lnteraksi radiasi elektromagnetik dengan noda pada KLT secara :

 Absorpsi
 Transmisi
 Pantulan (refleksi) pendar fluor
Pemadaman pendar fluor

Densitometri merupakan metode analisis instrumental yang didasarkan pada

interaksi radiasi elektromagnetik dengan analit yang merupakan bercak pada
Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Densitometri dimaksudkan untuk analisis kuantitatif
analit dengan kadar kecil, yang sebelumnya dilakukan pemisahan dengan
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) (Rohman, 2009).
Interaksi radiasi elektromagnetik dengan noda KLT yang ditentukan adalah
absorpsi, transmisi, pantulan (refleksi) pendar fluor atau pemadaman pendar fluor dari
radiasi semula. Densitometri lebih dititik beratkan untuk analisis kuantitatif analit-
analit dengan kadar yang sangat kecil yang perlu dilakukan pemisahan terlebih dahulu
dengan KLT.
Densitometri merupakan metode penetapan kadar suatu senyawa pada lempeng
kromatografi, menggunakan instrumen TLC scanner, pengukuran dilakukan dengan
cara mengukur serapan analit (cahaya yang diukur dapat berupa cahaya yang
dipantulkan atau yang diteruskan), pemadaman fluoresensi untuk lapisan yang
mengandung bahan berfluorsensi analit atau hasil eaksi analit.
Teknik penggunaannya didasarkan pada pengukuran sinar yang diteruskan,
diserap dan dipantulkan atau yang dipendarkan. Sinar yang dipantulkan mengalami
hambatan oleh pendukung lempeng dan keseragaman fase diamnya.
S. LEVI dan R. Reisfeld telah mengangkat metode densitometri ke tingkat
analisis kualitatif ultrmikro. Prinsipnya analisis kuantitatif dengan metode
densitometri hampir sama dengan spektrofotometri.
Instrumen
Komponen penting dari densitometer antara lain:
1. Sumber radiasi (Source), pengatur panjang gelombang (λ selector), beam spliter,
thin layer plate (end view), detector phototube (transmitance position) Sumber
radiasi ada 3 macam tergantung rentang panjang gelombang dan prinsip
penentuan. Pada umumnya densitometri memberikan rentang gelombang
penentuan 200-630 nm. Lampu Deuterium (D2) dipakai untuk pengukuran pada
 daerah cahaya tampak. Untuk penetapan pendar fluor dan pemadaman pendar
fluor dipakai lampu busur Hg bertekanan tinggi. Sama seperti pada
spektorfotometri, pada densitometri juga dilakukan penentuan transmisi atau
adsorpsi dan refleksi pada panjang gelombang maksimal. Pada penetapan pendar
fluor dan pemadaman pedar fluor juga harus dilakukan pada panjang gelombang
dimana terjadi emisi atau intensitas realitif pendar fluor yang optimal.
2. Monokromator dengan fungsi yang sama seperti pada spektrofotometri UV-Vis
yang diperlukan pada densitometer. Biasanya dipakai monokromator kisi difraksi
1200 garis/mm.
3. Detektor PMT Photo Multiplier Tube = Tabung Penggandaan Foto merupakan
detektor umum yang dipakai pada densitometer.
INSTRUMENT KLT (TLC Scanner 3 CAMAG)
a. Detektor
Detektor pada alat TLC Scanner 3 CAMAG menggunakan photomultipliers.
Komponen didalam photomultipier (PMT) sendiri adalah photomultiplier tube
(tabung vakum photomultiplier), photocathode (katoda metalik yang terbuat dari
bahan logam multi alkali), struktur dynode (berbentuk lempengan cekung) dan anoda
(memilki spectral sensitivity 185-850 nm).
Prinsip kerja dari PMT adalah permukaan logam katoda disinari dengan seberkas
cahaya dan sejumlah elektron terpancar dari permukaannya, yang biasa disebut
dengan efek fotoelektrik dengan kondisi hampa udara.
Elektron yang terpancar dan terlepas karena adanya sekumpulan energi yang timbul
dan dikuatkan oleh susunan komponen dynode (linier -focused type) secara berurutan
dan keluar mengenai anoda. Elektron tersebut terikat dalam logam dengan energi W
(eV), yang dikenal sebagai fungsi kerja (work function), logam yang berbeda memilki
fungsi kerja yang berbeda pula. Dan logam katoda yang digunakan sebagai
permukaan fotosensitif, dibawah panjang gelombang pancung (cutoff wavelength)
λc, sembarang sumber cahaya, selemah apapun, akan menyebabkan terjadinya
pemancaran fotoelektron. Cahaya yang masuk difokuskan dengan melewati focusing
electrode dan elektron mengenai dynode pertama kemudian dipantulkan dan
dipancarkan ke dynode kedua sampai ke dynode yang terakhir (proses pengalian)
sehingga terjadi muatan elektron yang lebih besar dan timbul tegangan.
b. Monokromator
Monokromator adalah yang dipakai untuk menghasilkan berkas radiasi dengan satu
panjang gelombang. Monokromator untuk radiasi ultra violet, sinar tampak dan infra
merah adalah serupa, yaitu mempunyai celah (slit), lensa, cermin dan prisma atau
grating.
Fungsi prisma adalah untuk memisahkan sinar polikromatis dari sumber cahaya
menjadi sinar monokromatis. Bila seberkas cahaya dilewatkan melalui sebuah
prisma, maka cahaya tersebut akan diuraikan.
c. Absorbansi
Penyerapan hanya terjadi jika energi foton yang datang cocok dengan energi yang
diperlukan untuk memindahkan satu elektron terluarnya dari tingkat dasar ke tingkat
tereksitasi (atau dari pita valensi ke pita konduksi di dalam zat padat). Dengan
spektroskopi dari cahaya transmisi bisa diketahui tingkat/pita energi dari suatu
atom/molekul/zat padat.
Berkas radiasi elektromagnet bila dilewatkan pada sampel kimia maka sebagian akan
terabsorpsi. Energi elektromagnet yang ditransfer ke molekul sampel akan menaikan
tingkat energi (tingkat tereksitasi). Molekul akan dieksitasi sesuai dengan panjang
gelombang yang diserapnya.
d. Transmitansi
Apabila suatu berkas sinar radiasi dengan intensitas Io dilewatkan melalui suatu
larutan dalam wadah transparan maka sebagian radiasi akan diserap sehingga
intensitas radiasi yang diteruskan It menjadi lebih kecil dari Io. Transmitansi dengan
simbol T dari larutan merupakan fraksi dari radiasi yang diteruskan atau
ditansmisikan oleh larutan, yaitu:
TLC Scanner 3 CAMAG
Alat TLC Scanner 3 CAMAG, terdiri atas bagian -bagian elektronik, yaitu :
1. A compartment for plate positioning (with motor driver).
2. Optical system.
3. Three light source (Deuterium lamp, Tungsten – halogen lamp, Mercury vapor
lamp).
· Scanner setup.
Terdapat 2 macam cara sistem kerja / sistem pengukuran TLC Scanner 3 CAMAG,
antara lain:
1. Absorbance Mode.
2. Fluorescence Mode.
Gambar 2.8 TLC Scanner 3 (CAMAG) (Service Manual Book TLC Scanner 3
CAMAG)
Absorbance Mode
Setelah sampel pada plat TLC mengalami pemisahan, selanjutnya plat TLC
dimasukkan kedalam alat TLC Scanner untuk dilakukan pengukuran. Dan ditentukan
range panjang gelombang, lalu di start/ dimulai. Prinsip kerja dengan cara absorbance,
yaitu energy cahaya dari sumber lampu yang telah dipilih masuk ke monokromator
(M) kemudian cahaya yang keluar dari monokromator akan mengenai mirror dan
dipantulkan menurun mengenai dan melalui Beam Splitter dan langsung mengenai
permukaan putih pada plat TLC yang kemudian akan dipantulkan ke detektor
pengukuran. Sebagian cahaya yang mengenai Beam Splitter dipantulkan ke reference
detektor. Reference detektor berfungsi untuk mengatur sensitivity / kepekaan cahaya
secara otomatis pada detektor pengukuran sehingga mendapatkan pancaran cahaya
lampu yang tepat pada panjang gelombang tertentu. Kedua detektor memakai
photomultiplers yang mana lebih sensitive dengan range panjang gelombang yang
besar.
Energi cahaya yang dipantulkan dideteksi oleh photomulplier, yang mana photon
memukul/mengenai katoda photomultiplier dan dikuatkan oleh dynodes. Kemudian
kromatogram (sampel pada plat) discan dan timbul perbedaan tegangan yang
dihasilkan pada detektor yang mana diplot sebagai fungsi posisi pengukuran untuk
hasil dari sebuah absorption scan. Jika backgr ound plat discan, intensitas cahaya
yang penuh dipantulkan kembali dan menghasilkan sinyal 100% karena disana tidak
ada zat yang menyerap cahaya. Bila daerah kromatogram discan kemudian akan
menyerap bagian penyinaran cahaya dan memancarkan intensitas cahaya rendah
daripada background plat kemudian akan menghasilkan sinyal pada detektor.
Sistem scanning bekerja berdasarkan pergerakan plat TLC pada compartment secara
otomatis dan mempunyai posisi yang dapat diatur terhadap sumbu x dan y. Plat TLC /
objek pengukuran yang berada pada compartment digerakkan oleh motor stepper yang
terletak dibawah sorotan lampu.
Absorbance adalah perbedaan diantara cahaya yang terjadi dan cahaya yang terserap
diukur sebagai fungsi karakteristik zat. Dengan kata lain, absorbance adalah
perbedaan diantara pantulan cahaya yang diukur dari tempat yang kosong pada plat
TLC dan pantulan cahaya dari zat pada plat TLC yang sama.
Flourescence Mode
Prinsip kerja dengan cara fluorescence sama dengan cara absorbance, yaitu pada saat
melakukan scan pada suatu zat pada plat TLC, background plat tidak ada sinyal
karena adanya panjang gelombang yang tidak diperlukan akan dihalangi oleh filter.
Jika daerah fluorescent (sampel pada plat) mengalami scanning maka akan
memancarkan cahaya yang akan masuk dan melewati filter kemudian menghasilkan
sinyal pada detektor. Pengukuran fluorescent ini hanya untuk menganalisa zat yang
tidak tampak.
Hasil sinyal output dari detektor dihubungkan dengan perangkat elektronik seperti
amplifier dan A/D Converter. Setelah sinyal output dari detektor masuk ke A/D
Converter, lalu sinyal output (analog) ini akan diubah menjadi sinyal digital, yang
mana akan dihubungkan langsung ke PC melalui connection serial interface RS232.
Dengan didukungnya software WinCATS maka dapat mengetahui nilai konsentrasi
zat dan dapat menampilkan gambar Peak (puncak kromatogram), yang mana gambar
peak ini berbentuk mirip dengan kurva Gaussian, yang menunjukkan karakteristik
tersendiri dari zat yang diukur.

D. Aplikasi KLT-Densitometri
1) Analisis Kualitatif
Analisis kualitatif dengan KLT-Densitometri pada prinsipnya mengacu kepada nilai
Rf (Retardation factor) atau Faktor retardasi yaitu : membandingkan Rf analit dengan
Rf baku pembanding atau membandingkan bercak kromatogram sample dengan
kromatogram "Reference Standart" yang dikenal dengan : Factro Retensi Relatif (Rx)
Untuk penentuan kualitatif dengan Rs harus dilakukan bersamaan dengan sample
pada pelat yang sama.
2) Analisis Kuantitatif
Analisis kuantitatif hampir sama dengan spektrofotometri, penentuan kadar analit
dikorelasikan dengan area bercak pada pelat KLT.
Cara penetapan kadar dapat dilakukan dengan :
1. Membandingkan area bercak analit dengan area bercak baku pembanding yang
diketahui konsentrasinya.
Cx = Ax / Ap x Cp
Cx = konsentrasi analit
Ax = area analit
Ap = area baku pembanding
Cp = konsentrasi baku pembanding
2. Kurva kalibrasi :
Kurva kalibrasi dibuat dengan cara memplot area bercak terhadap konsentrasi dari
satu seri larutan baku pembanding. Kurva yang tebentuk harus linear, kemudian
dengan persamaan garis regresi dapat ditentukan kadar analit.
Penentuan kadar analit yang dikorelasikan dengan area noda plat KLT akan lebih
terjamin kesahihannya dibanding metode KCKT atau KGC, sebab area noda
kromatogram diukur pada posisi diam atau “zig-zag” menyeluruh. Korelasi kadar
analit pada noda kromatogram yang dirajah terhadap area tidak menunjukkan garis
lurus, akan tetapi merupakan garis lengkung mendekati parabola (mulja,1985).
DAFTAR PUSTAKA

Gandjar, Ibnu Ghalib dan Abdul Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis.
Yogyakarta:Pustaka Pelajar.

Mulja M., Suharman. 1995. Analis Instrumental. Surabaya: Airlangga University

Press.

Stahl, E.1985. Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi, Diterjemahkan

oleh Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro. Bandung : Penerbit ITB.
Sastrohamidjojo, H. 1991. Kromatografi. Yogyakarta: Liberty.
Touchstone, JC., Rogers, D. 1980. Thin Layer Chromatography Quantitative
Enviromental and Clinical Application. New York: A Willey Intenscience Publication,
John Willey & Sons.