastatin adalah salah satu obat statin utama menghambat 3-hidroksi-3methyl-glutaryl-koenzim A (HMG-CoA) reduktase yang mengkatalisis konversi
HMG-CoA ke mevolanate, yang merupakan awal langkah membatasi laju
kolesterol biosintesis dalam tubuh. Agen ini sangat efektif dalam mengurangi
kolesterol total dan tingkat lipoprotein densitas rendah. Obat ini sangat efektif
mengurangi agen kolesterol, yang umumnya digunakan untuk pengobatan
hiperkolesterolemia

Penentuan kuantitatif simvastatin telah dilaporkan menggunakan kromatografi cair

kinerja tinggi (HPLC) dengan detektor ultra violet (UV). HPLC dengan detektor fluoresence,
kromatografi gas spektrometri
massa (GC/MS) dan kromatografi cair
spektrometri massa (LC-MS).

 Metode HPLC-UV tiak cukup peka untuk

menentukan kadar obat dalam plasma dosis
terapi
Metode HPLC-fluorescene, sampel perlu
derivat kompleks sebelum dianalisis.
Meskipun GC-MS merupakan metode yang
sensitif dan cukup selektif untuk
menganalisis simvastatin pada tingkat
tapeutik, namun metode ini memerlukan
tahap ekstraksi dan pembersihan yang rumit
Metode ini menjelaskan metode LC-MS
yang sederhana, sensitif dan cepat untuk
kuantifikasi simvastin dalam plasma
manusia pada kisaran konsentrasi 0,5 hingga
20 ng/mL

METODE PENELITIAN

ALAT DAN BAHAN

Simvastatin
dengan berat
molekul 418,57
dan lovastatin
standar internal
dengan
molekul Berat
404,54 yang
disediakan oleh
Ranbaxy
(Sungai Petani,
Malaysia)

Asetonitril
(IKelas HPLC)
diperoleh dari
Merck
Darmstadt
Jerman

Heksana (kelas
analitis)
diperoleh dari
Merck
Darmstadt
Jerman

Etil asetat dan

asam format
(kelas analitis)
yang diperoleh
dari Fisher
Perusahaan
ilmiah
internasional
UK

Air dimurnikan
dan deionisasi
menggunakan
Milli-Q sistem
filtrasi
pertukaran ion.
Air disaring
melalui WCN
0.45 um filter
Whatman Ltd,
UK

KONDISI KROMATOGRAFI
Kromatografi dan sistem deteksi massa dilakukan dengan menggunakan Finnigan
LCQ-DUO sistem, yang terdiri dari pompa quartenary, ponsel fase unit vakum
degassing, dioda UV-Vis detektor array, detektor spektrometri massa dan
autosampler. Sistem ini dikontrol menggunakan software Excalibur (Finnigan) yang
berjalan di bawah sistem operasi Windows NT.

Kolom C18 5m (3,9,

id x 50 mm, 5 m) di
suhu kamar

Fase Gerak
asam format dan
asetonitril (75: 25%,
v / v)

Sistem LC
dioperasikan pada
500mL/menit

KONDISI KROMATOGRAFI
Fase Gerak diperkenalkan ke sumber ionisasi electrospray dengan:

Aliran Gas: 30 mL/menit

Tekanan: 40 10 psi
Suhu: 250oC
Tegangan Kapiler: 4000V
Volume Injeksi: 20 uL tidak lebih dari 20% dari total sampel yang tersedia untuk injeksi
pengembangan metode, penentuan ion dilakukan untuk simvastatin dan internal lovastatin
standar dalam modus positif dengan rentang massa dipilih antara 200-500, dengan
menyuntikkan konsentrasi yang berbeda campuran kedua senyawa dengan fase gerak ke
spektrometri

PERSIAPAN LARUTAN STOK DAN KALIBRASI

STANDAR

Larutan stok
simvastatin
disiapkan dalam
asetonitril (1mg /
mL) dan
diencerkan
dengan asetonitril
dan air 80: 20%.

Larutan stok
lovastatin
disiapkan dalam
asetonitril dan air
80: 20% (1mg /
mL) dan
diencerkan
dengan asetonitril
dan air 80: 20%

Stok disimpan
pada suhu 20oC
dan dibuang satu
bulan setelah
dibuat

Dibuat standar
kalibrasi 0,5, 1, 5,
10, 15 dan 20 ng /
mL

Kalibrasi kurva
untuk simvastatin
dihasilkan dengan
mengukur peak
perbandingan luas
dari analit dengan
standar internal.

PROSEDUR EKSTRAKSI
Sampel plasma manusia
(0.2mL) dipindahkan ke
dalam tabung tes kaca
dan diikuti oleh
penambahan 50 uL
internal standar (10 ng /
mL)

3 mL campuran pelarut
etil asetat dan heksana
(90: 10%, v / v)
ditambahkan ke tabung
dan vortex selama 30
detik

sentrifugasi pada 4000

rpm selama 10 min

Residu kering dilarutkan

dengan 100 uL asetonitril
dan air (80: 20%, v / v),
vortex selama 15 detik dan
20 uL campuran disuntikkan
ke dalam kromatografi

fase organik pada

bagiatan atas ditransfer
ke tabung lain dan
diuapkan sampai kering
dibawah nitrogen pada
40oC

VALIDASI PENGUJIAN
Koefisien variasi (CV) dan ketepatan kuantifikasi pada satu hari
yang sama dinilai menggunakan enam ulangan pada 3, 6 dan
12 ng / mL. Sementara assay antar-hari dievaluasi dengan
menggunakan lima ulangan pada konsentrasi yang sama,
berulang-ulang selama lima hari yang berbeda.

EFISIENSI EKSTRAKSI
Efisiensi ekstraksi simvastatin berada pada konsentrasi
rendah, sedang dan tinggi 3, 6 dan 12 ng / mL, dengan
membandingkan daerah puncak dari ekstrak terlarut
dibandingkan standar air.

HASIL DAN PEMBAHASAN

KONDISI SPEKTROMETRI MASSA DI LCMS

PEMISAHAN
Kromatogram dari simvastatin di plasma manusia ditunjukkan
pada Gambar. 2 dan 3 dengan waktu retensi kurang dari 5 menit
berada dicapai untuk kedua simvastatin pada 0,5 dan 12 ng / mL
dengan lovastatin standar internal pada 10 ng / mL. Simvastatin
dielusi pada 4,1-4,2 min dan standar lovastatin internal pada
3,2-3,3 min.

KURVA KALIBRASI, KOEFISIEN VARIASI DAN AKURASI

Hasil untuk kurva kalibrasi (n = 5) menunjukkan linearitas yang baik (r = 0,995)
konsentrasi 0,5-20 ng / mL, dengan persamaan y = 0,0873 x + 0,0425 (y =
konsentrasi simvastatin dalam ng / mL; x = daerah simvastatin/ daerah lovastatin).
Hasil intraday dan interday yang ditunjukkan pada Tabel 1 dan Tabel 2

TABLE 1
INTRA-DAY COEFFICIENT OF VARIATION AND ACCURACY OF
MEASUREMENT OF SIMVASTATIN IN HUMAN PLASMA OF
INDIVIDUAL SAMPLES (N=6)
Spike concentration
(ng/mL)

Found concentration
(ng/mL)

Coefficient of

3
6
12

3.30 0.33
5.90 0.53
12.00 0.80

9.97 9.00
6.67

The value are mean S.D.

variation (CV) (%)

Accuracy
(%)
109.50
97.50
99.90

TABLE 2
INTER-DAY COEFFICIENT OF VARIATION AND ACCURACY OF
MEASUREMENT OF SIMVASTATIN IN HUMAN PLASMA OF INDIVIDUAL
SAMPLES (N=5)

Spike concentration
(ng/mL)

Found concentration
(ng/mL)

Coefficient of

3
6
12

3.20 0.30
5.90 0.39
11.90 0.26

9.40 6.50
2.20

The value are mean S.D.

variation (CV) (%)

Accuracy
(%)
106.70
98.30
99.20

PEMULIHAN
Perolehan kembali analit dari plasma ditentukan dengan mengekstraksi
sampel kontrol plasma yang diketahui mengandung sejumlah masingmasing analit, menambahkan standar internal selama ekstraksi, dan
membandingkan rasio luas puncak dengan rasio dari analit standar
internal non-diekstraksi yang ditambahkan. Pemulihan simvastatin dari
plasma manusia kurang lebih adalah 87,50 untuk 97.00% dan digambarkan
dalam Tabel 3.
TABLE 3
EXTRACTION EFFICIENCY OF SIMVASTATIN (N=3)
Sample concentration (ng/mL)

Extracted Concentration
Mean ( CV%)

Non-extracted Concentration
Mean (CV%)

Recovery %

3
6
12

3.20 (3.1)
5.90 (3.7)
11.90(10)

3.30 (6.2) 6.40

(8.4)
13.60 (2.2)

97.00 92.20
87.50

RE-INJEKSI PROSES VALIDASI

Masing-masing kualitas konsentrasi kontrol untuk proses reinjeksi dihitung untuk menyetujui ketepatan proses re-injeksi.
Presisi yang diperoleh dari nilai rata-rata dari masing-masing reinjeksi set tidak melebihi 15% (toleransi sampai 20% pada
konsentrasi LOQ). Data re-injeksi proses validasi disajikan pada
Tabel 4
TABLE 4
RE-INJECTION PROCESS DATA USING LC-MS METHOD
Concentration.
Low (3 ng/mL)
Medium (6 ng/mL)
High (12 ng/mL)

Mean
Original value
3.19
6.00
11.97

CV(%)
10.80
7.70
2.50

Mean
Re-injection value
3.21
5.99
11.82

CV (%)

Variation (%)

5.00
6.04
4.36

5.80
1.66
1.86

KESIMPULAN

Metode LCMS untuk penentuan simvastatin

dalam
plasma
manusia
menawarkan
beberapa aspe. Pemisahan sederhana dan
cepat. Volume sampel plasma yang digunakan
dalam uji ini hanya 200 uL, yang secara
signifikan kurang dari metode sebelumnya
diterbitkan. Metode LC-MS dikembangkan di
sini telah terbukti sensitif, akurat, selektif dan
reproduksi.