KELOMPOK 1

MUH.AGUS SALIM
ADRIAWAN
MANSYUR
UMMUL
MUTMAINNAH

TLC-DENSITOMETRI
PENGERTIAN

Pengertian Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi Lapis Tips (KLT) merupakan metode pemisahan komponen-komponen
atas dasar perbedaan adsorpsiatau partisi oleh fase diam di bawah ngerakan
pelarut pengembang/pengembang campur.
Pengertian KLT-Densitometri
Densitometri merupakan metode analisis instrumental yang didasarkan pada
interaksi radiasi elektromagnetik dengan analit yang merupakan bercak pada
Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Densitometri dimaksudkan untuk analisis kuantitatif
analit dengan kadar kecil, yang sebelumnya dilakukan pemisahan dengan
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) (Rohman, 2009).
Bagian-bagian TLC-
DENSITOMETRI
Sumber radiasi (Source), pengatur panjang gelombang (λ selector), beam spliter,
thin layer plate (end view), detector phototube (transmitance position) Sumber
radiasi ada 3 macam tergantung rentang panjang gelombang dan prinsip
penentuan. Pada umumnya densitometri memberikan rentang gelombang
penentuan 200-630 nm.
Monokromator dengan fungsi yang sama seperti pada spektrofotometri UV-Vis
yang diperlukan pada densitometer. Biasanya dipakai monokromator kisi difraksi
1200 garis/mm.
Detektor PMT Photo Multiplier Tube = Tabung Penggandaan Foto) merupakan
detektor umum yang dipakai pada densitometer.
Prinsip Kerja Dari TLC-
DENSITOMETRI
– INSTRUMENT KLT (TLC Scanner 3 CAMAG)
a. Detektor
Detektor pada alat TLC Scanner 3 CAMAG menggunakan
photomultipliers.Komponen didalam phot omultipier (PMT) sendiri adalah
photomultiplier tube (tabung vakum photomultiplier), photocathode (katoda
metalik yang terbuat dari bahan logam multi alkali), struktur dynode (berbentuk
lempengan cekung) dan anoda (memilki spectral sensitivity 185-850 nm).
Prinsip kerja dari PMT adalah permukaan logam katoda disinari dengan seberkas
cahaya dan sejumlah elektron terpancar dari permukaannya, yang biasa disebut
dengan efek fotoelektrik dengan kondisi hampa udara.
– Gambar 2.1Konstruksi photomultiplier tube dan bentuk fisik photomultiplier.
Monokromator
Monokromator adalah alat yang paling umum dipakai untuk menghasilkan berkas
radiasi dengan satu panjang gelombang.Monokromator untuk radiasi ultra violet,
sinar tampak dan infra merah adalah serupa, yaitu mempunyai celah (slit), lensa,
cermin dan prisma atau grating. Terdapat 2 macam monokromator yaitu
monokromator prisma Bunsen dan monokromator grating Czerney-Turney
Gambar 2.4 Monokromator dengan grating
– Fungsi prisma adalah untuk memisahkan sinar polikromatis dari sumber cahaya
menjadi sinar monokromatis. Bila seberkas cahaya dilewatkan melalui sebuah
prisma, maka cahaya tersebut akandiuraikan menjadi beberapa warna (terdapat
berbagai warna merah, jingga, hijau, biru, dan lain-lain).
– Absorbansi
Penyerapan hanya terjadi jika energi foton yang datang cocok dengan energy yang
diperlukan untuk memindahkan satu elektron terluarnya dari tingkat dasar ke
tingkat tereksitasi (atau dari pita valensi ke pita konduksi di dalam zat
padat). Dengan spektroskopi dari cahaya transmisi bisa diketahui tingkat/pita
energi dari suatu atom/molekul/zat padat.
Berkas radiasi elektromagnet bila dilewatkan pada sampel kimia maka sebagian
akan terabsorpsi. Energi elektromagnet yang ditransfer ke molekul sampel akan
menaikan tingkat energi (tingkat tereksitasi). Molekul akan dieksitasi sesuai dengan
panjang gelombang yang diserapnya.
– Transmitansi
Apabila suatu berkas sinar radiasi dengan intensitas Io dilewatkan melalui suatu
larutan dalam wadah transparan maka sebagian radiasi akan diserap sehingga
intensitas radiasi yang diteruskan It menjadi lebih kecil dari Io. Transmitansi
dengan simbol T dari larutan merupakan fraksi dari radiasi yang diteruskan atau
ditansmisikan oleh larutan
– Alat TLC Scanner 3 CAMAG, terdiri atas bagian -bagian elektronik, yaitu :
– 1. A compartment for plate positioning (with motor driver).
– 2. Optical system.
– 3. Three light source ( Deuterium lamp, Tungsten – halogen lamp, Mercury
vapor lamp).
– · Scanner setup.
– Terdapat 2 macam cara sistem kerja / sistem pengukuran TLC Scanner 3 CAMAG, a
ntara lain :
– 1. Absorbance Mode.
– 2. Fluorescence Mode.
Gambar 2.8 TLC Scanner 3 (CAMAG) (Service Manual Book TLC Scanner 3
CAMAG)
Cara Kerja Tlc Densitometri

Absorbance Mode
Setelah sampel pada plat TLC mengalami pemisahan, selanjutnya plat TLC dimasukkan
kedalam alat TLC Scanner untuk dilakukan pengukuran. Dan ditentukan range panjang
gelombang, lalu di start/ dimulai. Prinsip kerja dengan cara absorbance, yaitu energy
cahaya dari sumber lampu yang telah dipilih masuk ke monokromator (M) kemudian
cahaya yang keluar dari monokromator akan mengenai mirror dan dipantulkan
menurun mengenai dan melalui Beam Splitter dan langsung mengenai permukaan
putih pada plat TLC yang kemudian akan dipantulkan ke detektor pengukuran. Sebagian
cahaya yang mengenai Beam Splitter dipantulkan ke reference detektor. Reference
detektor berfungsi untuk mengatur sensitivity / kepekaan cahaya secara otomatis pada
detektor pengukuran sehingga mendapatkan pancaran cahaya lampu yang tepat pada
panjang gelombang tertentu. Kedua detektor memakai photomultiplers yang mana
lebih sensitive dengan range panjang gelombang yang besar.
– Energi cahaya yang dipantulkan dideteksi oleh photomulplier, yang mana
photon memukul/mengenai katoda photomultiplier dan dikuatkan oleh
dynodes. Kemudian kromatogram (sampel pada plat) discan dan timbul
perbedaan tegangan yang dihasilkan pada detektor yang mana diplot sebagai
fungsi posisi pengukuran untuk hasil dari sebuah absorption scan. Jika backgr
ound plat discan, intensitas cahaya yang penuh dipantulkan kembali dan
menghasilkan sinyal 100% karena disana tidak ada zat yang menyerap cahaya.
Bila daerah kromatogram discan kemudian akan menyerap bagian penyinaran
cahaya dan memancarkan intensitas cahaya rendah daripada background plat
kemudian akan menghasilkan sinyal pada detektor.
– Sistem scanning bekerja berdasarkan pergerakan plat TLC pada compartment
secara otomatis dan mempunyai posisi yang dapat diatur terhadap sumbu x dan
y. Plat TLC / objek pengukuran yang berada pada compartment digerakkan oleh
motor stepper yang terletak dibawah sorotan lampu.
– Absorbance adalah perbedaan diantara cahaya yang terjadi dan cahaya yang
terserap diukur sebagai fungsi karakteristik zat. Dengan kata lain, absorbance
adalah perbedaan diantara pantulan cahaya yang diukur dari tempat yang
kosong pada plat TLC dan pantulan cahaya dari zat pada plat TLC yang sama.
– Flourescence Mode
– Prinsip kerja dengan cara fluorescence sama dengan cara absorbance, yaitu pada saat
melakukan scan pada suatu zat pada plat TLC, background plat tidak ada sinyal karena
adanya panjang gelombang yang tidak diperlukan akan dihalangi oleh filter.
– Jika daerah fluorescent (sampel pada plat) mengalami scanning maka akan memancarkan
cahaya yang akan masuk dan melewati filter kemudian menghasilkan sinyal pada detektor.
Pengukuran fluorescent ini hanya untuk menganalisa zat yang tidak tampak.
– Hasil sinyal output dari detektor dihubungkan dengan perangkat elektronik seperti amplifier
dan A/D Converter. Setelah sinyal output dari detektor masuk ke A/D Converter, lalu sinyal
output (analog) ini akan diubah menjadi sinyal digital, yang mana akan dihubungkan
langsung ke PC melalui connection serial interface RS232. Dengan didukungnya software
WinCATS maka dapat mengetahui nilai konsentrasi zat dan dapat menampilkan gambar
Peak (puncak kromatogram), yang mana gambar peak ini berbentuk mirip dengan kurva
Gaussian, yang menunjukkan karakteristik tersendiri dari zat yang diukur.
Gambar mekanisme Kerja alat
TLC-DENSITOMETRI
Aplikasi (Penotolan) Sampel

– Untuk memperoleh roprodusibilitas, volume sampel yang ditotolkan paling

sedikit 0,5 µl. Jika volume sampel yang ditotolkan lebih besar dari 2-10
µl, maka penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan
pengeringan antar totolan.
Resolusi (Rs)/Derajat
Keterpisahan
– Perhitungan Nilai Rf
– Senyawa -senyawa yang terpisah pada lapisan tipis lebih baik dikerjakan dengan
pereaksi kimia dan reaksi -reaksi warna. Pada umumnya untuk identifikasi
senyawa menggunakan harga Rf. Harga Rf didefinisikan sebagai berikut :
– Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen
– jarak yang ditempuh oleh pelarut
Harga Rf untuk senyawa-senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga -harga
standard. Perlu diperhatikan bahwa harga -harga Rf yang diperoleh hanya berlaku
untuk campuran tertentu dari pelarut dan penyerap yang digunakan, meskipun
demikian harga Rf untuk berbagai campuran dari pelarut dan penyerap dapat
diperoleh. Senyawa standard biasanya memiliki sifat-sifat kimia yang mirip dengan
senyawa yang dipisahkan pada kromatogram.
Nilai Rf dinyatakan hingga angka 1,0 beberapa pustaka menyatakan nilai Rf yang
baik yang menunjukkan pemisahan yang cukup baik adalah berkisar antara 0,2-0,8.
Aplikasi KLT-Densitometri

Analisis Kualitatif
Analisis kualitatif dengan KLT-Densitometri pada prinsipnya mengacu kepada nilai
Rf (Retardation factor) atau Faktor retardasi yaitu : membandingkan Rf analit
dengan Rf baku pembanding atau membandingkan bercak kromatogram sample
dengan kromatogram "Reference Standart" yang dikenal dengan : Factro Retensi
Relatif (Rx)
Untuk penentuan kualitatif dengan Rs harus dilakukan bersamaan dengan sample
pada pelat yang sama.
Analisis Kuantitatif
Analisis kuantitatif hampir sama dengan spektrofotometri, penentuan kadar analit dikorelasikan
dengan area bercak pada pelat KLT.
Membandingkan area bercak analit dengan area bercak baku pembanding yang diketahui
konsentrasinya.
Cx = Ax / Ap x Cp
Cx = konsentrasi analit
Ax = area analit
Ap = area baku pembanding
Cp = konsentrasi baku pembanding
2. Kurva kalibrasi :
Kurva kalibrasi dibuat dengan cara memplot area bercak terhadap konsentrasi dari satu seri
larutan baku pembanding. Kurva yang tebentuk harus linear, kemudian dengan persamaan garis
regresi dapat ditentukan kadar analit.
Penentuan kadar analit yang dikorelasikan dengan area noda plat KLT akan lebih terjamin
kesahihannya dibanding metode KCKT atau KGC, sebab area noda kromatogram diukur pada posisi
diam atau “zig-zag” menyeluruh. Korelasi kadar analit pada noda kromatogram yang dirajah
terhadap area tidak menunjukkan garis lurus, akan tetapi merupakan garis lengkung mendekati
parabola (mulja,1985).
Analisis Data

ANALISA PENGUKURAN KADAR LARUTAN TEMULAWAK MENGGUNAKAN

METODE TLC (THIN LAYER CHROMATOGRAPHY
Data Senyawa Standard Curcuminoid dan Senyawa Temulawak.
Untuk plat lapisan tipis menggunakan plat aluminium tipis dengan ukuran 20 x 10
cm (dibagi menjadi 2 yang semula ukurannya 20 x 20 cm), dan membuat batas
kanan dan kiri 1.5 cm, batas bawah dan atas 1 cm dari titik sampel ke tepi plat.
No. Nama Senyawa Berat senyawa (ng) Area
1. Standard curcuminoid 1 100 7500
2. Standard curcuminoid 2 200 13132.34
3. Standard curcuminoid 3 300 17018.33
4. Standard curcuminoid 4 400 20668.43
5. Standard curcuminoid 5 500 22902.21
6. Standard curcuminoid 6 600 24620.62
7. Standard curcuminoid 7 700 26447.63
8. Standard curcuminoid 8 800 27259.92
9. Standard curcuminoid 9 900 28230.53
10. Temulawak 1 712.5 26110.21
11. Temulawak 2 713.81 26142.49
12. Temulawak 3 723.55 26382.93
No. Nama Senyawa Berat Senyawa (ng)

1. Temulawak 1 712.50

2. Temulawak 2 713.81

3. Temulawak 3 723.55
Gambar 4.1 Batas antara tepi plat dengan sampel Gambar 4.3 Jarak Rf sampel dengan pelarut
 Hasil Pengukuran ( Scan ) Standard
dan Sampel

Gambar 4.4 Kurva Standard Curcuminoid 1 Gambar 4.5 Kurva Sampel Temulawak 1
 Gambar 4.8 Data Kurva Kalibrasi
Standard Curcuminoid

Gambar 4.7 Kurva Kalibrasi Standard Curcuminoid

Kesimpulan

Kesimpulan yang dapat diambil dari tugas akhir ini, adalah sebagai berikut :
Telah dapat ditentukan kadar curcuminoid dengan menggunakan metode TLC.
Hasil penentuan skadar sampel yang diukur adalah kadar senyawa temulawak 1
sebesar 0.178125 % dan kadar senyawa temulawak 2 sebesar 0.178453 % serta
kadar senyawa temulawak 3 sebesar 0.180887 %.
 DAFTAR PUSTAKA

Gandjar, Ibnu Ghalib dan Abdul Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta:Pustaka Pelajar.
Mulja M., Suharman. 1995. Analis Instrumental. Surabaya: Airlangga University Press.
Stahl, E.1985. Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi, Diterjemahkan oleh Kosasih
Padmawinata dan Iwang Soediro. Bandung : Penerbit ITB.
Sastrohamidjojo, H. 1991. Kromatografi. Yogyakarta: Liberty.
Touchstone, JC., Rogers, D. 1980. Thin Layer Chromatography Quantitative Enviromental and
Clinical Application. New York: A Willey Intenscience Publication, John Willey & Sons.