erRisa Devi Fauzi 1

IMMUNOASSAY
LABELING TECHNIQUES IN IMMUNOASSAY
IMMUNOASSAY
Immunoassay adalah metode pemeriksaan untuk
mendeteksi adanya ikatan antigen dengan antibodi.

Pemeriksaan in vitro yg sangat spesifik menggunakan

prinsip reaksi antigen-antibodi untuk mendeteksi
konsentrasi zat biologis yg sangat rendah dalam darah
dan cairan tubuh lainnya.
 Introduction
3

 Immunoassay  suatu metode pemeriksaan unk mendeteksi adanya

ikatan kompleks antibody dan antigen, dan kmdn di ukur kadar nya
(measurable result)  untuk mendeteksi dan mengukur kadar analyte.
 Kompleks antibody- antigen juga dikenal dg immuno-complex.

“Immuno” refers to an immune response that causes the body to generate

and “assay” refers to a test.
Thus, an immunoassay is a test that utilizes immuno-complexing when
antibodies and antigens are brought together
erRisa Devi Fauzi
Principles immunosaay
(antigen and antibody
detection procedures).

erRisa Devi Fauzi 4

Definitions
Antibodi = imunoglobulin yg diproduksi oleh •
tubuh sebagai respons terhadap zat “asing"
(patogen) sebagai bagian dari respons imun
tubuh

Antigen adalah substansi yg sedang berusaha •

"dilawan" (menghilangkan atau mengurangi)
oleh tubuh dgn membentuk respon imun.
 Analyte
• Analyte adalah sesuatu yg diukur pd pemeriksaan laboratorium.
Pada immunoassay, analit dapat berupa antibodi atau antigen.

• Analit yg diukur mungkin secara alami terdapat di dalam tubuh (seperti

hormon tiroid), yg dihasilkan tubuh tetapi tidak biasanya hadir (seperti
antigen kanker), atau yang tidak secara alami terjadi dalam tubuh
(seperti obat menyalahgunaan obat).

erRisa Devi Fauzi 6

Labeled Antibodies (Ab*)

erRisa Devi Fauzi 7

Labeled Antigen (Ag*)

erRisa Devi Fauzi 8

 Brief defination of terms

Enzyme Suatu zat yang dapat bereaksi pada konsentrasi rendah sebagai katalis untuk
meningkatkan reaksi tertentu.
Enzyme conjugate enzim yang dilekatkan scr ireversibel dengan protein, biasanya antibodi.
Substrate Sebuah senyawa kimia mgd enzim yang bereaksi spesifik.
Reaksi ini digunakan, dg berbagai cara untuk menghasilkan sinyal yang dibaca sebagai
reaksi warna (langsung sebagai perubahan warna substrat atau tidak langsung dengan
efeknya terhadap bahan kimia lain).
Chromogen Sebuah bahan kimia yang mengubah warna sebagai hasil dari interaksi enzim dengan
substrat
Antigen substansi yg sedang berusaha "dilawan" (menghilangkan atau mengurangi) oleh tubuh
dengan membentuk respon imun.
Analyte adalah sesuatu yg diukur dgn pemeriksaan laboratorium.
Pada immunoassay, analit dapat berupa antibodi atau antigen.

erRisa Devi Fauzi 9

Teknik Pemeriksaan Immunoassay
1. Imunopresipitasi
Non Labelling 2. Aglutinasi, flokulasi
3. Fiksasi komplemen

4. Radioimmunoassay (RIA)
5. Enzyme immunoassay (EIA) atau
Labelling
Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)
6. Immunofluorescent (IF)
7. Immunochromatographic technique (ICT)
10
POLYCLONAL ANTIBODIES
• Campuran antibodi yang dapat mengikat berbagai macam epitop dari imunogen
dengan aviditas (kekuatan ikatan) yang berbeda beda

ANTIBODI MONOKLONAL
• Antibodi monoklonal memiliki afinitas monovalen, karena hanya mengikat epitop yg
sama (bagian antigen yg dikenali oleh antibodi).
• Antibodi monoklonal: sediaan antibodi homogen yg terdiri dari satu jenis antigen
binding site
Polyclonal Monoclonal
antiserum antibodies

ERRISA DEVI FAUZI 14

SAMPEL PEMERIKSAAN IMMUNOASSAY
 Classification of Immunoassay

1.
1 Non amplified immunoassay :
a. Precipitation tests
b. Agglutination tests
2 Visualized immunoassay :
2.
a. Agar gel IA
b. Latex IA
c. Erythrocyte IA
3.3 LIGAND BINDING / LABEL IMMUNOASSAY :
a. Isotopic IA : RIA
b. Non Isotopic IA: EIA, FIA, LIA, CLIA
20 erRisa Devi Fauzi
21 erRisa Devi Fauzi
 SENSITIVITAS ANALITIK BERBAGAI METODE
100 10-3 10-6 10-9 10-12 10-15
Gr mg ug ng pg fg

Grafimetri

Colorimetri

Infrared

SpektroFM

Polarograpi
I
Kromatogp DC

HPLC

GC

Fluorometri

Maβfragmentogp

Neutronaktivasi

RIA
IV
Biochemiluminescent II
III
 Label Imunoassay
 Imunoassay yg menggunakan LABEL indikator utk deteksi adanya Ag atau
Ab dgn konsentrasi rendah

 Label (tracer) pada immunoassay akan mengkonversi substrat spesifik

mjd produk warna atau sinyal  sbg tanda adanya ikatan Ag - Ab.
- label zat Radioaktif  radio immunoassay (RIA)
- label zat Fluoresence  Fluoresence immunoassay (FIA)
- label zat chemiluscence  Chemilusence immunoassay (CLIA)
- label enzyme  enzyme linked immunoassay (ELISA)
Labeling Techniques in Immunoassay

erRisa Devi Fauzi 28

 Solid-phase immunoassay for antibody.
30

erRisa Devi Fauzi

BINDING ASSAY FOR ANTIGEN

Labeled
Anti-Ig
Ag in Patient’s
sample
Ag
Immobilized

Solid
Phase
IN-DIRECT BINDING ASSAY FOR ANTIBODI Labeled
Anti-Ig
Ab in Patient’s
sample

Immobilized Ag

Solid
Phase

Amount of labeled Ab bound is proportional to amount of Ab in the

sample
 Categories of Immunoassay Methodologies

The immunoassay methodologies are:

• NON-COMPETITIVE and COMPETITIVE immunoassays,

• HOMOGENEOUS and HETEROGENEOUS immunoassays

• DIREK and INDIREK immunoassay

erRisa Devi Fauzi 41

erRisa Devi Fauzi 42
Prinsip kerja Labeling immunoassay
 Direct and Indirect Methods

 DIRECT immuno assay,

antigen sample langsung berikatan dg
Antibodi PRIMER BERLABEL.
Antibodi sample langsung berikatan dg
antigen PRIMER BERLABEL.

 INDIRECT immuno assay,

Ab primer TIDAK berlabel yg telah
berikatan dg antigen sample dideteksi
oleh Ab SEKUNDER berLABEL
 Direct and Indirect Methods

 DIRECT immuno assay,

Antigen sample langsung berikatan dg
Antibodi PRIMER BERLABEL.
Antibodi sample langsung berikatan dg
antigen PRIMER BERLABEL.

 INDIRECT immuno assay,

Ab primer TIDAK berlabel yg telah
berikatan dg antigen sample dideteksi oleh
Ab SEKUNDER berLABEL
 SANDWICH ELISA:

• This format is referred to as a “sandwich” assay because analyte is

bound (sandwiched) between two highly specific antibody reagents

46 erRisa Devi Fauzi

47 erRisa Devi Fauzi
 Homogeneous and Heterogeneous Immunoassay Methods

• HOMOGENEOUS immunoassays
– TIDAK memerlukan pemisahan
ikatan kompleks Ab-Ag* (ikatan Ab-
Ag* dari Ag* bebas)

• HETEROGENEOUS immunoassays
– memerlukan TAHAP PEMISAHAN ikatan
kompleks Ab-Ag*
– require the separation of unbound
complexes, often utilizing a solid phase
reagent such as a magnetic particle or plastic
bead.

erRisa Devi Fauzi 48

 HOMOGEN Immunoassay HETEROGEN Immunoassay
49

 Homogeneous immunoassays require only  metode Immunoassay yg memerlukan

mixing of a sample and immunochemical pemisahan ikatan kompleks Ab-Ag*
reagents followed by detection.
 metode Immunoassay yg TIDAK  Label mempunyai sifat reaksi yang
memerlukan pemisahan ikatan kompleks SAMA, antara reagen dlm keadaan
Ab-Ag* (ikatan Ab-Ag* dari Ag* bebas) terikat atau bebas, sehingga perlu
pemisahan (pencucian)
 Label pd reagen menunjukkan perbedaan
sifat reaksi antara bila reagen tsb terikat
dibanding dlm keadaan bebas, shg tidak
diperlukan pemisahan
 Jadi label bebas atau terikat dapat diukur
erRisa Devi Fauzi

 Competitive and Noncompetitive Immunoassays
52
METODE KOMPETITIF NON-COMPETITIVE METHOD
 analit TIDAK BERLABEL (antigen / antibodi)  The measurement of labeled analyte,
dlm sampel diukur dari kemampuannya usually antibody, is directly proportional
berkompetisi dgn antigen/antibodi to the amount of antigen present in the
BERLABEL dalam immunoassay. sample.
 analit tidak berlabel menghalangi
 Hasil pengukuran analit berlabel
kemampuan antigen berlabel unk berikatan,
berbanding LURUS dg jumlah analit tak
karena tempat unk berikatan pd antibodi
tersebut sudah ditempati. berlabel dlm sampel.
• HASIL: semakin sedikit analit BERLABEL yg
terukur menunjukkan pd sampel banyak
terdapat analit TAK BERLABEL.
 antigen dlm sampel berbanding
TERBALIK dg jumlah label yg diukur
erRisa Devi Fauzi
 negative control

NON-COMPETITIVE METHOD
54

1. solid-fase Ab TIDAK berlabel diinkubasi dgn Ag sampel pasien

 tjd ikatan kompleks antibodi/antigen
2. Langkah pencucian pertama antibodi yg tdk berikatan hilang
3. Ditambahkan Ab sekunder berlabel yg spesifik unk Ab primer
4. Langkah pencucian yg kedua  utk menghilangkan antibodi
sekunder berlabel yg tidak berikatan
5. Ditambahkan Substrat chromogen warna dan didapat
Intensitas sinyal chromogenic dr ikatan Ag-Ab*.
Pembentukan warna berbanding LURUS
dgn jumlah antibody/antigen pasien.
 METODE KOMPETITIF
55

 analit TIDAK BERLABEL (antigen / antibodi) dlm sampel diukur

dari kemampuannya berkompetisi dgn antigen/antibodi
BERLABEL dalam immunoassay.

erRisa Devi Fauzi

 negative control
METODE KOMPETITIF
56

1. Analit pd sampel (red dots) berkompetisi dg analit

berlabel (yellow stars) unk berikatan dg Ab pada fase
solid.
2. Pencucian unk menghilangkan analit yg tidak
berikatan.
3. Tambahkan substrate chromogen,
yg akan memberi warna sesuai jumlah
ikatan enzyme-labeled analyte dg antibody.

Intensitas warna/sinyal berbanding

TERBALIK dg konsentrasi analit.
erRisa Devi Fauzi
 Peroxidase Enzyme is permanently
Basic Principle Of ELISA attached to Antibody Probe
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
Principle Substrate that
turns from
• Use an ENZYME-LABELED to detect the binding of clear to green
antigen (Ag) antibody (Ab).
• The enzyme converts a colorless substrate Ag Ag
(chromogen) to a colored product, indicating the
presence of Ag - Ab binding.
– optical density measured by micro-plate reader
• An ELISA can be used to detect either the
presence of Antigens or antibodies in a sample
depending how the test is designed

erRisa Devi Fauzi 59

 Materials Needed
Components in ELISA testing
• Conjugate – Horseradish peroxidase
• Substrate - O-phenyle diamine dihydrochloride

1. ELISA plate
2. Positive control ELISA reader
3. Negative control
4. Dilution Buffer (already in dilution tubes)
5. Conjugate (secondary antibody)
6. TMB Substrate
7. Stop solution

erRisa Devi Fauzi 60

erRisa Devi Fauzi 61
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
1. Ag solution di tambahkan pada Fase solid well  inkubasi
2. Pencucian  menghilangkan Ag yg tidak terikat pd phase solid
3. Tambahkan Ab primer TIDAK berlabel  inkubasi.
4. Pencucian  menghilangkan Ab primer TIDAK berlabel yg
tidak berikatan.
5. Tambahkan Ab Sekunder berlabel Enzyme  inkubasi
6. Pencucian  menghilangkan Ab Sekunder berlabel Enzyme yg
tidak berikatan.
7. Tambahkan zat chromogenic  inkubasi
8. Intensitas warna yg terbentuk menunjukkan kadar Ab
Sekunder berlabel Enzyme
Karena Ab sekunder HANYA akan berikatan dg Ab primer yg
telah berikatan dg Ag.  Intensitas warna yg terbentuk
menunjukkan kadar kompleks Ag-Ab*

63
 Basic Steps IMMUNOASSAY-ELISA

IMPORTANCE of incubation step:-

• INKUBASI pd suhu yg tepat sangat
diperlukan untuk mengikat
antigen dan antibodi dan
mengikat konjugasi dan warna
substrat dg baik.

erRisa Devi Fauzi 64

 Basic Steps IMMUNOASSAY-ELISA

IMPORTANCE of incubation step:-

• Pentingnya PENCUCIAN: - Untuk menghilangkan
setiap Antibodi / Antigen tidak terikat , agar
didapatkan hasil akurat.
• Jadi inkubasi & pencucian sangat penting untuk hasil
yang baik.

erRisa Devi Fauzi 65

Automated Immunoassay Analyzers

erRisa Devi Fauzi 67

Immuno- chromatographic Technique(ICT)
lateral flow test atau uji strip (strip test) atau Rapid Diagnostic Tests (RDT)
PRINCIPLE
• Imunokromatografi dengan prinsip serum yg diteteskan pada bantalan sampel
bereaksi dengan partikel yeng telah dilapisi dengan antibodi.
• Campuran ini selanjutnya akan bergerak sepanjang strip membran untuk berikatan
dengan antibody spesifik pada daerah tes, sehingga akan menghasilkan garis warna.

4/7/2019 Dr.T.V.Rao MD 70
Immuno- chromatographic Technique(ICT)
PRINCIPLE
Immunochromatographic device using enzyme immunoassay (EIA).
RESULT
 Immuno- chromatographic Technique(ICT)
lateral flow test atau uji strip (strip test) atau Rapid Diagnostic Tests (RDT)

RDTs are suitable for preliminary or

emergency medical screening and
for use in medical facilities with
limited resources.
ICT vs PCR