KLT DENSITOMETER

KELOMPOK 3 KIMIA ANALIA A 2018/2019

Amanda Novriza Aurellia 006
Hazura Noorfaizah 068
Leonardo Julian B 077
Omega Isai Firmana 091
A. Pengertian
 Metoda analisis instrumental yang berdasarkan interaksi
radiasi elektro magnetik dengan analit yang merupakan
noda pada KLT
 Alat dilengkapi dengan spektrofotometer yang
mempunyai pancaran sinar yang panjang gelombang
diatur dari 200 - 700 nm.
 Uji kualitatif dan kuantitatif dengan sistem absorbsi
sinar atau emisi sinar (flouresensi)
Pada era perkembangan teknik kromatografi saat
ini pemakaian "Thin Layer Chromatograph
Scanner" yang lebih populer dengan nama
densitometer makin banyak dipakai.

Susunan optik densitometer ini tidak banyak

berbeda dengan spektrofotometer tetapi pada
densitometer digunakan alat khusus reflection
photomultiplier, sebagai
pengganti photomultiplier pada
spektrofotometer.
4
4
B. Fungsi
 Kromatografi Lapis Tips (KLT) merupakan metode pemisahan komponen-
komponen atas dasar perbedaan adsorpsiatau partisi oleh fase diam di
bawah ngerakan pelarut pengembang/pengembang campur.
 Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran
senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang
menggunakan. Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang
memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya.
 Fungsi 1 : dipakai selayaknya sebagai metode untuk mencapai hasil
kualitatif, kuantitatif, atau preparatif.
 Fungsi 2 : ipakai untuk menjajaki system pelarut dan system penyangga yang
akan dipakai dalam kromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja
tinggi.
 Fungsi 3 : LT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa yang
sifatnya hidrofobik seperti lipida -lipida dan hidrokarbon yang sukar
dikerjakan dengan kromatografi kertas.
 Fungsi 4 : untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi
yang diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawasecara
kromatografi, dan isolasi senyawa murni skala kecil.
Keuntungan

 Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan

analisis.
 Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan de
ngan pereaksi warna, fluorosensi atau dengan radiasi
menggunakan sinar ultraviolet.
 Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending),
menurun (descending), atau dengan cara elusi 2
dimensi.
 Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena
komponen yang akan ditentukan merupakan bercak
yang tidak bergerak.
C. Bahan dan material

 lempeng kaca (TLC plate)

 Wadah kaca dan Penutup
 Plat amilum
 silika gel sebagai fase diam (fase diam)
 Pelarut pengembang/eluen/ (fase gerak)
 Lampu sinar UV
TLC Plate

Contain indikator, zinc sulfide yang fluoresensi dengan

warna hijau dibawah 254 nm sinar UV .
Stationary Fase

 Silika gel sebagai fasa diam

 Fasa diam Kromatografi Lapis Tipis (KLT) terbuat dari
serbuk halus dengan ukuran 5-50 cm
 Serbuk halus ini dapat berupa suatu adsorbs, suatu
penukar ion, suatu pengayak molekul atau dapat
merupakan penyangga yang dilapisi suatu cairan yang
membuat lapisan tipis menjadi bubur (slury)
(Soebagio,87,2003)
Fase gerak

 pelarut pengembang (eluen) umumnya sama dengan

pemilihan eluen untuk kromatografi adsorbs pengelusi
eluen naik sejalan dengan polaritas misalnya heksana,
aseton, alcohol dan air
 Eluen pengembang dapat dapat berupa pelarut tunggal
atau campuran pelarut dengan susunan tertentu
 Pelarut-pelarut pengembang harus mempunyai
kemurnian yang tinggi. Terdapatnya sejumlah kecil air
atau zat pengotor lainnya dapat menghasilkan
kromatografi yang tidak diharapkan
(Soebagio,88,2003)
Untuk KLT-Densitometer dilengkapi spekrofotometer yang
pancaran sinarnya 200-700 nm.
Susunan optic densitometer ada alat khusus Reflection
Photomultiplier

Thin Layer Chromatograph Scanner sekarang banyak

digunakan. Mampu melakukan Scannig dengan kecepata 1-
100 mm/s, Spectrum recording sampai degan 100 mm/s
D. Bagan Alat densitometer
 Gambar

Densitomet Densitomet
er er
Double Single
beam beam 12
12
 S S

Mk Mk
PM

PS
PM PM
I
I Lempeng
I
I

PM T Lempeng
(a) (b)
Bagan konfigurasi densitometer cara sinar tunggal (a), ganda (b)
• Photomultiflier tersebut dapat memperbesar tenaga beda potensial listrik
sehingga mampu menggerakan integrator.

• Integrator dengan sistem mikrokomputer secara langsung dapat

menghitung luas puncak atau tinggi puncak secara otomatik. Selain itu
mencatat nomer urut, kedudukan puncak pada ordinal Y atau waktu
retensinya.

• Letak sumbu Y dan X dari lempeng akan mempengaruhi hasil yang diperoleh.

• Kalau Y disesuaikan dengan arah gerak eluen dan sumbuk X tegak lurus
padanya atau merupakan deretan penotolan sampel pada lempeng.
Dengan cara itu mereka akan mendekati kepastian.

14
14
Cara kerja pelacakan bercak Densitometer
• Gambar
7

2 3 0,245 5b
5a 145

4
6

Gambar Densitometer Model CS-930 Shimadzu, 1= pendukung

Lempeng. 2=Sistem optik (sinar). 3=Sumber sinar (UV/Visibel)
4= Tombol penggerak lempeng, 5a= Angka kedudukan lempeng (mm)
5b= angka serapan 6= Key Board, 7= kromatogram
15
15
 Cara Kerja Densitometer
Lempeng yang telah digunakan untuk pemisahan. diuji
dulu kedudukan setiap bercak pada sumbu(X,Y). agar
sinar dapat tepat mengenai pusat bercak.

• Setelah tombol dihidupkan lempeng ditempat kan pada

satu garis deretan Y, bercak diatur, dan gerakan
lempeng diatur sesuai kedudukan bercak,
menggunakan mikrokomputer.

• Panjang gelombang diprogram agar terjadi serapan

secara maksimum, bila belum diketahui dilakukan
scanning lebih dulu.

16
16
• Pelacakan bercak,

a b

• Gambar. Cara pelacakan bercak dengan TLC Scanner

• (a) Model zig-zag. ( b). model lurus

Kelebihan penggunaan metode zig-zag lebih merata pengukurannya, apalagi

delta Y menggunakan jarak terkecil.
• Kelemahannya waktu lebih lama, tetapi ketelitian pengukuran lebih
terjamin dibanding penggunaan metode pengamatan lurus.

17
17
 Scanning pengujian kuantitatif ada 2 cara :

 A. Cara memanjang
Sinar dilewatkan pada tengah bercak, sehingga bercak hanya dideteksi
sepanjang garis tengahnya sepanjang sumbu Y,(Y1 sampai Y2). Hasilnya baik
bila bercak berbentuk bulat semetris.
 B. Sistem zig-zag
Sistem ini diprogram berjalan memanjang sumbu Y tetapi berbelok -belok
sampai garis tepi bercak pada garis X, sehingga bergerak dari Y1-Y2, dan X1-
X2.

18
18
Keterangan tambahan
• Besarnya bercak, dari X1 sampai X2 lebih besar dari garis tengah bercak
agar semua bercak teruji.
• Delta Y, selisih garis kesatu dan kedua makin kecil makin rata
pengukurannya, antara 0,001 sampai 0,1 mm, kode yang diberikan angka 1
sampai dengan 3.
• Simbul Y tergantung dalam meletakkan lempeng terhadap arah scanning,
(lihat panah) sesuai garis Y, dan garis tegak lurus Y adalah garis X.
• Perhitungan luas atau tinggi puncak sudah dilakukan secara otomatis oleh
alat, satuan luas area (mikro volt) yang tertera merupakan besaran
puncak. Kadang-kadang prosentase yang tertulis hanya merupakan kadar
relatif dari puncak yang muncul (tergambar).
• Dalam pengamatan lurus bila bercak nya tidak semitris akan kurang teliti
sebab konsentrasi terbesar tidak selalu dilewati sinar pelacak bercak.
• Penotolan dengan bercak kecil kemungkinan molekul senyawa untuk
mengumpul ditengah lebih banyak.

19
19
 Analisis Kualitatif

 Analisis kualitatif dengan KLT-Densitometri pada prinsipnya mengacu

kepada nilai Rf(Retardation factor) atau Faktor retardasi yaitu :
membandingkan Rf analit dengan Rf baku pembanding atau
membandingkan bercak kromatogram sample dengan
kromatogram "Reference Standart" yang dikenal dengan : Factro
Retensi Relatif (Rx)
 Untuk penentuan kualitatif dengan Rs harus dilakukan bersamaan
dengan sample pada pelat yang sama.

Sinar mono
Intensitas Serapan

kromatis
Propil spektrogram

`
Bercak

20
Panjang gelombang (nm) 20
 Cara Menyari/ekstrasi

Bercak pada lempeng yang dilihat dibawah sinar UV diberi tanda (lingkari)
dengan ujung pensil, kemudian diambil lapisan tipis bersama bercaknya.
Lapisan yang diambil dimasukkan ke dalam gelas piala, ditambah pelarut yang
sesuai (etanol/ kloroform), diaduk, dan setelah larut, disaring.
Kedalam labu takar, dan cairan dijadikan volume sampai tepat tanda ( 10,0
ml). Larutan siap diuji dengan alat spektrofotometer.

21
• Larutan yang didapat diuji dengan spektrofotometer pada panjang gelombang
serapan maksimumnya.
• Karena pengenceran merupakan faktor penting untuk perhitungan kadar
senyawa yang diuji secara kuantitatif segala caranya,

22
Analisis Kuantitatif
Analisis kuantitatif hampir sama dengan spektrofotometri, penentuan kadar analit dikorelasikan dengan area bercak pada pelat KLT.

Cara penetapan kadar dapat dilakukan dengan :

1. Membandingkan area bercak analit dengan area bercak baku pembanding yang diketahui konsentrasinya.

Cx = Ax / Ap x Cp

Cx = konsentrasi analit

Ax = area analit

Ap = area baku pembanding

Cp = konsentrasi baku pembanding

2. Kurva kalibrasi :

Kurva kalibrasi dibuat dengan cara memplot area bercak terhadap konsentrasi dari satu seri larutan baku pembanding. Kurva yang tebentuk harus
linear, kemudian dengan persamaan garis regresi dapat ditentukan kadar analit.

Penentuan kadar analit yang dikorelasikan dengan area noda plat KLT akan lebih terjamin kesahihannya dibanding metode KCKT atau KGC, sebab
area noda kromatogram diukur pada posisi diam atau “zig-zag” menyeluruh. Korelasi kadar analit pada noda kromatogram yang dirajah terhadap
area tidak menunjukkan garis lurus, akan tetapi merupakan garis lengkung mendekati parabola (mulja,1985).
 Sumber Radiasi

• Pada umumnya spektrofotodensitometer memberikan rentang

gelombang penentuan 200-630 nm.

• Lampu D2 (Deuterium) dipakai untuk pengukuran pada daerah

ultra violet dan lampu tungstein pengukuran pada daerah
sinar tampak.

• Untuk penentuan pendar fluor dan pemadaman pendar fluor

dipakai lampu busur Hg bertekanan tinggi.

• Pada densitometri juga dilakukan penentuan transmisi atau

absorpsi dan retleksi pada panjang gelombang maksimal.
•

24
• Pada penentuan pendar fluor dan pemadaman pendar
fluor diukur pada panjang gelombang dimana terjadi
emisi atau intensitas relatif pendar fluor yang optimal.
• Monokromator dipakai monokromator kisi difraksi
• Detektor PMI' (Photo Multiplier Tube = Tabung
Penggandaan Foton) merupakan detektor umum yang
dipakai pada densitometer.

25
 Densitometri diutamakan untuk analisis kuantitatif analit-analit dengan kadar
yang sangat kecil yang yang merupakan hasil pemisahan dengan KL T.
 S.Levi dan Reisfeld telah mengangkat metode densitometrik ke tingkat analisis
kuantitatif ultramikro. Keduanya telah berhasil meneliti testosteron dalam
cairan biologis pada rentang kadar (1 hingga 250) ng, LSD dengan kadar (2-
150) ng, dan kholesterol (4 -150) ng dengan pengukuran pendaran pada noda
(kromatogram) KLT.
 Penentuan kadar analit yang dikorelasikan dengan area noda pada KLT akan
lebih terjamin kesahihannya dibanding metode KCKT (Kromatografi Cair
kinerja Tinggi) atau KGC (Kromatografi Gas Cair). sebab area noda
kromatogram diukur pada posisi lurus atau "Zig-zag" menyeluruh.
 Korelasi kadar analit pada noda kromatogram yang dirajah terhadap area tidak
menunjukkan garis lurus, akan tetapi merupakan garis lengkung mendekat
parabola.

26
26
 KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (TLC)
Gambar Chamber yang banyak digunakan

Chamber

lempeng

27
*Chamber harus dijenuhkan dulu
selama lebih kurang 30 menit
dengan bantuan kertas saring.
*Penguapan dari fase gerak dari
permukaan lempeng, dalam
chamber yang tidak jenuh akan
menghasilkan Rf yang lebih besar,
reproducibility hasil keterulangan
Rf tak bagus dan permukaan fase
gerak akan konkap.
*Fase gerak yang tidak mau
campur dengan sempurna akan
menghasilkan chamber yang tidak
jenuh

28
 Lempeng

 Lempeng HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatografi) atau KLTKT

(kromatografi lapis tipis Kinerja Tinggi) tidak dapat digunakan untuk preparatif
(butuh lempeng cukup banyak), maka hanya untuk analisis kuantitatif

 Pelacak bercak untuk analisis kuantitatif dapat digunakan densitometer baik

menggunakan pereaksi bercak lebih dulu maupun langsung menggunakan pelacak
sinar ultra ungu, sinar tampak maupun sinar fluoresensi. (Didiskusikan tersendiri)

29
ALAT HPTLC= HIGH PERFORMANCE
THIN LAYER CHROMATOGRAPHY
 Penotolan

Pipa kapiler

Totolan
Totolan manual.
31
 Chamber
Tempat elusi

Lempeng Silica gel

Bercak

Cairan elusi
32
JALANNYA SINAR (OTIK)
HASIL SCANNING SATU
BERCAK
 Scanning senyawa yang berbeda

Digunakan metode:
 Satu persatu dgn lambda serapan maksimumnya.
 Cara serentak, dgn menggunakan lambda yang dapat dimiliki oleh semua
senyawa.
Hasil Rekaman
 Hasil
 Scanning tiap bercak dengan lambda berbeda

39
 Scanning serentak beberap puncak/bercak

40
MENGHITUNG WAKTU RETENSI

Rf = a/c (cm)
b/c (cm)
E. Penerapan TLC DENSITOMETER

1. Digunakan dalam fotografi film untuk mengukur mas

sa jenis film

2. Digunakan untuk mengukur kejenuhan hasil print

3. Untuk kalibrasi peralatan printing

4. Mengukur radioaktif senyawa,seperti DNA

yang terlabel secara kuantitatif.
 F. TAMBAHAN
Kurva hubungan serapan dan kadar
• Persamaan Kubelka-Munk
• Korelasi kadar analit yang dirajah terhadap area kromatogram tidak
merupakan garis lurus.

• Bila REM (Radiasi Elektro Magnetik) dengan intensitas semula (I0) jatuh
pada permukaan lapisan tipis yang tidak homogen dengan arah rambatan
tegak lurus, maka sebagian dari REM tersebut akan:
• direfleksikan (Is)
• diserap oleh analit lapisan tipis (I)
• diteruskan (It).
• I=10 + Is + It

43
43
 Intensitas REM yang direfleksikan tergantung pada koefisien permukaan
lapis tipis (E), yang dinyatakan sebagai :
 Is = I. E
 Harga E sangat dipengaruhi oleh jenis lapisan tipis yang dipakai.
Selanjutnya akan didapat :
 I0 =I-Is
 I0=I-I.E=(I-E)I
 Apabila lapisan tipis tersebut merupakan lapisan tipis yang homogen maka
akan berlaku hukum Lambert Beer seperti pada spektrofotometri.
 It =I0. e-KX

44
44
E = koefisien permukaan lapis tipis
↓
Hk. Lambeert Beer → It = I0 . e-kt
x = tebal medium lapis tipis It =I0. e-KX
k = koefisien absorbsi
e-kt = berkurangnya I radiasi elektro magnetik yang melewati medium → “
Optical density”
↓
Parameter S (koef. Penghamburan)
 Oleh sehab itu pada metode spektrofoto-densitometri dikenal parameter
:
 K (koefisien absorbsi)
 S (koefisien penghamburan).

 Karena adanya parameter S inilah terjadi penurunan intensitas radiasi

yang masuk medium lapis tipis yang dihamburkan oleh partikel-partikel
fase diam.

46
46
Parameter S (koef.
Penghamburan)
Menyebabkan penurunan I radiasi yang masuk ke medium lapis tipis
Sx = tiap pelat berbeda harganya
= 0 -10

dl = + (S + K ) I + S
- dx j

dl
+ dx = - (S + K ) I + Sj
I = radiasi elektromagnetik yang arahnya tegak
lurus menuju permukaan lapis tipis
j = radiasi elektromagnetik yang arahnya
meninggalkan permukaan lapis tipis
S = faktor hamburan untuk tiap satu satuan
tebal lapis tipis
K = faktor penyerapan/absorpsi untuk tiap satu satuan tebal lapis tipis
X = tebal lapisan untuk tiap satu satuan tebal
lapis tipis
Pernyataan Kubelkan – Munk :
( I – R )2 C
= E x
2R S
E = absorbsi radiasi elektromagnetik oleh analit
pada pelat KLT
C = kadar analit
R = cahaya terpantul pada permukaan lempang
↓
Korelasi area analit dengan kadar dinyatakan sebagai kurva parabola :
A2 = f ( C )
log A = f ( log C )
G. Kesimpulan penggunaan HPTLC
 Densitometri merupakan metode analisis instrumental yang didasarkan pada
interaksi radiasi elektromagnetik dengan analit yang merupakan bercak pada
Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
 Kromatografi Lapis Tips (KLT) merupakan metode pemisahan komponen-
komponen atas dasar perbedaan adsorpsiatau partisi oleh fase diam di
bawah ngerakan pelarut pengembang/pengembang campur.

50
TERIMA KASIH