Pada penelitian ini telah dilakukan validasi metode LC-MS dengan sebelumnya

melakukan optimasi kondisi LC-MS untuk penentuan senyawa asam klorogenat dari biji kopi
pinogu. Ekstrak asam klorogenat yang diperoleh kemudian dilarutkan dalam metanol
secukupnya setelah itu dilakukan identifikasi senyawamenggunakan liquid chromatography
(LC), LC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas unutk analisis dan pemurnian
senyawa tertentu dalam suatu sampel pada bidang yaitu farmasi dengan pemisahan sejumlah
senyawa organik, maupun senyawa-senyawa biologis, analisis senyawa non volatile, penentuan
molekul netral, isolasi, pemurnian senyawa, menetapkan kadar, menentukan senyawa aktif
obat.Sampel ekstrak asam klorogenat dipisahkan menggunakan fase diam kolom C18.Oktadesil
silica (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu
memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang maupun tinggi. Sifat
kolom yang digunakan pada penelitian ini adalah fase terbalik dimana fase diam kurang polar
dari fase gerak.Adapun fase gerak yang sering digunakan pada metode LC yaitu metanol atau
campuran air dengan asetonitril Gandjar, 200. Pada saat membuat pelarut untuk fase gerak, maka
sangat dianjurkan untuk menggunakan pelarut, buffer, dan reagen dengan kemurnian yang sangat
tinggi, dan lebih terpilih lagi jika pelarut yang akan digunakan untuk LC berderajat (LC grade).
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur secara
keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resoulsi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan
pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen sampel.Sehingga pelarut yang digunakan pada
penelitian ini yaitu metanol dan asetonitril LC-MS grade.
Setelah ekstrak dimasukkan kedalam kolom C18, ekstrak tersebut akan dielusi oleh fase
gerak yang dialirkan dengan menggunakan pompa. Fungsi dari penggunaan pompa yaitu untuk
menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reproduksibel, konstan dan
bebas dari gangguan kemudian disuntikan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir ke
bawah tekanan menuju kolom menggunkan alat peyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat
(Gandjar, 2007). Sampel yang masuk kedalam kolom akan didorong oleh fase gerak sehingga
zat-zat yang terkandung dalam sampel akan dianalisis dan bereaksi dengan fase diam. Pada
kolom fase terbalik (C18) proses elusi dari senyawa yang bersifat non polar berjalan dengan
lambat sedangkan senyawa yang bersifat polar lebih cepat terelusi oleh fase gerak dan keluar dari
fase diam C18. Senyawa yang keluar dari kolom akan menuju detektor, lalu oleh detektor
senyawa ini akan dibaca dan dihasilkan keluaran berupa kromatogram dan waktu retensi.
Menurut Gandjar (2007) waktu retensi adalah waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk
bergerak melalui kolom menuju detektor.Adapun waktu retensi dari senyawa asam klorogenat
adalah 1 menit 34 detik.
Pada proses elusi menggunakan metode kromatografi cair yang menggunakan kolom fase
terbalik yaitu fase ikat C18 lebih sesuai untuk senyawa yang bersifat polar. Pada penelitian ini
fase gerak yang digunakan adalah asetonitril dalam air 40% (larutan A) dan metanol 60%
(larutan B) dengan laju alir 0,6 ml/min. Analit terpisah dengan baik dengan waktu retensi 1
menit 34 detik dengan volume injeksi 10 m dan ketinggian peak 2 x 8 cps. Hal ini berbeda
dengan penelitian yang dilakukan oleh Tanaka (2005) yang melakukan analisis asam klorogenat
menggunakan HPLC, dimana fase gerak yang digunakan adalah air dalam asam format 30%
(larutan A) dan metanol 70% (larutan B) dengan laju alir 0,4 ml/min. Analit terpisah dengan baik
pada waktu retensi 5 menit dengan volume injeksi 10 m dan ketinggian peak 2 x 7 cps.
Sehingga dapat diketahui bahwa jenis fase gerak yang digunakan berpengaruh terhadap
kecepatan pemisahan senyawa, dimana senyawa asam klorogenat terpisah dengan baik pada
kolom C18 yang menggunakan fase gerak asetonitril dalam air 40% (larutan A) dan metanol 60%
(larutan B). Hal ini dibuktikan dengan waktu yang relatif lebih singkat dan intensitas peak yang
tinggi.
Setelah sampel dianalisis menggunakan kromatografi cair (LC), sampel tersebut
selanjutnya akan dianalisis lagi menggunakan spektroskopi massa (MS). Spektroskopi massa
(MS) adalah teknik analisis yang mengukur perbandingan massa dengan muatan. Spektroskopi
massa digunakan untuk menentukan massa partikel, komposisi unsur dari suatu sampel atau
molekul serta untuk menuangkan struktur kimia dari molekul. Prinsip dari MS adalah
pengionisasian senyawa kimia menghasilkan molekul atau fragmen molekul dan mengukur rasio
massa/muatan.Spectrometer massa bekerja dengan molekul pengion yang kemudian akan
memilah dan mengidentifikasi ion menurut massa, sesuai rasio fragmentasi. Dua komponen
kunci dalam proses ini adalah sumber ion (ion source) yang akan menghasilkan ion dan analisis
massa (mass analyzer) yang menseleksi ion.Menurut Sparkman, Konsep MS yaitu untuk
membentuk ion-ion dari sampel, untuk memisahkan ion-ion berdasarkan rasio m/z dan untuk
mengukur kelimpahan ion.
Ketika sampel masuk ke dalam spectrometer massa, sampel tersebut akan mengalami
pemisahan ion molekul analit dari fase geraknya ini disebabkan saat eluent LC disemprotkan
bersamaan dengan gas nebulizer yang dipanaskan dalam bidang elektrostatik menyebabkan
menguapnya pelarut sehingga tetesan analit menyusut. Keadaan tersebut memaksa sumber ion
atau electrospray ionization (ESI) yang akan mengubah molekul sampel fase gas ini menjadi
partikel bermuatan atau membentuk ion-ion molekul. Ion-ion molekuler ini tidak stabil secara
energetika dan beberapa diantaranya akan terpecah menjadi bagian-bagian yang lebih kecil
(fragmentasi). Setelah itu partikel-partikel bermuatan ini akan masuk ke mass analyzer. Mass
analyzer akan memilih ion-ion berdasarkan massanya dengan menggunakan medan
elektromagnetik. Dengan berbagai proses, ion yang berbeda nilai-nilai m/z melewati mass
analyzer satu per satu untuk mencapai detektor. Detektor akan megukur nilai kuantitas dan
menyediakan data untuk menghitung kelimpahan masing-masing ion. Detektor menghitung
muatan yang terinduksi atau arus yang dihasilkan ketika ion dilewatkan atau mengenai suatu
permukaan. Dalam scanning instrument sinyal dihasilkan dalam detektor selama scanning,
dimana scanning massa dan menghitung ion sebagai m/z. Ketika ion menyerang detektor, ion-ion
tersebut diubah menjadi sinyal listrik yang pada gilirannya akan diubah menjadi respon digital
yang dapat disimpan oleh komputer. Respon digital ini berupa pola fragmentasi dan berat
molekul dari senyawa-senyawa yang terkandung dalam sampel. Berdasarkan hasil pola
fragmentasi dan berat molekul, dapat diidentifikasi bahwa ekstrak metanol biji kopi pinogu
mengandung senyawa asam klorogenat jenis dimethoxy cinnamoylquinic acid karena
menghasilkan puncak dasar 381 m/z dengan massa atom C18H22O9 dan puncak sekunder 367 m/z
yang terfragmentasi karena kehilangan massa atom CH2 dan dikonfirmasi pada puncak residu
176 m/z yang terfragmentasi dengan kehilangan massa atom C10H13O6 yang menegaskan bahwa
isomer adalah senyawa asam klogenat jenis asam dimethoxycinnamoylquinic acid hal ini
berkaitan dengan penelitian yang dilakukan oleh (Clifford, Marks, Knight, dan Kuhnert, 2006)
dan (Clifford et al, 2003). Fragmentasi eksperimen yang dilakukan menghasilkan puncak -
puncak 319, 335, 337, 349, 353, 363, 367, 381, 499, 513, 515, 529, 543, 557, 559 dan 573 m/z.
Identifikasi senyawa dengan metode LC-MS didasarkan pada berat molekul dari senyawa
itu sendiri. Berat molekul yang dihasilkan memberikan informasi yang sangat berharga tapi
pelengkap informasi struktural sering dibutuhkan. Dalam memperoleh informasi struktural, ion
analit terfragmentasi karena molekul bertabrakan dengan netral yang dikenal sebagai disosiasi
tabrakan induksi atau disosiasi tabrakan diaktifkan. Tegangan diberikan kepada ion-ion analit
untuk menambah energi agar mampu melakukan tabrakan sehingga menciptakan fragmentasi.
Fragmentasi terjadi pada ikatan non bonding, contohnya gugus eter, sp3, sp2, gugus hidrogen
dan gugus karboksil, dimana gugus karboksil akan terpisah dari senyawa inti dengan pecahan
terletak pada ikatan C-C disebelah ikatan C-O (Ginting, 2012).
Liquid chromatographymass spectrometry (LC-MS) menjadi alat yang paling disukai
karena merupakan teknik analisis yang kuat yang menggabungkan antara kromatografi cair
dengan spektrometer massa sebagai detektor spesifiknya (Agilent, 1998). Penggabungan
spektrofotometri massa dengan teknik kromatografi selalu diinginkan karena sifatnya yang
sensitif dan sangat spesifik dibandingkan dengan detektor kromatografi lainnya (Fenn dkk,
1989). Kromatografi cair (LC) memisahkan komponen-komponen sampel kemudian membawa
komponen tersebut ke spektrometer massa. Spektrometer massa (MS) menciptakan dan
mendeteksi ion-ion yang bermuatan. Data LC-MS dapat digunakan untuk memberikan informasi
tentang waktu retensi suatu senyawa, kadar suatu senyawa, berat massa, identifikasi komponen
sampel tertentu dan pola fragmentasi unutuk menentukan struktur dari suatu senyawa (Agilent,
2001).