LC MS/MS

Pendahuluan
Kromatografi cair merupakan dasar teknik pemisahan di
bidang sains dan terkait dengan kimia. Kromatografi cair
dapat dengan aman memisahkan senyawa organik dengan
rentang yang sangat luas yaitu mulai dari metabolit obat
dengan molekul kecil sampai peptida dan protein.

Detektor umum dari kromatografi cair termasuk indeks

refraksi, elektrokimia, fluoresensi, dan ultraviolet-visible (UV-
Vis). Beberapa dari detector tersebut memberikan data dua
dimensi yaitu data yang menunjukkan kekuatan signal sebagai
fungsi atas waktu
 Pendahuluan
Detektorfluorosensi dan diode-array UV-Vis menghasilkan
data tiga dimensi yaitu tidak hanya kekuatan signal namun
data spectra dari masingmasing poin waktu.
Mass spectrometers juga menghasilkan data tiga dimensi.
Selain kekuatan signal juga menghasilkan data massa spektral
yang dapat memberikan informasi berharga tentang struktur,
berat molekul, identifikasi, jumlah, dan kemurnian sampel.
 Pendahuluan
Data spektral massa menambahkan spesifitas yang
meningkatkan kepercayaan dalam hasil dari analisis
baik kualitatif dan kuantitatif.
Untuk sebagian besar senyawa yang di analisis dengan
spektrometer massa jauh lebih sensitif dan lebih
spesifik daripada semua LC detektor lainnya. Hal ini
dapat menganalisis senyawa yang tidak memiliki
kromofor yang cocok. Hal ini juga dapat
mengidentifikasi komponen dalam kromatografi
dengan peak yang belum terselesaikan, mengurangi
kebutuhan untuk kromatografi yang sempurna.
 LC MS/MS
Liquid Chromatography Mass Spectroscopy adalah 2 alat yang
digabungkan menjadi 1 , dimana berfungsi untuk memisahkan
beberapa senyawa atau campuran senyawa berdasarkan
polaritasnya ( prinsip kerja kromatografi), dimana setelah campuran
senyawa tersebut terpisah, maka senyawa yang murni tersebut
akan diidentifikasi berat molekulnya.

Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry (LC MS/MS)

merupakan satu satunya teknik kromatografi cair dengan detektor
spektrometer massa. Penggunaan LC MS/MS untuk penelitian
bioanalisis dimulai pada akhir 1980-an
 Kelebihan Teknologi LC MS/MS
Spesifitas. Hasil analisis yang khas dan spesifik diperoleh dari
penggunaan spektrometer massa sebagai detektor.
Aplikasi yang luas, dengan sistem yang praktis. Berbeda
dengan GC-MS sebagai spektrometer massa klasik, penerapan
LC MS/MS tidak terbatas untuk molekul volatil. Mampu
mengukur analit yang sangat polar, selain itu persiapan
sampel cukup sederhana tanpa adanya teknik derivatisasi.
Fleksibilitas. Pengujian yang berbeda dapat dikembangkan
dengan tingkat fleksibilitas yang tinggi dan waktu yang
singkat.
Kaya Informasi. Sejumlah data kuantitatif maupun kualitatif
dapat diperoleh. Hal ini disebabkan seleksi ion yang sangat
cepat dengan banyak parameter.
Instrument LC MS/MS
 Sejarah
Pada tahu 1886, Eugen Glodskin mengamati sinar dalam gas
tidak bermuatan pada tekanan rendah yang berpindah dari
anoda dan melalui chanels dalam lubang katoda, berlawanan
dengan arah muatan megatif sinar katoda. Goldstream
menyebutnya dengan muatan positif sinar anoda.
Wilhem wien menemukan bahwa medan listrik dan medan
magnet yang kuat dapat membelokkan sinar canal. Pada
tahun 1899, dibuatlah peralatan medan magnet dan medan
listrik parallel yang dapat memisahkan sinar positif
berdasarkan perbandingan muatan massa.
 Sejarah
Beberapa teknik modern dari mass-spectroscopy di teliti oleh
Arthur Jeffrey Dempster dan F.W Aston pada tahun 1918 dan
1919.
Pada awal 1940, Mass Spectroscopy pertama dirancang untuk
penentuan komponen dalam campuran hidrokarbon
kompleks dalam industri minyak, kemudian berkembang
untuk penggunaan berbagai senyawa organic yang dihasilkan
oleh industri kimia
Pertengahan 1950. dirancang untuk penentuan unsur secara
kualitatif dan kuantitatif bedasar mass to charge ratio (m/z)
ion ion yang dihasilkan. Hal ini dimanfaatkan baik oleh industri
elektronika maupun nuklir. Keduanya berdasar pada material
yang sensitive untuk race kontaminan
 Sejarah
Awal 1960, Mass Spectroscopy digunakan untuk identifikasi
dan analisis struktur molekul yang kompleks. Basisnya adalah
pola fragmen ion masing masing dengan massa berbeda, yang
terbentuk saat molekul besar terionisasi.
Tahun 1989 nobel dalam bidang kimia diperoleh John Bennet
Fenn untuk pengembangan electrospray ionization (ESI)
Perkembangan terakhir, spektrometri massa digunakan secara
luas sebagai detektor untuk kromatografi gas maupun cair
 Mass Spectroscopy
Spektroskopi massa adalah cara analisis senyawa kimia
dengan memecahkan molekulnya menjadi ion ion besar
maupun kecil, dan dari pola pola ionisasi ini nantinya akan di
didapat informasi mengenai molekul utuhnya.

Molekul yang masuk ke dalam spektrometer massa harus

senyawa murni, bukan campuran, karena itu beberapa
langkah pemisahan kimia sudah harus selesai dilakukan

Spektroskopi massa sering digabung dengan kromatografi,

karena sampai saat ini pemisahan senyawa kimia dengan
kromatografi sudah cukup sempurna sehingga analisis
senyawa senyawa yang terpisah ini dapat dilakukan langsung.
 Mass Spectroscopy
Spektroskopi massa memberikan informasi berdasarkan
perbandingan massa/muatan (m/z). Sampel senyawa kimia
yang dianalisis dalam jumlah relatif sangat kecil, yakni g.
Senyawa kimia akan diubah fasa nya menjadi gas dan di pecah
pecah menjadi ion ion dengan massa relative yang lebih
rendah.
Pemecahan senyawa2 kimia ini dilakukan dengan menembak
senyawa senyawa kimia tersebut dengan electron berenergi
tinggi (sedikitnya 70eV setara dengan 1610kkal/mol atau
6720kJ/mol), ion ion ini akan bergerak dalam medan listrik
dan medan magnet dengan kecepatan sesuai dengan
massanya sebelum mencapai detektor, dari pola pola pecahan
ion, struktur senyawa sampel dapat diprediksi
Instrument MS terbagi menjadi 3 bagian

Ion Souce mengubah molekul sampel dari fase gas menjadi ion ion
Mass Analyzer memilih ion ion berdasar massanya menggunakan
medan elektromagnetik
Detektor Processing Ion signal mjd Mass Spectrum
LC MS/MS
Spektrometer massa bekerja dengan molekul pengion yang
kemudian akan memilah dan mengidentifikasi ion menurut
massa, sesuai rasio fragmentasi mereka.
2 komponen kunci dalam proses ini adalah sumber ion (ion
source) yang akan menghasilkan ion dan analisis massa (mass
analyzer) yang menseleksi ion
Sistem LC MS/MS umumnya menggunakan beberapa jenis
ion source dan mass analyzer yang dapat disesuaikan dengan
kepolaran senyawa yang akan di analisa.
Masing2 ion source dan mass analyzer memiliki kelebihan dan
kekurangan sehingga harus disesuaikan dengan enis informasi
yang dibutuhkan.
 Prosedur Umum Mass- Spectroscopy

Sampel dimasukkan ke dalam instrument MS dan mengalami penguapan

Komponen dari sampel diionisasi (dengan berbagai metode), sehingga
menghasilkan partikel bermuatan (ion)
Ion dipisahkan berdasarkan rasio massa/muatan (m/z) dalam analyzer
oleh medan elektromagnetik
Ion ion di deteksi
Sinyal ion diproses menjadi spektra massa
Sumber Ion (Ion Source)
Selama beberapa tahun terakhir, banyak kemajuan pada LC
MS/MS dalam pengembangan sumber ion dan teknik untuk
mengionisasi dan memisahkan ion molekul analit dari fase
geraknya
Sebelumnya LC MS/MS menggunakan sistem antarmuka
yang kurang baik dalam memisahkan molekul fase gerak dari
molekul analit. Molekul2 analit yang terionisasi dalam
spektrometer massa berada dalam kondisi vakum, peristiwa
semacam ini sering terjadi pada ionisasi elektron tradisional.
Teknik ini hanya berhasil untuk jumlah senyawa yang sangat
terbatas.
Sumber Ion (Ion Source)
Pengenalan teknik ionisasi tekanan atmosfer (atmospheric pressure
ionization/API) sangat memperluas jumlah senyawa yang dapat
dianalisis dengan LC MS/MS. Pada teknik ionisasi tekanan
atmosfer, molekul analit terionisasi terlebih dahulu pada tekanan
atmosfer. Ion ion analit tersebut kemudian secara mekanis dan
elektrostatis terpisah dari inti molekul.
Teknik ionisasi tekanan atmosfer antara lain :
1. ionisasi elektrospray (electrospray ionization/ESI)
2. ionisasi kimia tekanan atmosfer (APCI)
3. photoionisasi tekanan atmosfer (APPI)
Dalam setiap pengukuran, sifat analit dan kondisi pemisahan
memiliki pengaruh kuat untuk memberikan hasil terbaik dalam
teknik ionisasi pada elektrospray, APCI maupun APPI. Teknik yang
paling efektif tidak selalu mudah untuk diprediksi
Aplikasi dari berbagai teknik ionisasi LC MS/MS
 1. Ionisasi Elektrospray / ESI
Ionisasi elektrospray bergantung pada pelarut yang digunakan untuk
memungkinkan analit mampu mengion dengan baik sebelum mencapai
spektrometer massa. Eluen LC disemprotkan bersamaan dengan gas
nebulizer ke dalam bidang elektrostatik pada tekanan atmosfer yang akan
menyebabkan disosiasi lebih lanjut molekul analit.
 Ionisasi Elektrospray / ESI
Pada saat yang bersamaan gas yang dipanaskan menyebabkan
menguapnya pelarut sehingga tetesan analit menyusut, konsentrasi
muatan dalam tetesan meningkat. Keadaan akan memaksa ion untuk
bermuatan melebihi kekuatan kohesif atau ion dikeluarkan ke dalam fase
gas. Ion ion yang tertarik akan melewati pipa kapiler pengambilan sampel
yang selanjutnya akan diteruskan ke dalam analisis massa.

Elektrospray sangat berguna untuk menganalisis molekul besar seperti

protein, peptida, dan oligonukleotida, namun dapat juga menganalisis
molekul kecil seperti benzodiazepin.
2. Ionisasi Kimia Tekanan Atmosfer / APCI
Dalam APCI, eluen LC
disemprotkan melalui sebuah
pemanas (umumnya bersuhu
250C 400C ). Proses
berlangsung pada tekanan
atmosfer. Udara panas akan
menguapkan cairan. Fase gas
pelarut yang dihasilkan akan
terionisasi oleh elektron dari
jarum korona. Ion ion pelarut
kemudian mntransfer
muatan pada molekul analit
melalui reaksi kimia (ionisasi
kimia). Ion ion analit mlewati
pipa kapiler pengambilan
sampel yang dilanjutkan ke
dalam analisis massa.
Ionisasi Kimia Tekanan Atmosfer / APCI

APCI berlaku untuk berbagai kutub dan molekul nonpolar.

Karena melibatkan suhu tinggi, APCI kurang cocok
dibandingkan dengan elektrospray untuk analisis biomolekul
besar yang mungkin secara termal tidak stabil.

APCI lebih sering digunakan pada kromatografi fase normal

dibandingkan dengan sumber ion elektrospray karena analit
yang biasanya nonpolar.
 3. Photoionisasi Tekanan Atmosfer / APPI
APPI untuk LC MS/MS
merupakan teknik yang relatif
baru. Penguap mengubah eluen
LC menjadi fase gas. Sebuah
lampu bermuatan menghasilkan
foton dalam kisaran energi ionisasi
yang kecil. Kisaran energi yang
dipilih ialah energi yang mampu
mengionisasi molekul analit
sebanyak dan mampu mungkin
meminimalkan ionisasi molekul
pelarut. Ion ion yang dihasilkan
akan melewati pipa kapiler
pengambilan sampel ke dalam
analisis massa.
Photoionisasi Tekanan Atmosfer / APPI

Hampir semua senyawa yang biasa di analisis oleh

APCI dapat dianalisis pula dengan APPI. Hal ini
menunjukkan kemiripan di dalam dua aplikasi, yakni
menganalisis senyawa yang sangat nonpolar dengan
laju alir yang rendah ( < 100ml/menit) dimana
senditifitas APCI terkadang berkurang
 Analisis Massa (Mass Analyzer)
Meskipun dalam teori semua jenis analisis massa dapat
digunakan untuk LC MS/MS, namun kenyataannya, ada 4
jenis analisis massa yang paling sering digunakan :
1. Quadrupole
2. Time of Flight
3. Perangkap Ion
4. Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance (FT ICR)
Masing masing memiliki kelebihan dan kekurangan tergantung
pada persyaratan dari analisis yang akan digunakan
 1. Quadruplo
Sebuah analisis massa quadruplo terdir dari empat batang paralel
diatur dalam persegi. Ion analit diarahkan ke bagian tengah persegi.
Tegangan yang dialirkan pada batang menghasilkan bidang
elektromagnetik. Bidang ini menentukan rasio massa ? Yang dapat
melewati filter pada waktu tertentu. Quadruplo cenderung merupakan
analisis massa yang paling sederhana dan paling murah.
 Quadruplo
Analisis Massa Quadruplo dapat ber operasi dengan 2 mode :
1. Memindai (scan) modus
2. Pemantauan ion terpilih ( selected ion monitoring/SIM) modus

Dalam mode scan, analisis massa

memantau berbagai rasio ? / ? .
Dalam modus SIM, analisa massa
hanya memantau beberapa rasio ?
/ ? . Modus SIM jauh lebih sensitif
dibandingkan modus memindai
tetapi memberikan informasi
tentang fragmentasi ion yang lebih
sedikit. Modus pindai biasanya
digunakan untuk kuantisasi dan
pemantauan senyawa target.
 2. Time of Flight
Pada analisis massa time of flight
(TOF), Sebuah gaya
elektromagnetik yang seragam
diterapkan untuk semua ion pada
waktu yang sama. Hal ini
menyebabkan ion akan dipercepat
menyusuri tabung penerbangan.
Ion yang lebih ringan berjalan lebih
cepat dan tiba pada detektor paling
awal, sehingga rasio fragmentasi ?
/? Ditentukan oleh waktu
kedatangan mereka. Analisis massa
( TOF) memiliki kisaran massa yang
luas dan sangat akurat pada
pengukuran massa suatu senyawa.
 3. Perangkap Ion
Analisis massa perangkap ion
massa terdiri dari elektroda
melingkar cincin dua penutup
di kdua ujungnya yang
bersama sama membentuk
sebuah ruang. Ion memasuki
ruang dan terjebak oleh
medan elektromagnetik.
Bidang lain digunakan untuk
mengeluarkan dengan selektif
dari dalam perangkap.
Perangkap ion memiliki
kelebihan dapat melakukan
beberapa tahapan pengukuran
spektrometer massa tanpa
analisis massa tambahan
4. Fourier transform-ion cyclotron resonance (FT-ICR)

Analisis massa FT-ICR merupakan jenis lain dari

analisis massa perangkap ion. Ion memasuki
ruangan dan terjebak dalam lingkaran orbit oleh
medan listrik dan medan magnet yang kuat. Ketika
terjadi eksitasi oleh frekuensi radio (RF) pada
medan listrik, ion menghasilkan arus yang
bergantung pada waktu. Arus ini dikonversi oleh
fourier menjadi frekuensi orbital dari ion yang
sesuai dengan rasio muatan massa senyawa.
Seperti perangkap ion, analisis massa FT-ICR dapat
melakukan beberapa tahapan spektrometri massa
tanpa analisis massa tambahan. FT-ICR juga
memiliki rentang massa yang lebar dan resolusi
massa yang sangat baik. FT-ICR merupakan analisis
massa termahal diantara yang lain
 Collision Induced Disosiasi/ CID

Teknik ionisasi tekanan atmosfer yang di bahas umumnya

menghasilkan :
1. Molecular ions M+ or M
2. Protonated molecules [M + H]+
3. Simple adduct ions [M + Na]+
4. Ions representing simple losses such as the loss of a water
[M + H H2O]+
Berat molekul yang di hasilkan memberikan informasi sangat
berharga, tapi pelengkap informasi struktural sering dibutuhkan.
Contd
Dalam memperoleh informasi struktural, ion analit
terfragmentasi karena molekul bertabrakan dengan netral
yang dikenal sebagai disosiasi tabrakan induksi ( collision
induced disosiasi/ CID) atau disosiasi tabrakan diaktifkan
(collisionally activated dissociation/ CAD).

Tegangan diberikan kepada ion ion analit untuk menambah

energi agar mampu melakukan tabrakan sehingga
menciptakan fragmentasi lagi.
 CID Pada Satu Tahap MS
CID yang paling sering dihubungkan dengan dua tahap spektrometer
massa dimana terjadi pada setiap tahap penyaringan MS, tapi CID juga
dapat dicapai dalam satu tahap spektrometer massa quadrupole atau TOF
Pada satu tahap spektrometer massa, CID terjadi dalam sumber ion dan
dengan demikian kadang kadang disebut sumber CD ATAU in-source CID.
Analit (prekursor) ion yang dipercepat dan bertabrakan dengan molekul
netral sisa untuk menghasilkan fragmen disebut ion produk
 Contd
Keuntungan melakukan CID di satu tahap instrumen adalah
kesederhanaan mereka dan biaya yang relatif rendah
Kelemahannya adalah semua ion akan terfragmentasi. Dalam
proses ini tidak ada kesempatan untuk memilih ion prekursor
secara spesifik sehingga tidak ada cara yang pasti untuk
menentukan ion produk yang berasal dari ion prekursor
Spektrum yang dihasilkan mungkin termasuk puncak massa
dari ion atau senyawa pengotor dan senyawa analit yang
diinginkan.
Proses ini mungkin dapat diterima ketika menganalisis sampel
yang relatif murni, tapi tidak memberikan hasil yang baik jika
puncak kromatografi tidak memiliki intensitas yang baik
 CID Pada Dua Tahap MS
Beberapa tahap MS atau disebut juga tandem MS, atau MS/MS adalah
cara yang ampuh untuk mendapatkan informasi struktural
Dalam triple quadrupole, quadrupole pertama digunakan untuk memilih
prekursor ion
CID mengambil tempat di tahap kedua dimana terjadi proses tabrakan
Pada tahap ketiga akan menghasilkan spektrum produk ion, pada proses
ini terjadi seleksi ion dimana hanya ion produk yang memenuhi kuantitas
dan kualitas senyawa target yang akan ditampilkan dalam spektrum
Contd

Pada awal kemunculan sistem LC-MS/MS banyak keterbatasan

pada masalah dasar seperti jumlah eluen LC sehingga
spektrometer massa dapat menerima dengan baik. Perubahan
metode LC sangat diperlukan untuk menyesuaikan dengan
detektor MS
 Detektor
Unsur terakhir pada spektrometer massa adalah detektor
Detektor menghitung muatan yang terinduksi atau arus yang dihasilkan
ketika ion dilewatkan atau mengenai suatu permukaan.
Dalam instrumen scanning, sinyal dihasilkan dalam detektor selama
scanning, dimana scanning massa dan ion dihitung sebagai m/z.
Menurut tipenya, beberapa tipe elektron multiplier digunakan, seperti
faraday cups dan detektor ion ke photon
Karena jumlah ion yang meninggalkan mass analyzer cukup kecil, maka
sering digunakan Microchannels plate detector, detektor ini terdiri dari
sepasang logam pada permukaan dengan mass analyzer atau daerah
pemerangkap ion.
Hasil akhir dari spektrum massa berupa rangkaian puncak. Puncak pada
ratio m/z yang sesuai untuk masing masing ion
 LC MS/MS
Sistem modern LC-MS/MS lebih fleksibel. Spektrometer massa
dapat menerima kecepatan alir eluen hingga 2ml/menit.
Dengan sedikit modifikasi, instrumen yang sama juga dapat
memberikan hasil yang baik pada aliran mikroliter dan
nanoliter
Sumber ion dengan ortogonal (off-axis) nebulizer lebih toleran
dari nonvolatile buffer dan hanya memerlukan sedikit
penyesuaian pada perbedaan komposisi pelarut dan
kecepatan alir
 LC MS/MS
Perubahan metode LC Modern yang diperlukan untuk sistem
LC-MS/MS umumnya berupa persiapan sampel dan pelarut
kimia yang berguna untuk :
1. memastikan konsentrasi analit yang memadai
2. memaksimalkan proses ionisasi melalui pemilihan pelarut
dan buffer
3. meminimalkan keberadaan senyawa yang mengganggu
proses ionisasi